Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Test transplantacji z wykorzystaniem rozcieńczeń granicznych jest złotym standardem w ocenie potencjału do samoodnowy w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. W niniejszej demonstracji do embrionów syngenicznych danio pręgowanych w stadium jednej komórki wstrzykuje się rag two MIC oraz RAG two GFP, aby stworzyć transgeniczne ryby, u których rozwinie się ostra białaczka limfoblastyczna komórek T z etykietą fluorescencyjną. W 60. dniu życia pierwotne komórki białaczkowe są izolowane z ryb danio pręgowanych, a następnie oczyszczane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).

Następnie komórki są przeszczepiane w rozcieńczeniu granicznym do jamy otrzewnej dorosłych rybek danio-pręgowanych, a następnie monitoruje się wzrost guza u ryb przez okres do 90 dni. Na koniec wykorzystuje się program statystyczny do analizy rozcieńczeń granicznych, aby określić częstotliwość występowania komórek propagujących białaczkę w pierwotnym guzie. Analiza przeszczepiania komórek w rozcieńczeniach granicznych pozwala badaczom na dokładną ocenę liczby komórek zdolnych do samoodnowy zawartych w całej masie guza.

To właśnie te komórki zdolne do samoodnowienia napędzają powstawanie nowotworu i są ostatecznie odpowiedzialne za nawroty choroby. Główną zaletą przeprowadzania testów transplantacji z ograniczonym rozcieńczeniem w modelu danio przebranym jest możliwość przeszczepienia wielu osobników w każdym eksperymencie, co przekłada się na większą precyzję przy określaniu częstości występowania nowotworowych komórek zdolnych do samoodnowienia. Metoda ta dostarcza wiedzy na temat komórek propagujących nowotwór w ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek T.

Można go również zastosować do analizy innych modeli nowotworowych u danio-przewodnika. Jessica Blackburn, stypendystka w laboratorium, oraz Sally Liu, utalentowana technik, zaprezentują dziś tę procedurę. Aby zlinearyzować konstrukty Rag2 CM i RAG2-GFP-DNA, należy poddać 10 µg każdego plazmidu trawieniu enzymem restrykcyjnym NotI w temperaturze 37 °C przez noc. Po ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i precypitacji etanolem, każdy plazmid zawiesza się w 20 µl wody.

Wyznacz stężenia DNA na 1% żelu agarozowym, przeprowadzając rozcieńczenia każdego trawionego plazmidu w stosunkach 1:1, 1:5 i 1:10 wraz z 20 µL, 10 µL i 5 µL markeru DNA o szerokim zakresie. Następnie rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 60 ng/µL w celu wstrzyknięcia do szczepu CG1 syngen. Do embrionów ryb zebrafish wstrzyknij 250 nL rag2 CM o stężeniu 30 ng/µL oraz 30 ng/µL.

Wprowadź dwa GFP do zarodków zebrafish w stadium jednej komórki, starannie celując DNA bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28.5 °C i usuń martwe zarodki po 24 h. W piątym dniu życia przenieś zwierzęta do dużych zbiorników, około 28 dni po wstrzyknięciu. Znieczul larwy zebrafish, dodając 200 µL trica S o stężeniu 4 ng/mL do 25 mL wody systemowej dla ryb w szalce Petriego.

Zbadaj larwy pod kątem rozwoju fluorescencyjnie znakowanego TALL, używając mikroskopu epifluorescencyjnego do wykrycia fluorescencji GFP. Oddziel larwy z dodatnim wynikiem w kierunku nowotworu od tych z wynikiem ujemnym, aby upewnić się, że żadne ryby z białaczką nie zostaną pominięte w analizie. Larwy ujemne można zbadać w późniejszym czasie, gdy guzy mogą ulec powiększeniu. Monitoruj fluorescencyjnie znakowane ryby z białaczką co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, aby śledzić wzrost nowotworu.

Gdy komórki białaczki GFP-dodatnie zajmą ponad 50% organizmu zwierzęcia, dodaj jeden mililitr Tricaina S o stężeniu czterech nanogramów na mililitr do szalki Petriego zawierającej dziewięć mililitrów wody z systemu hodowli ryb w celu uśmiercenia ryby. Umieść rybę w nowej szalce Petriego zawierającej jeden mililitr 5% płodowej surowicy bydlęcej w 0.9 X PBS. Rozdrobnij rybę za pomocą żyletki, a następnie pipetuj mieszaninę, aby rozbić duże skupiska komórek. Następnie przefiltruj komórki przez sito o oczkach 40 µm do probówki o pojemności 50 ml.

Przenieś 500 µL komórek pipetą do polistyrenowej probówki o pojemności 4 mL. Dodaj 1 µL jodku propidyny o stężeniu 1 mg/mL w celu znakowania martwych komórek, wymieszaj na wortexie, a następnie utrzymuj komórki na lodzie. Przygotuj również rybę linii dzikiej CG1 w celu pobrania prawidłowych komórek krwi, które posłużą jako nośnik dla komórek nowotworowych podczas przeszczepu, dodając 4 mL 5% FPS w 0,9× PBS do probówki 50 mL, aby uzyskać objętość całkowitą 5 mL.

Odliczyć prawidłowe komórki krwi i rozcieńczyć je do stężenia 3 × 10⁵ komórek/ml w 5% FBS w 0,9x PBS, a następnie pipetować 100 µl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przy użyciu sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) wyizolować komórki nowotworowe GFP-dodatnie i PI-ujemne do płytki 96-dołkowej zawierającej komórki krwi w określonych dawkach. Dodatkowo wyizolować 10 000 komórek do dołka bez prawidłowych komórek krwi i poddać ponownej analizie za pomocą FACS w celu oceny czystości i żywotności wyizolowanych komórek. Wirować płytkę 96-dołkową z prędkością 2000 ×g przez 10 minut, aby uzyskać osad komórkowy.

Odssać 95 µL supernatantu i resuspenderować komórki w pozostałych pięciu µL. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej dorosłych syngenicznych rybek danio pręgowanych w wieku powyżej 60 dni, używając mikroszystrzykowej igły o rozmiarze 26,5 G. Rybek danio nie trzeba znieczulać przed transplantacją.

Przeszczepiono 10 komórek białaczki 45 rybom, 100 komórek 20 rybom, 1000 komórek siedmiu rybom oraz 10 000 komórek TALL pięciu rybom. Około 28 dni po transplantacji zbadano ryby odbiorcze (danio pręgowany) za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, stosując filtr z długością fali wzbudzenia 485 20 i emisją 530 25, aby wykryć fluorescencję GFP.

Zapisz liczbę ryb dodatnich w stosunku do całkowitej liczby ryb, którym wykonano wstrzyknięcie. Ponownie badaj ryby co 14 dni aż do 90. dnia i zapisuj liczbę ryb dodatnich. W przypadku zwiększenia liczby ryb z dodatnim wynikiem w kierunku nowotworu.

Uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie trikloretanu, wprowadź wyniki do tabeli i prześlij dane do internetowego oprogramowania do analizy ekstremalnego rozcieńczenia ograniczającego, aby określić częstotliwość samoodnawiających się komórek białaczki w pierwotnym szczepie TALL CG one. Zarodki wstrzyknięto RAG two cmic, a larwy RAG two GFP przesiewano pod kątem pierwotnej TALL. Po 28 dniach, zgodnie z poprzednimi badaniami, około 5% wstrzykniętych ryb posiada w grasicy limfocyty T dodatnie pod kątem GFP, a 100% tych ryb rozwinie białaczkę. W niniejszym badaniu fluorescencyjnie znakowane komórki TALL wyizolowano za pomocą sortowania z 65-dniowych chorych zwierząt i wykorzystano w teście transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym. W pierwszej kolejności wyznaczono bramkę w celu selekcji pojedynczych komórek.

Następnie wyselekcjonowano komórki negatywne pod względem jodeczku propidium. Na koniec wyznaczono bramkę, aby do sortowania wybrać wyłącznie komórki białaczki dodatnie pod względem GFP. W tym przykładzie ryb z przeszczepioną TALL w 28. dniu zaobserwowano guzy we wczesnym stadium jako obszary komórek dodatnich pod względem GFP w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.

Choć niektóre TLS były w bardziej zaawansowanym stadium i w ramach tych eksperymentów rozrosły się, wypełniając jamę otrzewną, przeszczepiono ponad 220 zwierząt, co jedna osoba może łatwo wykonać w ciągu kilku godzin. Analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania elda wykazała, że średnio jedna na 135 wszystkich komórek T była samoodnawiającymi się komórkami propagującymi białaczkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeszczepiać komórki nowotworowe w rozcieńczeniu ograniczającym do jamy otrzewnej syngenicznych danio pręgowanych oraz jak wykorzystać uzyskane dane do wyznaczenia częstotliwości występowania komórek propagujących nowotwór w danym guzie.

Dalsze badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych zwierząt mogą pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów sterujących odnową tych komórek propagujących nowotwór.