Name: Ilościowe określanie częstości komórek rozmnażających się w nowotworach przy użyciu przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem u syngenicznych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem do badania częstości komórek rozmnażających się w białaczce u Danio rerio. Ta technika pozwala ilościowo określić potencjał samoodnawiania komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez granty NIH 5T32CA09216-26 (dla J.S.B.) oraz K01 AR055619-01A1 i 3 K01 AR055619-03S1 (dla D.M.L.), a także przez Alex's Lemonade Stand Foundation, Harvard Stem Cell Institute oraz American Cancer Society.

1. Mikroiniekcja DNA do zarodków rybki zebrafish
<ol>
<li>Zlinearyzuj konstrukty DNA rag2::cMyc oraz rag2::GFP1, trawiąc 10μg każdego plazmidu enzymem NotI w temperaturze 37°C przez noc.</li>
<li>Wykonaj ekstrakcję fenolowo-chloroformową i wytrącenie plazmidów, a następnie zawieś każdy z nich w 20μL H2O.</li> 
<li>Wyznacz stężenie DNA, przeprowadzając elektroforezę rozcieńczeń 1:1, 1:5 i 1:10 każdego trawionego plazmidu na 1% żelu agarozy wraz z 20μL, 10μL i 5μL markera DNA o szerokim zakresie. Ten rodzaj kwantyfikacji jest zazwyczaj dokładniejszy niż odczyt spektrometryczny.</li>
<li>Rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 60ng/μL w 1M KCl+0.5X TE w celu wstrzyknięcia do zarodków ryb zebrafish szczepu CG1 (lub innego szczepu syngenicznego), stosując mieszaninę 30ng/μL rag2::cMyc + 30ng/μL rag2::GFP.</li>
<li>Iniekcje należy przeprowadzić zgodnie z wcześniej opisaną metodą12, 13. W skrócie: samice i samce zebrafish umieszcza się w komorach do rozrodu wieczorem w dniu poprzedzającym iniekcję. W dniu iniekcji DNA ładuje się do igły, a następnie reguluje ciśnienie tak, aby wypchnąć pęcherzyk o średnicy 50μm (30pg DNA), co mierzy się za pomocą mikrometru przedmiotowego. Następnie wstrzykuje się DNA do zarodków w stadium jednego komórki, bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przeżywalność wstrzykniętych zarodków i larw CG1 jest zazwyczaj niska i tylko 5% ryb pomyślnie włączy transgen; w związku z tym należy wstrzyknąć &gt;60 zarodków, aby zapewnić, że u niektórych ryb rozwinie się białaczka.</li> 
<li>Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5°C i usuń martwe zarodki po 24h. Następnie, w 5. dniu życia, zwierzęta przenosi się do dużych zbiorników i hoduje zgodnie z wcześniejszym opisem14.</li>
</ol>
2. Przesiewanie w kierunku pierwotnej T-ALL u larw rybek zebrafish
<ol>
	<li>Około 28 dni po iniekcji znieczulić larwy zebrafish, dodając 20μL Tricane-S w stężeniu 4ng/m do 25mL wody systemowej dla ryb w szalce Petriego.</li>
	<li>Zbadać larwy pod kątem rozwoju znakowanej fluorescencyjnie białaczki T-ALL za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 20X, stosując długość fali wzbudzenia 485/20 oraz filtr emisyjny 530/25 w celu wykrycia fluorescencji GFP (Rysunek 1).</li> 
	<li>Oddzielić larwy z dodatnim wynikiem w kierunku obecności guza od tych z wynikiem ujemnym. Larwy ujemne można zbadać w późniejszym terminie, gdy guzy mogłyby urosnąć do większych rozmiarów, aby upewnić się, że nie pominięto żadnych ryb z dodatnim wynikiem T-ALL.</li>
	<li>Monitorować ryby z dodatnim wynikiem T-ALL co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w celu śledzenia wzrostu guza.</li>
</ol>
3. Izolacja i oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanych pierwotnych komórek białaczki
<ol>
<li>Gdy komórki białaczki wykazujące ekspresję GFP zajmą &gt;50% organizmu zwierzęcia, uśmierć rybę, dodając 1mL 4ng/mL Tricane-S do szalki Petriego zawierającej 9mL wody z systemu hodowli ryb.</li>
<li>Przenieś rybę do nowej szalki Petriego zawierającej 1mL 0,9X PBS z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu buforowania komórek. Rozdrobnij rybę za pomocą żyletki, pipetuj mieszaninę, aby rozbić duże skupiska komórek, a następnie przefiltruj komórki przez sito o oczkach 40μm do probówki 50mL. Nie jest konieczne rozbijanie wszystkich grudek tkanki do pojedynczych komórek.</li>
<li>Przenieś 50μL zawiesiny komórkowej do polistyrenowej probówki 4mL. Dodaj 1μL 1mg/mL jodku propidyny (PI), który znakuje martwe komórki. Wymieszaj na wortexie, a następnie przechowuj komórki w lodzie.</li>
<li>Uśmierć rybę linii CG1 typu dzikiego, rozdrobnij i przefiltruj w ten sam sposób co powyżej, aby zebrać prawidłowe komórki, które posłużą jako nośnik dla komórek nowotworowych podczas transplantacji. Dodaj 4mL 5% FBS w 0,9X PBS do probówki 50mL, aby uzyskać całkowitą objętość 5mL.</li>
<li>Policz prawidłowe komórki, rozcieńcz je do stężenia 3x105 komórek/mL w 5% FBS w 0,9X PBS, a następnie nanieś po 10μL na studzienkę płytki 96-dołkowej.</li>
<li>Za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) odseparuj GFP-dodatnie i PI-ujemne komórki nowotworowe (Rysunek 2A,B) do płytki 96-dołkowej zawierającej komórki krwi w następujących dawkach: 10 komórek/studzienkę do 48 studni, 100 komórek/studzienkę do 24 studni, 10 komórek/studzienkę do 12 studni oraz 10 0 komórek/studzienkę do 6 studni. Dodatkowo, 10 0 komórek należy odseparować do studzienki bez prawidłowych komórek krwi i poddać ponownej analizie za pomocą FACS, aby ocenić czystość i żywotność posortowanych komórek (Rysunek 2C).</li>
</ol>
4. Przeszczepianie metodą rozcieńczeń ograniczających do dorosłych danio pręgowanych
<ol>
<li>Odwirować komórki, centrifugując płytkę 96-dołkową przy 200xg przez 10 minut.</li>
<li>Usunąć 95μL supernatantu i resuspenderć komórki w pozostałych 5μL.</li> 
<li>Utrzymać dorosłego (&gt;60 dni) syngenicznego danio pręgowanego brzuchem do góry i wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej, używając mikrostrzykawki 26G/2”. Ryby danio nie muszą być znieczulone przed transplantacją. Zazwyczaj 45 ryb otrzymuje transplantację 10 komórek białaczki, 20 ryb otrzymuje 10 komórek, 7 ryb otrzymuje 10 komórek, a 5 ryb otrzymuje 10 0 komórek T-ALL.</li> 
</ol>
5. Analiza w celu wyznaczenia częstotliwości występowania komórek inicjujących białaczkę
<ol>
	<li>Około 28 dni po transplantacji obejrzyj przetransplantowane ryby pod mikroskopem epifluorescencyjnym, stosując długość fali wzbudzenia 485/20 i filtr emisji 530/25 w celu wykrycia fluorescencji GFP. Zapisz liczbę ryb pozytywnych w stosunku do całkowitej liczby ryb poddanych wstrzyknięciu.</li> 
	<li>Ponownie badaj ryby co 14 dni przez maksymalnie 90 dni i zapisuj liczbę ryb pozytywnych. Gdy ryba z potwierdzonym nowotworem stanie się półmartwa, uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie Tricane-S.</li> 
	<li>Wprowadź wyniki do tabeli, zgodnie z Rysunkiem 3D. Prześlij dane do internetowego oprogramowania statystycznego ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) pod adresem <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a>15, które wykorzystuje częstotliwość występowania zwierząt pozytywnych i negatywnych pod kątem nowotworu przy każdej dawce transplantacji, aby określić częstotliwość samoodnawiających się komórek białaczki w pierwotnej T-ALL.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Mikroiniekcja DNA do zarodków ryb syngenicznych często skutkuje niskim wskaźnikiem przeżywalności iniekcyjnych zarodków, przy czym &lt;60% zarodków przeżyło przez 24 godziny. Dodatkowo, przeżywalność wstrzykniętych syngeneicznych ryb w okresie rozwoju larwalnego jest zazwyczaj niska, przy czym często &lt;20% przeżywalności przez 28 dni. Dlatego ważne jest wstrzyknięcie dużej liczby embrionów, aby stworzyć ryby transgeniczne, u których rozwinie się T-ALL.
W ramach przykładu embriony szczepu CG1 zostały wstrzyknięte z rag2::cMyc+rag2::GFP. Transgeny współsegregują w rozwijającym się embrionie, w taki sposób, że każda komórka wykazująca ekspresję GFP będzie również wykaziwać ekspresję cMyc. Larwy przesiewano w celu wykrycia pierwotnej T-ALL po 28 dniach (Rysunek 1). Wcześniejsze prace wykazały, że około 5% wstrzykniętych ryb będzie posiadać limfocyty T dodatnie pod kątem GFP w grasicy (Rysunek 1), a 10% tych ryb rozwinie białaczkę w miarę transformacji limfocytów T11. Chociaż niewielka część danio pręgowanych może wykazywać bardziej zaawansowaną białaczkę, którą bardzo łatwo wykryć w 28. dniu, większość będzie posiadać jedynie GFP-dodatnią grasicę (Rysunek 1), dlatego larwy należy badać indywidualnie przy dużym powiększeniu, aby upewnić się, że wyselekcjonowano wszystkie dodatnie ryby. GFP-dodatnie komórki T-ALL zajmą &gt;50% organizmu między 45. a 70. dniem. 
W przedstawionym przykładzie rybki daniozgoń zostały uśmiercone w 65. dniu życia, a komórki białaczki wyizolowano i poddano sortowaniu FACS w celu przeprowadzenia transplantacji z ograniczonym rozcieńczeniem. Pojedyncze komórki wykazujące negatywny wynik dla jodku propidyny i pozytywny dla GFP (Ryc. 2) zostały posortowane do płytki 96-dołkowej. Przeprowadzono ponowną analizę 10 0 posortowanych komórek w celu oceny żywotności (optymalnie &gt;95%) i czystości (optymalnie &gt;92%, Ryc. 2). Przeszczepione T-ALL zazwyczaj pojawiają się przed 28. dniem, jednak niektóre guzy mogą rozwijać się ponad 60 dni. W tym przykładzie w 28. dniu zaobserwowano guzy we wczesnym stadium jako obszary komórek GFP-dodatnich w pobliżu miejsca iniekcji (Ryc. 3B), podczas gdy niektóre T-ALL były w bardziej zaawansowanym stadium, rozprzestrzeniając się na całą jamę otrzewną (Ryc. 3C). Dane z testów transplantacji komórek z ograniczonym rozcieńczeniem dla trzech różnych pierwotnych T-ALL przedstawiono na Ryc. 3D. W tych eksperymentach dokonano transplantacji ponad 20 zwierząt, co może być łatwo wykonane przez jedną osobę w ciągu kilku godzin. Analiza danych z użyciem oprogramowania ELDA wykazała, że średnio 1 na 135 komórek T-ALL była samoodnawiającą się komórką propagującą białaczkę (Ryc. 3E).
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna danio pręgowanego wykazująca ekspresję genów; znakowanie białkiem fluorescencyjnym GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Larwy danio przebrzuchałego wstrzyknięte na etapie jednego komórki za pomocą rag::-cMyc+rag::-eGFP poddano badaniu przesiewowemu pod kątem pierwotnego wzrostu białaczki 28 dni po wstrzyknięciu. Ryba (*) wykazywała obecność limfocytów T GFP-dodatnich w grasicy; u tej ryby rozwinie się T-ALL w miarę sukcesywnej transformacji limfocytów T. Etap ten jest bardzo powszechny w 28. dniu. U jednej ryby (**) stwierdzono zaawansowaną T-ALL, która rozprzestrzeniła się do tkanek miękkich. Pozostałe dwie ryby były negatywne pod kątem wzrostu guza. Zdjęcie wykonano przy 16-krotnym powiększeniu.
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej; sortowanie pojedynczych komórek; ekspresja GFP; wyniki analizy żywotności komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Komórki T-ALL znakowane fluorescencyjnie zostały wyizolowane metodą sortowania z chorych zwierząt i wykorzystane w teście transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym. W pierwszej kolejności wyznaczono bramkę w celu wyselekcjonowania pojedynczych komórek (lewy górny panel), następnie wyselekcjonowano komórki negatywne pod względem barwienia jodkiem propidyny (lewy środkowy panel). Na koniec wyznaczono bramkę, aby do sortowania wyselekcjonować wyłącznie leukemiczne komórki GFP-dodatnie (lewy dolny panel). Posortowane komórki należy poddać ponownej analizie w celu oceny żywotności i czystości przed transplantacją (panele po prawej).
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Etapy wzrostu nowotworu u rybek zebrafish z danymi dotyczącymi transplantacji komórek; dołączono wykres przedziałów ufności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Rybek danio sprawdzono pod kątem wzrostu białaczki 28 dni po transplantacji. Ryby są albo wolne od nowotworu (A), albo mają niewielki guz rosnący w miejscu wstrzyknięcia (B), albo wykazują postępującą białaczkę (C). Obrazy wykonano przy powiększeniu 7X. Odnotowano całkowitą liczbę ryb z dodatnim wynikiem w kierunku białaczki w stosunku do całkowitej liczby ryb poddanych transplantacji dla każdego rozcieńczenia, jak przedstawiono w (D). Dane wprowadzono do internetowego programu ELDA w celu obliczenia liczby samoodnawiających się komórek białaczkowych oraz górnej i dolnej 95% granicy przedziału ufności (E).

<ol><li>Zhou, B. -B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-initiating+cells%3A+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li>
<li>Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+human+stem+cells+by+repopulation+of+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice.</a> Stem Cells. 15, 199-207 (1997).</li>
<li>Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+limiting+dilution+experiments+with+generalized+linear+models+results+in+a+test+of+the+single-hit+Poisson+assumption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption.</a> J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Taylor, A. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Tumor+Assays%3A+The+State+of+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation.</a> Zebrafish. 6, 339-346 (2009).</li>
<li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).</li>
<li>Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantable+Tumor+Lines+Generated+in+Clonal+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish.</a> Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).</li>
<li>Smith, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li>
<li>Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Growth+Need+Not+Be+Driven+by+Rare+Cancer+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells.</a> Science. 317, 337-337 (2007).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Increasing+Complexity+of+the+Cancer+Stem+Cell+Paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm.</a> Science. 324, 1670-1673 (2009).</li>
<li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).</li>
<li>Ignatius, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+identifies+that+myf5%2B+embryonal+rhabdomyosarcoma-propagating+cells+are+dynamically+reorganized+during+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Kluczową zaletą wykorzystania danio przebrzosionego w badaniach nad rakiem jest możliwość użycia dużej liczby zwierząt przy stosunkowo niskich kosztach. Jest to szczególnie istotne w testach transplantacji komórek z ograniczającym rozcieńczeniem, w których stosunek liczby zwierząt z przeszczepionymi komórkami, u których rozwinęły się guzy, do całkowitej liczby zwierząt z przeszczepem służy do wyznaczenia częstotliwości występowania komórek inicjujących nowotwór. W przedstawionej tutaj metodzie w każdym teście wykorzystuje się ponad 70 zwierząt biorców, co pozwala na dokładną ocenę liczby komórek propagujących nowotwór. Zarówno liczba wykorzystanych zwierząt, jak i dawki przeszczepianych komórek nowotworowych powinny zostać zoptymalizowane dla danego modelu raka; na przykład, jeśli wstępne eksperymenty wykażą, że komórki inicjujące nowotwór są rzadkie, przydatne dawki transplantacyjne mogą wynosić 100 000, 50 000, 10 000 i 1 000 komórek na jeden przeszczep.
Syngeniczne szczepy rybek danioy są użyteczne w analizie rozcieńczeń ograniczających. Jednak szczepy te nie są jeszcze powszechnie stosowane we wszystkich laboratoriach, a niektóre modele nowotworowe u danioy istnieją wyłącznie u ryb allogenicznych. Transplantacje komórek w analizie rozcieńczeń ograniczających można przeprowadzać u szczepów typu dzikiego po ablacji układu odpornościowego, choć częstotliwość komórek zdolnych do samoodnowy może zostać obliczona jako 10–100 razy wyższa niż w przypadku użycia syngenicznych rybek danioy8. Należy zauważyć, że w przypadku transplantacji do naświetlanych biorców niedopasowanych immunologicznie należy zastosować większe dawki komórek, ponieważ część komórek nowotworowych nie przeżyje transplantacji do obcego mikrośrodowiska. Ponadto wiele nowotworów zacznie regresować po 21 dniach, gdy układ odpornościowy zwierzęcia biorcy powróci do normy, dlatego zwierzęta należy badać pod kątem wzrostu guza co 7 dni po transplantacji.
Metody przedstawione w niniejszym opracowaniu nadają się do zastosowania w dowolnym modelu raka u rybek zebrafish i do tej pory były wykorzystywane do określania częstotliwości występowania komórek inicjujących guz zarówno w ostrej białaczkowatości limfoblastycznej komórek T8, jak i w modelu guza litego – rabdomyosarcoma16. Guzy te zostały oznakowane fluorescencyjnie poprzez kooperacyjne wstrzyknięcie do embrionów zarówno onkogenu, jak i markera fluorescencyjnego; ponieważ DNA segreguje się wspólnie, każda komórka wykazująca ekspresję onkogenu będzie również wykazywać ekspresję białka fluorescencyjnego17. Choć zaleca się stosowanie fluorescencji, ponieważ ułatwia ona śledzenie wzrostu guza bez konieczności uśmiercania zwierzęcia i zapewnia prosty sposób izolacji komórek nowotworowych za pomocą FACS, możliwe jest również znakowanie komórek guza przeciwciałami przeciwko markerom specyficznym dla nowotworu w celu ułatwienia ich oczyszczania, przy czym barwienie przeciwciałami u rybek zebrafish może wymagać optymalizacji.
Wreszcie, po określeniu częstości występowania komórek propagujących guz dla danego typu nowotworu, możliwe jest wykorzystanie tych testów do zidentyfikowania mechanizmów regulujących ich częstotliwość komórkową. Na przykład pierwotne komórki nowotworowe można traktować inhibitorami specyficznymi dla danej ścieżki przed transplantacją z rozcieńczeniem ograniczającym, lub można podawać leki samym transplantowanym rybom. Dodatkowo można manipulować genetyką samych guzów, wstrzykując rybie w stadium jednej komórki interesujący gen, tak aby powstałe guzy pierwotne nadmiernie go ekspresowały. W takich eksperymentach każdy wpływ na częstotliwość komórek samoodnawiających się zostanie zaobserwowany w testach z rozcieńczeniem ograniczającym.

<table><tbody><tr><td>enzym restrykcyjny NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform</td><td>EMD Millipore</td><td>6805-OP</td><td></td></tr><tr><td>5M KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>100X Tris-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>marker DNA o szerokim zakresie (High Range DNA ladder)</td><td>Fermentas</td><td>R0621</td><td></td></tr><tr><td>Syngeneiczne danio pręgowane</td><td></td><td>Bibliografia&lt;sup&gt;6-8&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka 26G/2&quot;</td><td>Hamilton Co</td><td>80366</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek z siatką 40&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Samoodnawiające się komórki nowotworowe są jedynym typem komórek w obrębie guza, które posiadają nieograniczoną zdolność do promowania wzrostu nowotworu, dlatego są znane jako komórki propagujące nowotwór lub komórki inicjujące nowotwór. Przypuszcza się, że ukierunkowanie destrukcji na te samoodnawiające się komórki zablokuje progresję nowotworu i powstrzyma nawroty, znacząco poprawiając rokowania pacjentów1. Najczęstszym sposobem określenia częstości występowania komórek samoodnawiających się w obrębie guza jest test transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym, w którym komórki nowotworowe są przeszczepiane zwierzętom biorcom w rosnących dawkach; proporcja zwierząt, u których rozwinął się nowotwór, jest wykorzystywana do obliczenia liczby komórek samoodnawiających się w pierwotnej próbce guza2, 3. Idealnie, w każdym eksperymencie z rozcieńczeniem ograniczającym należałoby wykorzystać dużą liczbę zwierząt, aby dokładnie określić częstość występowania komórek propagujących nowotwór. Jednakże wielkoskalowe eksperymenty z udziałem myszy są kosztowne, a większość testów z rozcieńczeniem ograniczającym wykorzystuje jedynie 10-15 myszy na eksperyment.
Ryby z gatunku zebrafish zyskały znaczenie jako model raka, w dużej mierze dzięki łatwości manipulacji genetycznych oraz ekonomicznym kosztom przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę. Dodatkowo stwierdzono, że rodzaje nowotworów modelowane u zebrafish ściśle naśladują odpowiadające im schorzenia u ludzi4. Chociaż możliwe jest przeszczepienie komórek nowotworowych z jednej ryby do drugiej poprzez poddawanie zwierząt biorców subletalnemu napromieniowaniu, regeneracja układu odpornościowego po 21 dniach często powoduje regresję guza5. Niedawne stworzenie syngenicznych linii zebrafish znacznie ułatwiło badania nad transplantacją nowotworów 6-8. Ponieważ zwierzęta te są genetycznie identyczne, przeszczepione komórki nowotworowe silnie przyjmują się w organizmach ryb biorców, a wzrost guza może być monitorowany przez długi czas. Syngeniczne zebrafish są idealne do testów transplantacyjnych z rozcieńczeniami ograniczającymi, ponieważ komórki nowotworowe nie muszą adaptować się do wzrostu w obcym mikrośrodowisku, co mogłoby prowadzić do niedoszacowania częstotliwości występowania komórek samoodnawiających się9, 10. Dodatkowo, u syngenicznych zebrafish z sukcesem przeprowadzono przeszczepy pojedynczych komórek8, a jednocześnie można w sposób łatwy i ekonomiczny przeszczepić materiał kilkuset zwierzętom, co w obu przypadkach pozwala na uzyskanie dokładniejszej oceny częstotliwości występowania komórek samoodnawiających się.
W niniejszej pracy przedstawiono metodę tworzenia pierwotnych, znakowanych fluorescencyjnie komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T (T-ALL) u syngeneicznych rybek danio prążkowanych oraz transplantacji tych guzów w rozcieńczeniu ograniczającym do dorosłych ryb w celu określenia częstotliwości komórek samoodnawiających się. Choć jako przykład posłużyła białaczka, protokół ten jest odpowiedni do określania częstotliwości komórek propagujących guz z wykorzystaniem dowolnego modelu nowotworowego u rybek danio prążkowanych.

Testy transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym są stosowane do określania częstości występowania komórek propagujących nowotwór. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania syngeneicznych rybek zebrafish, u których rozwija się białaczka z oznakowaniem fluorescencyjnym, oraz szczegółowo wyjaśnia, jak izolować i transplantować te komórki białaczkowe z rozcieńczeniem ograniczającym do jamy otrzewnej dorosłych rybek zebrafish.

Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Samoodnawiające się komórki nowotworowe są jedynym typem komórek w obrębie guza, które posiadają nieograniczoną zdolność do stymulowania wzrostu nowotworu, i są one zatem znane jako ...

Test transplantacji z wykorzystaniem rozcieńczeń granicznych jest złotym standardem w ocenie potencjału do samoodnowy w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. W niniejszej demonstracji do embrionów syngenicznych danio pręgowanych w stadium jednej komórki wstrzykuje się rag two MIC oraz RAG two GFP, aby stworzyć transgeniczne ryby, u których rozwinie się ostra białaczka limfoblastyczna komórek T z etykietą fluorescencyjną. W 60. dniu życia pierwotne komórki białaczkowe są izolowane z ryb danio pręgowanych, a następnie oczyszczane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).Następnie komórki są przeszczepiane w rozcieńczeniu granicznym do jamy otrzewnej dorosłych rybek danio-pręgowanych, a następnie monitoruje się wzrost guza u ryb przez okres do 90 dni. Na koniec wykorzystuje się program statystyczny do analizy rozcieńczeń granicznych, aby określić częstotliwość występowania komórek propagujących białaczkę w pierwotnym guzie. Analiza przeszczepiania komórek w rozcieńczeniach granicznych pozwala badaczom na dokładną ocenę liczby komórek zdolnych do samoodnowy zawartych w całej masie guza.To właśnie te komórki zdolne do samoodnowienia napędzają powstawanie nowotworu i są ostatecznie odpowiedzialne za nawroty choroby. Główną zaletą przeprowadzania testów transplantacji z ograniczonym rozcieńczeniem w modelu danio przebranym jest możliwość przeszczepienia wielu osobników w każdym eksperymencie, co przekłada się na większą precyzję przy określaniu częstości występowania nowotworowych komórek zdolnych do samoodnowienia. Metoda ta dostarcza wiedzy na temat komórek propagujących nowotwór w ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek T.Można go również zastosować do analizy innych modeli nowotworowych u danio-przewodnika. Jessica Blackburn, stypendystka w laboratorium, oraz Sally Liu, utalentowana technik, zaprezentują dziś tę procedurę. Aby zlinearyzować konstrukty Rag2 CM i RAG2-GFP-DNA, należy poddać 10 µg każdego plazmidu trawieniu enzymem restrykcyjnym NotI w temperaturze 37 °C przez noc. Po ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i precypitacji etanolem, każdy plazmid zawiesza się w 20 µl wody.Wyznacz stężenia DNA na 1% żelu agarozowym, przeprowadzając rozcieńczenia każdego trawionego plazmidu w stosunkach 1:1, 1:5 i 1:10 wraz z 20 µL, 10 µL i 5 µL markeru DNA o szerokim zakresie. Następnie rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 60 ng/µL w celu wstrzyknięcia do szczepu CG1 syngen. Do embrionów ryb zebrafish wstrzyknij 250 nL rag2 CM o stężeniu 30 ng/µL oraz 30 ng/µL.Wprowadź dwa GFP do zarodków zebrafish w stadium jednej komórki, starannie celując DNA bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28.5 °C i usuń martwe zarodki po 24 h. W piątym dniu życia przenieś zwierzęta do dużych zbiorników, około 28 dni po wstrzyknięciu. Znieczul larwy zebrafish, dodając 200 µL trica S o stężeniu 4 ng/mL do 25 mL wody systemowej dla ryb w szalce Petriego.Zbadaj larwy pod kątem rozwoju fluorescencyjnie znakowanego TALL, używając mikroskopu epifluorescencyjnego do wykrycia fluorescencji GFP. Oddziel larwy z dodatnim wynikiem w kierunku nowotworu od tych z wynikiem ujemnym, aby upewnić się, że żadne ryby z białaczką nie zostaną pominięte w analizie. Larwy ujemne można zbadać w późniejszym czasie, gdy guzy mogą ulec powiększeniu. Monitoruj fluorescencyjnie znakowane ryby z białaczką co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, aby śledzić wzrost nowotworu.Gdy komórki białaczki GFP-dodatnie zajmą ponad 50% organizmu zwierzęcia, dodaj jeden mililitr Tricaina S o stężeniu czterech nanogramów na mililitr do szalki Petriego zawierającej dziewięć mililitrów wody z systemu hodowli ryb w celu uśmiercenia ryby. Umieść rybę w nowej szalce Petriego zawierającej jeden mililitr 5% płodowej surowicy bydlęcej w 0.9 X PBS. Rozdrobnij rybę za pomocą żyletki, a następnie pipetuj mieszaninę, aby rozbić duże skupiska komórek. Następnie przefiltruj komórki przez sito o oczkach 40 µm do probówki o pojemności 50 ml.Przenieś 500 µL komórek pipetą do polistyrenowej probówki o pojemności 4 mL. Dodaj 1 µL jodku propidyny o stężeniu 1 mg/mL w celu znakowania martwych komórek, wymieszaj na wortexie, a następnie utrzymuj komórki na lodzie. Przygotuj również rybę linii dzikiej CG1 w celu pobrania prawidłowych komórek krwi, które posłużą jako nośnik dla komórek nowotworowych podczas przeszczepu, dodając 4 mL 5% FPS w 0,9× PBS do probówki 50 mL, aby uzyskać objętość całkowitą 5 mL.Odliczyć prawidłowe komórki krwi i rozcieńczyć je do stężenia 3 × 10⁵ komórek/ml w 5% FBS w 0,9x PBS, a następnie pipetować 100 µl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przy użyciu sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) wyizolować komórki nowotworowe GFP-dodatnie i PI-ujemne do płytki 96-dołkowej zawierającej komórki krwi w określonych dawkach. Dodatkowo wyizolować 10 000 komórek do dołka bez prawidłowych komórek krwi i poddać ponownej analizie za pomocą FACS w celu oceny czystości i żywotności wyizolowanych komórek. Wirować płytkę 96-dołkową z prędkością 2000 ×g przez 10 minut, aby uzyskać osad komórkowy.Odssać 95 µL supernatantu i resuspenderować komórki w pozostałych pięciu µL. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej dorosłych syngenicznych rybek danio pręgowanych w wieku powyżej 60 dni, używając mikroszystrzykowej igły o rozmiarze 26,5 G. Rybek danio nie trzeba znieczulać przed transplantacją.Przeszczepiono 10 komórek białaczki 45 rybom, 100 komórek 20 rybom, 1000 komórek siedmiu rybom oraz 10 000 komórek TALL pięciu rybom. Około 28 dni po transplantacji zbadano ryby odbiorcze (danio pręgowany) za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, stosując filtr z długością fali wzbudzenia 485 20 i emisją 530 25, aby wykryć fluorescencję GFP.Zapisz liczbę ryb dodatnich w stosunku do całkowitej liczby ryb, którym wykonano wstrzyknięcie. Ponownie badaj ryby co 14 dni aż do 90. dnia i zapisuj liczbę ryb dodatnich. W przypadku zwiększenia liczby ryb z dodatnim wynikiem w kierunku nowotworu.Uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie trikloretanu, wprowadź wyniki do tabeli i prześlij dane do internetowego oprogramowania do analizy ekstremalnego rozcieńczenia ograniczającego, aby określić częstotliwość samoodnawiających się komórek białaczki w pierwotnym szczepie TALL CG one. Zarodki wstrzyknięto RAG two cmic, a larwy RAG two GFP przesiewano pod kątem pierwotnej TALL. Po 28 dniach, zgodnie z poprzednimi badaniami, około 5% wstrzykniętych ryb posiada w grasicy limfocyty T dodatnie pod kątem GFP, a 100% tych ryb rozwinie białaczkę. W niniejszym badaniu fluorescencyjnie znakowane komórki TALL wyizolowano za pomocą sortowania z 65-dniowych chorych zwierząt i wykorzystano w teście transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym. W pierwszej kolejności wyznaczono bramkę w celu selekcji pojedynczych komórek.Następnie wyselekcjonowano komórki negatywne pod względem jodeczku propidium. Na koniec wyznaczono bramkę, aby do sortowania wybrać wyłącznie komórki białaczki dodatnie pod względem GFP. W tym przykładzie ryb z przeszczepioną TALL w 28. dniu zaobserwowano guzy we wczesnym stadium jako obszary komórek dodatnich pod względem GFP w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.Choć niektóre TLS były w bardziej zaawansowanym stadium i w ramach tych eksperymentów rozrosły się, wypełniając jamę otrzewną, przeszczepiono ponad 220 zwierząt, co jedna osoba może łatwo wykonać w ciągu kilku godzin. Analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania elda wykazała, że średnio jedna na 135 wszystkich komórek T była samoodnawiającymi się komórkami propagującymi białaczkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeszczepiać komórki nowotworowe w rozcieńczeniu ograniczającym do jamy otrzewnej syngenicznych danio pręgowanych oraz jak wykorzystać uzyskane dane do wyznaczenia częstotliwości występowania komórek propagujących nowotwór w danym guzie.Dalsze badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych zwierząt mogą pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów sterujących odnową tych komórek propagujących nowotwór.

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określanie częstości komórek propagujących guzy za pomocą transplantacji komórek o ograniczonym rozcieńczeniu u syngeneicznych ryb cebra

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem do badania częstości komórek rozmnażających się w białaczce u Danio rerio. Ta technika pozwala ilościowo określić potencjał samoodnawiania komórek nowotworowych.

Ilościowe określanie częstości komórek rozmnażających się w nowotworach przy użyciu przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem u syngenicznych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Przeglądaj więcej filmów