Ilościowe określanie częstości komórek rozmnażających się w nowotworach przy użyciu przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem u syngenicznych danio pręgowanych

Test przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem jest złotym standardem oceny potencjału samoodnawiania się w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. W tej demonstracji jednokomórkowym syngenicznym zarodkom danio pręgowanego wstrzykuje się dwa MIC i RAG dwa GFP w celu stworzenia transgenicznego danio pręgowanego, u którego rozwinie się znakowana fluorescencyjnie ostra białaczka limfoblastyczna z komórek T. Po 60 dniach życia pierwotne komórki białaczki są izolowane od danio pręgowanego, a następnie oczyszczane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Następnie komórki są przeszczepiane przy ograniczeniu rozcieńczenia do jamy otrzewnowej dorosłego danio pręgowanego, a ryby są monitorowane pod kątem wzrostu guza przez okres do 90 dni. Wreszcie, program statystyczny do analizy rozcieńczenia ekstremalnie ograniczającego służy do ilościowego określenia częstotliwości komórek rozmnażających białaczkę w pierwotnym guzie. Analiza przeszczepu komórek o ograniczonym rozcieńczeniu pozwala badaczom dokładnie ocenić liczbę samoodnawiających się komórek zawartych w większości masy guza.

To właśnie te samoodnawiające się komórki napędzają powstawanie raka i są ostatecznie odpowiedzialne za nawrót choroby. Główną zaletą wykonywania testów przeszczepu z ograniczeniem rozcieńczenia w modelu danio pręgowanego jest to, że w każdym eksperymencie można przeszczepić wiele ryb, co skutkuje lepszą precyzją przy określaniu częstotliwości samoodnawiających się komórek rozmnażających guz. Metoda ta zapewnia wgląd w komórki rozmnażające guz w limfocytach T, ostrej białaczce limfoblastycznej.

Można go również zastosować do zrozumienia innych modeli raka danio pręgowanego. Jessica Blackburn, pracownik laboratorium, i Sally Liu, utalentowana technik, zademonstrują Ci dzisiaj procedurę: Aby zlinearyzować Rag dwa CM i RAG, dwa konstrukty G-F-P-D-N-A trawią 10 mikrogramów każdego plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego, a nie jednego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po ekstrakcji chloroformu fenylowego i wytrąceniu etanolu zawieszamy każdy plazmid w 20 mikrolitrach wody.

Określ stężenia DNA na 1% agrożelu, przeprowadzając rozcieńczenie jeden do jednego, jeden do pięciu i od jednego do 10 każdego strawionego plazmidu za pomocą 20 mikrolitrów, 10 mikrolitrów i pięciu mikrolitrów drabiny DNA wysokiego zakresu. Teraz rozcieńczyć DNA do końcowego stężenia 60 nanogramów na mikrolitr do wstrzyknięcia do CG jeden szczep syngen. Zarodki danio pręgowanego wstrzykują 250 nanolitrów po 30 nanogramów na mikrolitr, dwa CM i 30 nanogramów na mikrolitr

Rozdrobnij dwa GFP do jednego stadium komórkowego zarodków danio pręgowanego, ostrożnie kierując DNA bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza i usuń martwe zarodki po 24 godzinach po pięciu dniach życia, przenieś zwierzęta do dużych zbiorników około 28 dni po wstrzyknięciu. Znieczulone larwy danio pręgowanego przez dodanie 200 mikrolitrów czterech nanogramów na mililitr trica S do 25 mililitrów wody w systemie rybnym na szalce Petriego.

Zbadaj larwy pod kątem rozwoju znakowanego fluorescencyjnie TALL za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w celu wykrycia fluorescencji GFP. Oddziel larwy dodatnie od tych, które są ujemne, aby upewnić się, że w analizie nie pominięto żadnej białaczki. Ujemne larwy można zbadać w późniejszym czasie, gdy guzy mogą się powiększyć Monitoruj fluorescencyjnie znakowane ryby białaczkowe co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi w celu śledzenia wzrostu guza.

Gdy komórki białaczki GFP przewyższą więcej niż 50% zwierzęcia, dodaj jeden mililitr czterech nanogramów na mililitr. Trica S na szalce Petriego zawierającej dziewięć mililitrów wody z systemu rybnego, aby złożyć rybę, umieścić rybę na nowej szalce Petriego zawierającej jeden mililitr 5% płodowej surowicy bydlęcej w 0,9 XPBS, macerować rybę żyletką, pipetować mieszaninę, aby zdysocjować duże grudki komórek. Następnie przepuść komórki przez sitko o siatce 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki.

Odpipetuj 500 mikrolitrów komórek do czteromililitrowej rurki polistyrenowej. Dodaj jeden mikrolitr jednego miligrama na mililitr, jodek perydium, aby oznaczyć wir martwych komórek, a następnie utrzymuj komórki na lodzie. Przygotuj również dziką rybę CG do zbierania normalnych komórek krwi, które służą jako nośnik komórek nowotworowych podczas przeszczepu w ilości czterech mililitrów 5% FPS w 0,9 X PB S do probówki 50 mililitrów, co daje całkowitą objętość pięciu mililitrów.

Policz normalne komórki krwi rozcieńczone trzy razy od 10 do piątych komórek na mililitr w 5% FBS w 0,9 x pbs, a następnie pipetuj 100 mikrolitrów na studzienkę 96-dołkowej płytki za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek, sortuj komórki nowotworowe GFP dodatnie PI ujemne do 96-dołkowej płytki zawierającej komórki krwi w określonych dawkach. Dodatkowo posortuj 10 000 komórek do studzienki bez normalnych komórek krwi i ponownie przeanalizuj, wykorzystując fakty, aby ocenić czystość i żywotność wirówki posortowanych komórek. Płytka 96-dołkowa w 2000 GS przez 10 minut w celu osadzenia komórek.

Usuń 95 mikrolitrów snat i ponownie zawieś komórki w pozostałych pięciu mikrolitrach. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej dorosłego syngenicznego danio pręgowanego w wieku powyżej 60 dni za pomocą mikrostrzykawki o rozmiarze 26 i pół mm. Danio pręgowany nie musi być znieczulony przed przeszczepem.

Przeszczep 45 ryb z 10 komórkami białaczkowymi, 20 ryb ze 100 komórkami, siedem ryb z 1000 komórek i pięć ryb z 10 000 komórek TALL około 28 dni po przeszczepie. Zbadano biorcę danio pręgowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi przy użyciu filtra o długości fali wzbudzenia 4 85 20 i filtra emisyjnego 5 30 25. Do wykrywania fluorescencji GFP.

Zapisać liczbę ryb z wynikiem dodatnim na łączną liczbę wstrzykniętych ryb. Ponownie badaj ryby co 14 dni przez maksymalnie 90 i zapisuj liczbę ryb z wynikiem dodatnim. Kiedy ryba z dodatnim guzem staje się bardziej obfita.

Uśmierc zwierzę przez przedawkowanie trica US, wprowadź wyniki do tabeli i prześlij dane do internetowego oprogramowania do analizy ekstremalnego rozcieńczenia ograniczającego w celu określenia częstości samoodnawiających się komórek białaczkowych w pierwotnym TALL CG zarodki jednego szczepu wstrzyknięto za pomocą RAG, dwóm larwom cmic i RAG dwóm larwom GFP przebadano pod kątem pierwotnego TALL Po 28 dniach zgodnie z poprzednimi pracami, około 5% ryb, którym wstrzyknięto implanty, ma limfocyty T GFP dodatnie w grasicy, a u 100% tych ryb rozwinie się białaczka. W tym przypadku znakowane fluorescencyjnie komórki TALL zostały posortowane od 65-dniowych chorych zwierząt i wykorzystane w teście przeszczepu komórek o ograniczonym rozcieńczeniu. Najpierw narysowano chód, aby wybrać pojedyncze komórki.

Następnie wybrano komórki ujemne jodku propidyny. Na koniec narysowano chód, aby wybrać do sortowania tylko komórki białaczki GFP dodatnie. W tym przykładzie ryb przeszczepionych metodą TALL w 28 dniu guzy we wczesnym stadium były postrzegane jako obszar komórek GFP dodatnich w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.

Podczas gdy niektóre TLS były bardziej zaawansowane, po rozszerzeniu się w celu wypełnienia jamy otrzewnej w tych eksperymentach, przeszczepiono ponad 220 zwierząt, co może być łatwo osiągnięte przez jedną osobę w ciągu kilku godzin. Analiza danych za pomocą oprogramowania elda wykazała, że średnio jedna na 135 komórek T była samoodnawiającymi się komórkami rozmnażającymi białaczkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeszczepiać komórki nowotworowe przy ograniczaniu rozcieńczenia do jamy otrzewnej syngenetycznego danio pręgowanego i jak wykorzystać uzyskane dane do określenia częstotliwości rozmnażania komórek nowotworowych w danym guzie.

Dalsze badania z wykorzystaniem genetycznie modyfikowanych zwierząt mogą pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów rządzących samoodnawianiem się tych komórek rozmnażających nowotwory.