Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zaobserwowanie efektów obciążenia ściskającego w chrząstce wyrostkażnego żuchwy u myszy przy użyciu pomiarów morfometrycznych na radiogramach oraz analizy histologicznej. Metryki te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zmian strukturalnych i komórkowych w wyrostkużnym żuchwy gryzoni. Główną zaletą zaprezentowanej tutaj techniki jest możliwość jej zastosowania do analizy innych małych zwierząt kostnych lub uczestniczących w badaniach.

Do niniejszego protokołu należy przygotować wyizolowane i wypreparowane żuchwy myszy. Przenieś żuchwy na szalce Petriego do systemu szafki rentgenowskiej. Następnie wykonaj radiogramy przy napięciu 26 kV przez pięć sekund.

Teraz otwórz obrazy w oprogramowaniu analitycznym, aby wykonać pomiary morfometryczne. Najpierw użyj przycisku jednostek, aby ustawić pasek skali. Następnie wybierz sześć punktów anatomicznych, korzystając z markerów stylu 2.

W pierwszej kolejności wybierz najbardziej tylne punkty wyrostka kłykczastego żuchwy jako punkt pierwszy. Następnie wybierz wyrostek zębowy jako punkt drugi. Na koniec wybierz najniższy punkt wcięcia sigmoidnego jako punkt trzeci.

Następnie należy wybrać najgłębszy punkt w zagłębieniu gałęzi żuchwy, punkt czwarty, a potem wybrać najbardziej przedni punkt powierzchni stawowej wyrostka kątowego, punkt piąty. Teraz należy wybrać najbardziej tylny punkt powierzchni stawowej wyrostka kątowego jako punkt szósty i przystąpić do pomiarów długości przy użyciu narzędzia do pomiaru długości. Następnie, używając narzędzia do wykreślania linii prostopadłych od punktu trzeciego do czwartego, należy zmierzyć długość głowy wyrostka, która jest długością prostopadle opuszczonej linii z punktu pierwszego do linii łączącej punkty trzeci i czwarty.

Następnie zmierz długość żuchwy pomiędzy punktami pierwszym a drugim. Na koniec zmierz szerokość głowy wyrostka przysiodkowego, która znajduje się pomiędzy punktami piątym a szóstym. Aby zapisać dane, skopiuj listę pomiarów znajdującą się po prawej stronie ekranu.

Przed zatopieniem utrwalonych, ale niedekalcyfikowanych żuchew, należy namoczyć je przez noc w 30% sacharozie w PBS. Następnego dnia należy wyciąć nadmiar tkanki miękkiej i ostrożnie odciąć wyrostek stawowy żuchwy. Następnie próbki należy umieścić w plastikowych formach, tak aby powierzchnia przyśrodkowa wyrostka stawowego przylegała do podstawy formy, a próbka znajdowała się równolegle do jej dna.

Następnie zanurz je w żywicy do zatapiania i schłodź żywicę za pomocą kawałka suchego lodu. Potem dopełnij formy dodatkową ilością żywicy do zatapiania. Przenieś je do zimnego 2-metyliobutanu, schłodzonego w zamrażarce lub za pomocą suchego lodu.

Po schłodzeniu należy przechowywać preparaty w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu wykonania skrawków. Aby ilościowo ocenić ekspresję Col10a1 w MCC w przekrojach strzałkowych kłykci, należy otworzyć obrazy histologiczne w programie do analizy obrazu i zaznaczyć obszar zainteresowania za pomocą narzędzia lasso. W tym przypadku zaznaczany jest obszar MCC.

Zanotuj liczbę pikseli w obszarze, która jest wyświetlana w oknie histogramu. Następnie zaznacz czerwone piksele Col10a1, dostosowując zakres kolorów. Użyj narzędzia pipety, aby wybrać czerwony piksel z obrazu, i kliknij OK. Następnie zapisz liczbę czerwonych pikseli w obszarze, zgodnie z informacją w oknie histogramu.

Odsetek czerwonych pikseli w obszarze reprezentuje poziom ekspresji Col10a1. Teraz, stosując tę samą podstawową technikę, należy określić ilościowo aktywność TRAP w MCC oraz w kości podchrzestnej. Najpierw zaznacz chrząstkę w obszarach kości podchrzestnej jako obszary do analizy i zanotuj całkowitą liczbę pikseli.

Następnie należy wybrać żółte piksele wygenerowane przez substrat ELF97. Należy odnotować liczbę pikseli dodatnich i obliczyć odsetek pikseli dodatnich pod kątem TRAP. Teraz należy przeprowadzić kwantyfikację komórek dodatnich pod kątem EDU, które zostały przeciwbarwione na niebiesko za pomocą DEPI.

Ponownie zaznacz obszar zainteresowania, a następnie dokonaj kwantyfikacji niebieskich pikseli w jego obrębie. Użyj tej samej metody, aby określić liczbę pikseli pozytywnych pod kątem EDU w tym samym regionie. Pomiary morfometryczne myszy poddanych kompresyjnemu obciążeniu stawu skroniowo-żuchwowego (TMJ) wykazały, że obciążenie istotnie zwiększyło długość żuchwy oraz głowy wyrostkażuchwowego.

Niemniej jednak obciążenie nie spowodowało istotnej zmiany szerokości wyrostka. Ilościowa analiza rozmieszczenia kolagenu wykazała istotny wzrost ekspresji Col10a1 oraz MCC w wyrostkach zwierząt poddanych obciążeniu. Z kolei ekspresja Col2a1 nie różniła się znacząco od grupy kontrolnej.

Aktywność TRAP wzrosła w obszarze podchrzestnym kłykci oraz u obciążonych myszy, podobnie jak proliferacja. Barwienie EDU wskazuje liczbę komórek proliferujących. Rozkład proteoglikanów w MCC została określona poprzez ocenę obszaru zabarwionego błękitem toluidyny oraz mapy dystansów.

W grupie obciążonej odnotowano istotny wzrost mapowania odległości w obrębie MCC wyrostków kostnych. Jednakże obszar barwienia proteoglikanów nie wykazywał statystycznie istotnych różnic między grupami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat analizy zmian komórkowych i strukturalnych w wyrostku kostnym żuchwy gryzoni.