Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja skutków obciążenia ściskającego w chrząstce kłykciowej żuchwy myszy za pomocą pomiarów morfometrycznych w radiogramach i analizie histologicznej. Wskaźniki te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zmian strukturalnych i komórkowych w kłykciu żuchwy gryzoni. Główną zaletą przedstawionej tutaj techniki jest to, że można ją wykorzystać do analizy innych małych zwierząt urodzonych lub uczestniczących w badaniu.

W tym protokole należy mieć wyizolowane, wypreparowane żuchwy myszy gotowe do użycia. Na szalce Petriego przenieś żuchwy do systemu szafy rentgenowskiej. Następnie wykonuj zdjęcia rentgenowskie przy napięciu 26 kilowoltów przez pięć sekund.

Teraz otwórz obrazy w oprogramowaniu do analizy, aby wykonać pomiary morfometryczne. Najpierw użyj przycisku jednostki, aby ustawić podziałkę. Następnie wybierz sześć punktów anatomicznych za pomocą stylu znacznika 2.

Najpierw wybierz najbardziej tylne punkty kłykcia żuchwy jako punkt pierwszy. Następnie wybierz proces incired dla punktu drugiego. Następnie wybierz najgłębszy punkt w wycięciu esicy dla punktu trzeciego.

Następnie wybierz najgłębszy punkt we wklęsłości ramusa żuchwy, punkt czwarty, a następnie wybierz najbardziej wysunięty do przodu punkt powierzchni stawowej kłykcia, punkt piąty. Teraz wybierz najbardziej wysunięty do tyłu punkt powierzchni stawowej kłykcia jako punkt szósty i przystąp do wykonywania pomiarów długości za pomocą narzędzia do pomiaru długości. Następnie użyj narzędzia do linii prostopadłej od punktów od trzeciego do czwartego, aby zmierzyć długość główki kłykcia, czyli długość prostopadłej, od punktu pierwszego do linii między punktami trzecim i czwartym.

Następnie zmierz długość żuchwy między punktem pierwszym a drugim. Na koniec zmierz szerokość główki kłykcia, która znajduje się między punktami piątym a szóstym. Aby zapisać dane, skopiuj listę pomiarów po prawej stronie ekranu.

Przed osadzeniem stałych, ale nie odwapnionych żuchw należy je namoczyć przez noc w 30 procentach sacharozy w PBS. Następnego dnia wypreparuj nadmiar tkanki miękkiej i ostrożnie przetnij kłykieć żuchwy. Teraz umieść próbki w plastikowych foremkach, tak aby środkowa powierzchnia kłykcia przylegała do podstawy formy, a próbka była równoległa do dna formy.

Następnie zanurz je w żywicy do zatapiania i ostudź żywicę kawałkiem suchego lodu. Następnie udekoruj formy większą ilością żywicy do zatapiania. Przenieś je do zimnych dwóch metylobutanów, schłodzonych przez zamrażarkę lub suchy lód.

Po schłodzeniu przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza w celu podzielenia na sekcje. Aby określić ilościowo ekspresję Col10a1 w MCC strzałkowych odcinków kłykci, otwórz obrazy histologiczne w pakiecie oprogramowania do analizy obrazu i wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia lasso. W takim przypadku wybierany jest region MCK.

Zanotuj liczbę pikseli w obszarze, która jest podawana w polu histogramu. Następnie wybierz czerwone piksele Col10a1, dostosowując zakres kolorów. Użyj narzędzia Kroplomierz, aby wybrać czerwony piksel z obrazu i kliknij przycisk OK. Następnie zapisz liczbę czerwonych pikseli w obszarze, zgodnie z informacją w polu histogramu.

Ułamek czerwonych pikseli w obszarze reprezentuje ilość wyrażenia Col10a1. Teraz, używając tej samej podstawowej techniki, określ ilościowo aktywność TRAP w MCC i kości podchrzęstnej. Najpierw wybierz chrząstkę w obszarach kości podchrzęstnej jako obszary do analizy i zanotuj całkowitą liczbę pikseli.

Następnie wybierz żółte piksele wygenerowane przez podłoże ELF97. Zwróć uwagę na liczbę pikseli dodatnich i oblicz ułamek pikseli dodatnich TRAP. Teraz określ ilościowo komórki dodatnie EDU, które są barwione na niebiesko przez DEPI.

Ponownie wybierz obszar zainteresowania, a następnie określ ilościowo niebieskie piksele w nim zawarte. Użyj również tej metody, aby określić liczbę dodatnich pikseli EDU w tym samym regionie. Pomiary morfometryczne myszy poddanych ściskającemu obciążeniu stawu skroniowo-żuchwowego wykazały, że obciążenie znacznie zwiększyło długość głowy żuchwy i kłykcia.

Mimo to obciążenie nie spowodowało znaczącej zmiany szerokości kłykcia. Kwantyfikacja dystrybucji kolagenu ujawniła znaczny wzrost ekspresji Col10a1 i MCC kłykci obciążonych zwierząt. Z drugiej strony, ekspresja Col2a1 nie różniła się zbytnio od kontroli.

Aktywność TRAP wzrosła w obszarze podchrzęstnym kłykci i załadowanych myszy, podobnie jak subproliferacja. Barwienie EDU oznacza liczbę komórek proliferacyjnych. Rozmieszczenie proteoglikanów w MCC określono ilościowo, oceniając obszar zabarwiony na niebiesko toluidyną i mapę odległości.

Nastąpił istotny wzrost mapowania odległości w MCC kłykci grupy obciążonej. Jednak obszar zabarwiony proteoglikanem nie różnił się statystycznie między grupami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować zmiany komórkowe i strukturalne w kłykciu żuchwy gryzoni.