Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy
11 stycznia 2018
Ten manuskrypt przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w obrębie kłykcia żuchwy gryzoni.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja skutków obciążenia ściskającego w chrząstce kłykciowej żuchwy myszy za pomocą pomiarów morfometrycznych w radiogramach i analizie histologicznej. Wskaźniki te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zmian strukturalnych i komórkowych w kłykciu żuchwy gryzoni. Główną zaletą przedstawionej tutaj techniki jest to, że można ją wykorzystać do analizy innych małych zwierząt urodzonych lub uczestniczących w badaniu.
W tym protokole należy mieć wyizolowane, wypreparowane żuchwy myszy gotowe do użycia. Na szalce Petriego przenieś żuchwy do systemu szafy rentgenowskiej. Następnie wykonuj zdjęcia rentgenowskie przy napięciu 26 kilowoltów przez pięć sekund.
Teraz otwórz obrazy w oprogramowaniu do analizy, aby wykonać pomiary morfometryczne. Najpierw użyj przycisku jednostki, aby ustawić podziałkę. Następnie wybierz sześć punktów anatomicznych za pomocą stylu znacznika 2.
Najpierw wybierz najbardziej tylne punkty kłykcia żuchwy jako punkt pierwszy. Następnie wybierz proces incired dla punktu drugiego. Następnie wybierz najgłębszy punkt w wycięciu esicy dla punktu trzeciego.
Następnie wybierz najgłębszy punkt we wklęsłości ramusa żuchwy, punkt czwarty, a następnie wybierz najbardziej wysunięty do przodu punkt powierzchni stawowej kłykcia, punkt piąty. Teraz wybierz najbardziej wysunięty do tyłu punkt powierzchni stawowej kłykcia jako punkt szósty i przystąp do wykonywania pomiarów długości za pomocą narzędzia do pomiaru długości. Następnie użyj narzędzia do linii prostopadłej od punktów od trzeciego do czwartego, aby zmierzyć długość główki kłykcia, czyli długość prostopadłej, od punktu pierwszego do linii między punktami trzecim i czwartym.
Następnie zmierz długość żuchwy między punktem pierwszym a drugim. Na koniec zmierz szerokość główki kłykcia, która znajduje się między punktami piątym a szóstym. Aby zapisać dane, skopiuj listę pomiarów po prawej stronie ekranu.
Przed osadzeniem stałych, ale nie odwapnionych żuchw należy je namoczyć przez noc w 30 procentach sacharozy w PBS. Następnego dnia wypreparuj nadmiar tkanki miękkiej i ostrożnie przetnij kłykieć żuchwy. Teraz umieść próbki w plastikowych foremkach, tak aby środkowa powierzchnia kłykcia przylegała do podstawy formy, a próbka była równoległa do dna formy.
Następnie zanurz je w żywicy do zatapiania i ostudź żywicę kawałkiem suchego lodu. Następnie udekoruj formy większą ilością żywicy do zatapiania. Przenieś je do zimnych dwóch metylobutanów, schłodzonych przez zamrażarkę lub suchy lód.
Po schłodzeniu przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza w celu podzielenia na sekcje. Aby określić ilościowo ekspresję Col10a1 w MCC strzałkowych odcinków kłykci, otwórz obrazy histologiczne w pakiecie oprogramowania do analizy obrazu i wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia lasso. W takim przypadku wybierany jest region MCK.
Zanotuj liczbę pikseli w obszarze, która jest podawana w polu histogramu. Następnie wybierz czerwone piksele Col10a1, dostosowując zakres kolorów. Użyj narzędzia Kroplomierz, aby wybrać czerwony piksel z obrazu i kliknij przycisk OK. Następnie zapisz liczbę czerwonych pikseli w obszarze, zgodnie z informacją w polu histogramu.
Ułamek czerwonych pikseli w obszarze reprezentuje ilość wyrażenia Col10a1. Teraz, używając tej samej podstawowej techniki, określ ilościowo aktywność TRAP w MCC i kości podchrzęstnej. Najpierw wybierz chrząstkę w obszarach kości podchrzęstnej jako obszary do analizy i zanotuj całkowitą liczbę pikseli.
Następnie wybierz żółte piksele wygenerowane przez podłoże ELF97. Zwróć uwagę na liczbę pikseli dodatnich i oblicz ułamek pikseli dodatnich TRAP. Teraz określ ilościowo komórki dodatnie EDU, które są barwione na niebiesko przez DEPI.
Ponownie wybierz obszar zainteresowania, a następnie określ ilościowo niebieskie piksele w nim zawarte. Użyj również tej metody, aby określić liczbę dodatnich pikseli EDU w tym samym regionie. Pomiary morfometryczne myszy poddanych ściskającemu obciążeniu stawu skroniowo-żuchwowego wykazały, że obciążenie znacznie zwiększyło długość głowy żuchwy i kłykcia.
Mimo to obciążenie nie spowodowało znaczącej zmiany szerokości kłykcia. Kwantyfikacja dystrybucji kolagenu ujawniła znaczny wzrost ekspresji Col10a1 i MCC kłykci obciążonych zwierząt. Z drugiej strony, ekspresja Col2a1 nie różniła się zbytnio od kontroli.
Aktywność TRAP wzrosła w obszarze podchrzęstnym kłykci i załadowanych myszy, podobnie jak subproliferacja. Barwienie EDU oznacza liczbę komórek proliferacyjnych. Rozmieszczenie proteoglikanów w MCC określono ilościowo, oceniając obszar zabarwiony na niebiesko toluidyną i mapę odległości.
Nastąpił istotny wzrost mapowania odległości w MCC kłykci grupy obciążonej. Jednak obszar zabarwiony proteoglikanem nie różnił się statystycznie między grupami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować zmiany komórkowe i strukturalne w kłykciu żuchwy gryzoni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy rękopis przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w kąciku żuchwy gryzoni. Badanie koncentruje się na skutkach obciążenia ściskającego w chrząstce kącika żuchwy myszy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Ortopedy
Tło
- Rozumienie zmian strukturalnych i komórkowych w żuchwie jest kluczowe dla różnych badań biologicznych.
- Obciążenie ściskające może wpływać na zdrowie i rozwój chrząstki.
- Gryzonie służą jako model do badania tych zmian ze względu na ich anatomiczne podobieństwa do ludzi.
- Analizy radiograficzne i histologiczne są niezbędne do oceny tych zmian.
Cel badania
- Obserwacja skutków obciążenia ściskającego na chrząstce kącika żuchwy.
- Wykorzystanie pomiarów morfometrycznych do oceny zmian strukturalnych.
- Przedstawienie protokołu, który można zastosować do innych małych zwierząt.
Stosowane metody
- Izolacja i sekcja kącików żuchwy myszy.
- Przeniesienie kącików żuchwy do systemu gabinetu rentgenowskiego.
- Wykonanie zdjęć rentgenowskich przy 26 kilowoltach przez pięć sekund.
- Analiza histologiczna do oceny zmian komórkowych.
Główne wyniki
- Identyfikacja zmian morfometrycznych w kąciku żuchwy.
- Ocena zmian komórkowych spowodowana obciążeniem ściskającym.
- Demonstracja skuteczności stosowanych technik obrazowania.
- Potencjalne zastosowania metod w innych badaniach na małych zwierzętach.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych informacji na temat wpływu obciążeń mechanicznych na chrząstkę.
- Rozwinięte metody mogą być stosowane w szerszych zastosowaniach w badaniach biologicznych.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać długoterminowe skutki obciążeń ściskających.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of structural and cellular adaptations in the murine mandibular condyle under compressive loading, providing a preclinical model for mechanobiology studies relevant to temporomandibular joint disorders. By linking mechanical stimuli to molecular and histological endpoints such as Col10a1 expression, TRAP activity, and proteoglycan distribution, the approach supports target validation in cartilage homeostasis pathways. The morphometric and imaging workflow offers a scalable, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in jaw development and osteoarthritic conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways in mandibular condylar cartilage through quantification of collagen expression and cellular proliferation.
- Operational Value: Provides standardized morphometric and histological readouts to validate target engagement in cartilage remodeling processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including pixel-based fluorescence intensity and distance mapping for reproducible assessment of extracellular matrix changes.
- Operational Value: Uses accessible imaging tools (Digimizer, fluorescence microscopy) to establish standardized assays for collagen and proteoglycan analysis in small bone models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of TMJ loading conditions to evaluate cartilage degradation and repair mechanisms.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of structural adaptation and cellular response in murine models, enabling preclinical continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing early-phase structural and phenotypic data that inform target selection and mechanistic de-risking in joint tissue biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanical regulation of chondrocyte differentiation and matrix production via quantifiable morphometric and molecular endpoints.
- Screening: Enables assay readiness through standardized radiographic and histological quantification of condyle dimensions and molecular markers.
- Analytics: Delivers quantitative measurements including condyle length, width, Col10a1-positive pixel fraction, TRAP activity, and EDU-positive cell counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mechanical loading to histological outcomes in endochondral ossification regions, supporting preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other small animal bones and ossification sites, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cartilage response to load by correlating structural changes with molecular markers of hypertrophy and remodeling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized imaging protocols and software-based quantification across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing objective, multi-parametric data on tissue adaptation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanobiology targets based on quantitative phenotypic outcomes in validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent dissection, radiographic imaging, and histological sectioning.
- Dependent on access to X-ray imaging systems, fluorescence microscopy, and image analysis software (e.g., Digimizer).
- Necessitates standardization of sample preparation, embedding, and sectioning protocols for consistent morphometric and cellular quantification.
- Adaptation to other bone sites requires validation of anatomical landmarks and region-of-interest definitions.
- Practical limitations include tissue size constraints and the need for careful handling to avoid decalcification during preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
X-ray Imaging and Morphometric Measurements of Mandibular Condyles
3:00
Mandibular Condyle Embedding
4:08
Fluorescent Histological Quantification of Mandibular Condyle Samples
6:21
Results: Morphometric Data and Staining Analyses
7:42
Conclusion
