Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla
21 października 2015
Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wzajemnego zestawiania i rozszerzania chondrocytów za pomocą analizy komórek klonalnych łuku zebry. Osiąga się to poprzez wygenerowanie SOX 10 ERT dwóch linii M łuku zebry Cree w celu uzyskania specyficznej dla tkanki rekombinacji w chrząstce czaszkowej twarzy i zarodkach do analizy klonalnej. Następnie zarodki są pulsowane tamoksyfenem w stadium 10, a więc roztoczami przez trzy godziny w celu wywołania procesu rekombinacji.
Następnie zarodki są selekcjonowane pod kątem ekspresji aktywności CRE i silnej ekspresji czerwonej fluorescencji lub RFP, a zarodki są montowane do obrazowania chrząstki twarzoczaszki typu C. Wyniki wskazują na wielospektralną analizę komórkową chondrocytów czaszkowo-twarzowych w oparciu o obrazowanie konfokalne. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak barwienie S na niebiesko lub linie transgeniczne, takie jak so i GFP lub SOX i kde, jest to, że łuk zebry pozwala nam dokładnie obserwować i śledzić populacje komórek klonalnych zaangażowanych w tworzenie narządu.
Aby przygotować się do pobrania zarodków pierwszego dnia, ustaw kilka par samców i samic sox, 10 ERT dwóch transgenicznych ryb zebry Cree M w podzielonych zbiornikach godowych między piątą a 18:00 następnego dnia po sprawdzeniu pod mikroskopem świetlnym, czy zarodki osiągnęły etap 10 cellulitu pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem RFP. Wyizolować jaskrawoczerwone zarodki i przenieść je na nową szalkę Petriego ze świeżą pożywką E 3 w celu wywołania rekombinacji Cree. Dodać 10 mikromolowy roztwór hydroksytamoksyfenu do szalki Petriego i inkubować zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez trzy godziny.
Następnie zdekantować roztwór tamoksyfenu do pojemnika na odpady biologiczne i użyć E 3 do kilkukrotnego przemycia zarodków po inkubacji zarodków przez noc do 28 do 29, a więc stadium roztoczy, przenieść zarodki do roztworu E 3 PTU i zwrócić je do inkubatora. Aby uwidocznić w pełni rozwinięte struktury czaszki C, wybierz zarodki w czterech DPF z intensywnym czerwonym sygnałem i żółtym wyrazem Cree w siatkówce. Po znieczuleniu zarodka w Trica, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś go na szalkę Petriego zawierającą kroplę metylocelulozy na czystym szkiełku konfokalnym.
Umieść kroplę świeżej metylocelulozy i użyj końcówki mikroładowarki, aby zamontować zarodek umieszczony grzbietowo, uważając, aby nie dotknąć go bezpośrednio szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 na 25. Przykryj zarodek i w razie potrzeby użyj szkiełka nakrywkowego, aby manipulować zarodkiem. Aby zobrazować zarodek, użyj obiektywu z suchą soczewką 20x.
Aby ustawić ostrość na obiekcie, naciśnij przycisk L 100 na mikroskopie, a następnie wybierz przycisk ustawień konfokalnych. Kliknij przycisk automatycznie i wybierz CFP dla kanału pierwszego, GFP dla kanału drugiego i RFP lub M cherry dla kanału trzeciego. Następnie zamknij okno.
Włącz kanały drugi i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady. Następnie kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć skanowanie. Po dostosowaniu ustawień uchwyć żądane obrazy i zapisz je w formacie oprogramowania konfokalnego, a także w formacie TIF do przetwarzania obrazu według kanału.
Aby przeprowadzić obrazowanie CFP, wyłącz kanał drugi i trzeci oraz włącz kanał pierwszy bez zmiany obszaru ostrości. Dostosuj ponownie ustawienia skanowania przed zrobieniem zdjęć, zapisz obrazy zgodnie z opisem i przeprowadź przetwarzanie obrazu zgodnie z opisem panoramowania i współpracowników, jak pokazano poniżej. Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą całego niebieskiego barwienia Mount Sian była nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki mekla i powszechnie stosowana do wizualizacji końcowej organizacji komórkowej w celu dalszej analizy rozwijających się chondrocytów w czasie.
Wykorzystując SOX 10 kda, linie transgeniczne wykorzystano do badania migracji komórek, konwergencji i ekspansji w żywych zarodkach przy użyciu obrazowania na żywo linii transgenicznej zebra bow. Dalsze badania nad organizacją chondrocytów w strukturze szkieletu twarzoczaszki C ujawniają proces łączenia i wydłużania chondrocytów, który pośredniczy w wydłużaniu i wzroście chrząstki meckla. Ten rysunek przedstawia dolną szczękę z UI zebra bow M Sox 10 ERT dwa transgeniczne zarodki Cree między 3D PF a pięć dni po zapłodnieniu.
Dolna szczęka jest najlepiej zobrazowana brzusznie, aby umożliwić wyraźny widok organizacji komórek w chrząstce meles, jak pokazano tutaj. Stabilnie utrzymane i odziedziczone kolory umożliwiają łatwe śledzenie linii i mapowanie losu komórek grzebienia nerwowego czaszki. Pojedyncza niebieska komórka wydaje się migrować i interpolować z sąsiednimi komórkami, a następnie wydłuża się wzdłuż przedniej tylnej osi, tworząc jednolicie ukształtowane miejsce chindry, zachowując w ten sposób globalny kształt chrząstki meles, gdy rozciąga się do przodu.
Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rozwojem kotów do zbadania chondro w tworzeniu szkieletów danio pręgowanego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wizualizacji wplatania się i rozciągania chondrocytów w chrząstce twarzoczaszki u rybki labiryntowej z użyciem transgennych ryb Zebrabow. Technika ta pozwala na bezpośrednie obserwowanie dynamicznego zachowania komórek podczas tworzenia narządów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Biologia komórki
Tło
- Organizacja kości twarzoczaszki została wysnuła hipotezy, ale nie została bezpośrednio zwizualizowana.
- Chondrocyte odgrywają kluczową rolę w rozwoju chrząstki.
- Istniejące metody badania zachowania komórek mają ograniczenia.
- Technologia Zebrabow pozwala na klonową analizę populacji komórek.
Cel badania
- Wizualizacja wplatania się chondrocytów i zmian morfologicznych.
- Wykazanie zalet technologii Zebrabow w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Generowanie linii SOX 10 ERT2 Cre Zebrabow M dla tkankowej rekombinacji.
- Pulsacja zarodków tamoksyfenem w celu indukcji rekombinacji.
- Selekcja zarodków na podstawie aktywności CRE i ekspresji RFP.
- Wizualizacja konfokalna dla wielospektralnej analizy chondrocytów twarzoczaszkowych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja wplatania się i rozciągania chondrocytów.
- Demonstracja klonowych populacji komórek zaangażowanych w tworzenie narządów.
- Porównanie techniki Zebrabow z istniejącymi metodami.
- Wgląd w dynamiczne zachowanie komórek w chrząstce twarzoczaszkowej.
Wnioski
- Technologia Zebrabow zapewnia potężne narzędzie do badania rozwoju twarzoczaszki.
- Metoda poprawia zrozumienie dynamiki chondrocytów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne dziedziny biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte intercalation mechanisms that drive Meckel’s cartilage extension.
- Scientific Value: Supports functional validation of clonal contributions to craniofacial skeletal patterning.
- Scientific Value: Provides direct observation of cellular behaviors underlying hypoplastic mandible phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates multispectral clonal readouts for quantitative assessment of chondrocyte dynamics.
- Operational Value: Establishes a reproducible lineage-tracing platform for live imaging of cartilage morphogenesis.
- Operational Value: Enables standardized clonal analysis across developmental timepoints for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links clonal chondrocyte behavior to mandibular outgrowth, informing disease-relevant system relevance.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular basis of mandibular hypoplasia.
- Translational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of craniofacial growth pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chondrocyte-driven tissue extension mechanisms in craniofacial development.
- Screening: Delivers quantitative, multispectral clonal outputs enabling reproducible assessment of chondrocyte organization.
- Analytics: Provides clonal lineage tracing and morphological metrics that allow comparison of cellular behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects clonal chondrocyte dynamics to mandibular morphogenesis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clonal imaging platform applicable to multiple organogenesis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of chondrocyte intercalation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via inherited fluorescent clonal labeling.
- Strategic Value: Reduced biological risk in craniofacial therapeutic development via mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets affecting mandibular growth and patterning.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling and clonal lineage tracing.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure for multispectral imaging.
- Necessitates standardized tamoxifen induction protocols for consistent recombination.
- Involves adaptation considerations for applying clonal analysis to other skeletal or tissue systems.
- Limited by the need for precise embryonic staging and fluorescent selection for clonal induction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
