Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wizualizacja rozmieszczenia i rozrastania się chondrocytów za pomocą clonalnej analizy komórek zebra bow. Osiąga się to poprzez wygenerowanie linii zebra bow M z konstruktem SOX 10 ERT2 Cre w celu uzyskania tkankowo swoistej rekombinacji w chrząstkach kranialno-twarzowych embrionów do analizy klonalnej. Następnie embriony poddaje się impulsowej ekspozycji na tamoksyfen w stadium 10-somitu przez trzy godziny, aby wywołać proces rekombinacji.

Następnie wybierane są embriony wykazujące aktywność CRE oraz silną ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), a następnie są one montowane w celu obrazowania chrząstki kraniofacialnej C. Wyniki przedstawiają wielospektralną analizę komórkową chondrocytów kraniofacialnych opartą na obrazowaniu konfokalnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie S w kolorze niebieskim lub linie transgeniczne, np. so i GFP lub SOX i kde, jest to, że zebra bow pozwala nam na specyficzną obserwację i śledzenie klonalnych populacji komórek biorących udział w formowaniu narządu.

Aby przygotować się do zbioru embrionów w pierwszym dniu, należy umieścić kilka par samców i samic transgenicznych danio pręgowanych sox, 10 ERT two Cree zebra bow M w podzielonych zbiornikach do tarła między godziną 17:00 a 18:00. Następnego dnia, po zweryfikowaniu pod mikroskopem świetlnym, że embriony osiągnęły stadium 10 blastomerów, należy poddać je obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem RFP. Wyizoluj intensywnie czerwone embriony i przenieś je do nowej szalki Petriego z nowym medium E3, aby wywołać rekombinację Cree. Do szalki Petriego dodaj 10 µM roztworu hydroksytamoksifenu i inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C przez trzy godziny.

Następnie zlej roztwór Tamoksyfenu do pojemnika na odpady biologiczne i kilkukrotnie przemyj zarodki medium E3. Po inkubacji zarodków przez noc do stadium 28–29 somytów, przenieś je do roztworu E3 z PTU i umieść ponownie w inkubatorze. Aby zwizualizować w pełni rozwinięte struktury kraniofacjalne, wybierz zarodki w 4. dniu po zapłodnieniu (DPF) wykazujące intensywny czerwony sygnał oraz żółtą ekspresję Cree w siatkówce. Po znieczuleniu zarodka w tricainie, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś go do szalki Petriego zawierającej kroplę metylocelulozy na czystym szkiełku do mikroskopu konfokalnego.

Nanieś kroplę świeżej metylocelulozy i za pomocą końcówki micro loader zamocuj embrion w pozycji grzbietowej, dbając o to, aby nie dotknąć go bezpośrednio szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 by 25. Przykryj embrion, a w razie potrzeby użyj szkiełka nakrywkowego do jego manipulacji. Do obrazowania embrionu użyj suchego obiektywu 20 x.

Aby ustawić ostrość na badanym obiekcie, naciśnij przycisk L 100 na mikroskopie, a następnie wybierz przycisk konfiguracji konfokalnej. Kliknij auto i wybierz CFP dla kanału pierwszego, GFP dla kanału drugiego oraz RFP lub M cherry dla kanału trzeciego. Następnie zamknij okno.

Włącz kanały drugi i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady (remove interlock). Następnie kliknij play, aby rozpocząć skanowanie. Po dostosowaniu ustawień zarejestruj pożądane obrazy i zapisz je w formacie oprogramowania konfokalnego, a także w formacie TIF w celu późniejszego przetwarzania obrazów z poszczególnych kanałów.

Aby przeprowadzić obrazowanie CFP, wyłącz kanały drugi i trzeci oraz włącz kanał pierwszy, nie zmieniając obszaru ogniskowania. Przed wykonaniem zdjęć ponownie dostosuj ustawienia skanowania, zapisz obrazy w opisany wyżej sposób i przeprowadź przetwarzanie obrazów zgodnie z metodą opisaną przez Pana i współpracowników, jak pokazano tutaj. Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą barwienia całego preparatu błękitem Alcian jest nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki Meckla i jest powszechnie stosowana do wizualizacji końcowej organizacji komórkowej w celu dalszej analizy linii rozwojowych chondrocytów w czasie.

Wykorzystanie transgenicznych linii SOX 10 kda służyło do badania migracji komórek oraz konwergencji i ekstensji w żywych embrionach przy użyciu obrazowania na żywo transgenicznej linii zebra bow m. Dalsze badanie organizacji chondrocytów w strukturze szkieletu kraniofacialnego C ujawnia proces interpolacji i wydłużania się chondrocytów, który pośredniczy w ekstensji i wzroście chrząstki Meckela. Rysunek ten przedstawia dolną szczękę z embrionów transgenicznych UI zebra bow M Sox 10 ERT dwa Cree między 3 dpf a 5 dniami po zapłodnieniu.

Żuchwę najlepiej obrazować od strony brzusznej, aby uzyskać wyraźny wgląd w organizację komórek w chrząstce meles, jak pokazano tutaj. Stabilnie utrzymywane i dziedziczone kolory umożliwiają łatwe śledzenie linii komórkowych oraz mapowanie losów komórek grzebienia nerwowego czaszki. Pojedyncza niebieska komórka wydaje się migrować i interpolować z sąsiednimi komórkami, a następnie wydłuża się wzdłuż osi przednio-tylnej, tworząc jednorodnie ukształtowane miejsce chondrogenezy, utrzymując w ten sposób globalny kształt chrząstki meles w miarę jej rozciągania się ku przodowi.

Technika ta otwiera badaczom zajmującym się rozwojem tkanek chrzęstnych możliwość analizy chondrocytów w procesie formowania szkieletu u danio pręgowanego.