Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wzajemnego zestawiania i rozszerzania chondrocytów za pomocą analizy komórek klonalnych łuku zebry. Osiąga się to poprzez wygenerowanie SOX 10 ERT dwóch linii M łuku zebry Cree w celu uzyskania specyficznej dla tkanki rekombinacji w chrząstce czaszkowej twarzy i zarodkach do analizy klonalnej. Następnie zarodki są pulsowane tamoksyfenem w stadium 10, a więc roztoczami przez trzy godziny w celu wywołania procesu rekombinacji.

Następnie zarodki są selekcjonowane pod kątem ekspresji aktywności CRE i silnej ekspresji czerwonej fluorescencji lub RFP, a zarodki są montowane do obrazowania chrząstki twarzoczaszki typu C. Wyniki wskazują na wielospektralną analizę komórkową chondrocytów czaszkowo-twarzowych w oparciu o obrazowanie konfokalne. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak barwienie S na niebiesko lub linie transgeniczne, takie jak so i GFP lub SOX i kde, jest to, że łuk zebry pozwala nam dokładnie obserwować i śledzić populacje komórek klonalnych zaangażowanych w tworzenie narządu.

Aby przygotować się do pobrania zarodków pierwszego dnia, ustaw kilka par samców i samic sox, 10 ERT dwóch transgenicznych ryb zebry Cree M w podzielonych zbiornikach godowych między piątą a 18:00 następnego dnia po sprawdzeniu pod mikroskopem świetlnym, czy zarodki osiągnęły etap 10 cellulitu pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem RFP. Wyizolować jaskrawoczerwone zarodki i przenieść je na nową szalkę Petriego ze świeżą pożywką E 3 w celu wywołania rekombinacji Cree. Dodać 10 mikromolowy roztwór hydroksytamoksyfenu do szalki Petriego i inkubować zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie zdekantować roztwór tamoksyfenu do pojemnika na odpady biologiczne i użyć E 3 do kilkukrotnego przemycia zarodków po inkubacji zarodków przez noc do 28 do 29, a więc stadium roztoczy, przenieść zarodki do roztworu E 3 PTU i zwrócić je do inkubatora. Aby uwidocznić w pełni rozwinięte struktury czaszki C, wybierz zarodki w czterech DPF z intensywnym czerwonym sygnałem i żółtym wyrazem Cree w siatkówce. Po znieczuleniu zarodka w Trica, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś go na szalkę Petriego zawierającą kroplę metylocelulozy na czystym szkiełku konfokalnym.

Umieść kroplę świeżej metylocelulozy i użyj końcówki mikroładowarki, aby zamontować zarodek umieszczony grzbietowo, uważając, aby nie dotknąć go bezpośrednio szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 na 25. Przykryj zarodek i w razie potrzeby użyj szkiełka nakrywkowego, aby manipulować zarodkiem. Aby zobrazować zarodek, użyj obiektywu z suchą soczewką 20x.

Aby ustawić ostrość na obiekcie, naciśnij przycisk L 100 na mikroskopie, a następnie wybierz przycisk ustawień konfokalnych. Kliknij przycisk automatycznie i wybierz CFP dla kanału pierwszego, GFP dla kanału drugiego i RFP lub M cherry dla kanału trzeciego. Następnie zamknij okno.

Włącz kanały drugi i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady. Następnie kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć skanowanie. Po dostosowaniu ustawień uchwyć żądane obrazy i zapisz je w formacie oprogramowania konfokalnego, a także w formacie TIF do przetwarzania obrazu według kanału.

Aby przeprowadzić obrazowanie CFP, wyłącz kanał drugi i trzeci oraz włącz kanał pierwszy bez zmiany obszaru ostrości. Dostosuj ponownie ustawienia skanowania przed zrobieniem zdjęć, zapisz obrazy zgodnie z opisem i przeprowadź przetwarzanie obrazu zgodnie z opisem panoramowania i współpracowników, jak pokazano poniżej. Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą całego niebieskiego barwienia Mount Sian była nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki mekla i powszechnie stosowana do wizualizacji końcowej organizacji komórkowej w celu dalszej analizy rozwijających się chondrocytów w czasie.

Wykorzystując SOX 10 kda, linie transgeniczne wykorzystano do badania migracji komórek, konwergencji i ekspansji w żywych zarodkach przy użyciu obrazowania na żywo linii transgenicznej zebra bow. Dalsze badania nad organizacją chondrocytów w strukturze szkieletu twarzoczaszki C ujawniają proces łączenia i wydłużania chondrocytów, który pośredniczy w wydłużaniu i wzroście chrząstki meckla. Ten rysunek przedstawia dolną szczękę z UI zebra bow M Sox 10 ERT dwa transgeniczne zarodki Cree między 3D PF a pięć dni po zapłodnieniu.

Dolna szczęka jest najlepiej zobrazowana brzusznie, aby umożliwić wyraźny widok organizacji komórek w chrząstce meles, jak pokazano tutaj. Stabilnie utrzymane i odziedziczone kolory umożliwiają łatwe śledzenie linii i mapowanie losu komórek grzebienia nerwowego czaszki. Pojedyncza niebieska komórka wydaje się migrować i interpolować z sąsiednimi komórkami, a następnie wydłuża się wzdłuż przedniej tylnej osi, tworząc jednolicie ukształtowane miejsce chindry, zachowując w ten sposób globalny kształt chrząstki meles, gdy rozciąga się do przodu.

Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rozwojem kotów do zbadania chondro w tworzeniu szkieletów danio pręgowanego.