Name: Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji interkalacji chondrocytów w chrząstce twarzoczaszki Danio rerio przy użyciu analizy klonalnej Zebrabow. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych zachowań komórkowych podczas formowania narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Alexowi Schierowi za uprzejme udostępnienie linii transgenicznej Zebrabow-M, Geoffreyowi Burnsowi za wektor pDEST i Renee Ethier-Daigle za doskonałą opiekę nad obiektem i liniami rybnymi.
Finansowania:
Jesteśmy wdzięczni za hojne wsparcie finansowe ze strony NIDCR RO3DE024490 i Shriners Hospitals for Children (E.C.L.) oraz stypendia podoktorskie ze Szpitali Dziecięcych Shriners (L.R. i Y.K.).

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zatwierdził wszystkie procedury zgodnie z protokołem numer #2010N000106. Jest to zgodne z wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).
1. Przygotowanie odczynników i materiałów
<ol>
	<li>Przygotować 1 l pożywki dla zarodków 50X E3 (patrz Tabela 1) i przygotować 1 l pożywki dla zarodków 1X E3 (patrz Tabela 2).</li>
	<li>Przygotować pożywkę zarodkową E3 z N-fenylotiomocznikiem (PTU), dodając 30 mg PTU do 1 l 1X E3. Wymieszaj O/N, aby upewnić się, że PTU całkowicie się rozpuścił. Sklep w RT.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór pronazy, rozcieńczyć 150 μl pronazy (0,5 mg/ml) w 15 ml 1X E3. Ta ilość wystarcza na 1 szalkę Petriego. Zużyć natychmiast.</li>
	<li>Przygotować roztwór metylocelulozy.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór E3-tricaine, mieszając 75 ml 0,2% tricainy z 25 ml 1X E3. Zagotować 3 g metylocelulozy w 75 ml roztworu E3-trikainy.</li>
		<li>Uzupełnić końcową objętość do 100 ml roztworem E3-trikainy. Końcowy roztwór metylocelulozy jest lepki i nieprzezroczysty z żółtawym odcieniem. Przechowywanie: RT chronione przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór podstawowy i indukcyjny tamoksyfenu
	<ol>
		<li>Przygotować 5 mM roztwór podstawowy tamoksyfenu, rozpuszczając 4-hydroksytamoksyfen w 100% etanolu. Przechowywać zapasy w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować świeże rozcieńczenie tamoksyfenu o pożądanym stężeniu w 1X E3 w celu otrzymania roztworu indukcyjnego. OSTROŻNOŚĆ! Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 l 0,2% tricainy zgodnie z tabelą 3.</li>
	<li>Uzyskaj szkiełka konfokalne. Sklej ze sobą cztery szkła nakrywkowe (18 x 18), aby utworzyć blok, a następnie umieść 2 bloki na szkle nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 w odległości 2 cm od siebie, aby umożliwić zamontowanie zarodka na środku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Linie transgeniczne. 
	UWAGA: Zebrabow-M był hojnym prezentem od laboratorium Alexa Scheera.</li>
	<li>sox10: ERT2-Cre 
	UWAGA: Wygeneruj wektor celowniczy pDestTol2-sox10:ERT2-Cre przy użyciu standardowych metod klonowania molekularnego i komercyjnie uzyskanej technologii klonowania rekombinacyjnego.
	<ol>
		<li>Połącz klon wejściowy 5' (pENTR5'-sox10p) zawierający 7,2 Kb promotora sox10, środkowy klon bramki (pME-ERT2-Cre) i klon wejściowy 3' (pENTR3'-polyA) w reakcji LR z wektorem docelowym soczewki pDestTol2-α-krystalina:YFP.</li>
		<li>Oczyść konstrukcję pDestTol2-sox10:ERT2-Cre. Jednocześnie wstrzyknąć oczyszczony konstrukt (100 ng / μl) z mRNA transpozazy Tol2 (50 ng / μl) do zarodków WT (F0) na etapie jednej komórki.</li>
		<li>Badanie przesiewowe dorosłych założycieli F0 pod kątem transmisji w linii zarodkowej na podstawie silnej żółtej fluorescencji w zarodkach F1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sox10: ERT2-Cre; Zebrałuk-M
	<ol>
		<li>Przeciąć linię Zebrabow-M (2.1.1) z linią transgeniczną sox10:ERT2-Cre.</li>
		<li>Wybierz zarodki wykazujące silną wszechobecną ekspresję RFP i marker soczewki YFP i hoduj je aż do osiągnięcia dorosłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Ustaw kilka par sox10:ERT2-Cre; Transgeniczny danio pręgowany Zebrabow-M między 17:00 a 18:00 w dniu 1.</li>
	<li>Następnego dnia pociągnij za przegrody rano i zbierz jajka około południa.</li>
	<li>Przenieś je na szalki Petriego i dodaj 15 ml roztworu pronazy w celu dechorionacji zarodków.</li>
	<li>Inkubuj zarodki przez 1 do 5 minut, aż około 60% zarodków zostanie zdechorionowanych. Zatrzymaj reakcję poprzez dekantację roztworu pronazy i umyj zarodki 3-4 razy świeżą pożywką E3.</li>
	<li>Inkubuj zdekorionowane zarodki w E3 w temperaturze RT O/N i pozwól im się rozwinąć, aby osiągnąć stadium 10 somitów. Wysiaduj 50-60 zarodków na lęg, aby uniknąć różnego wzrostu rozwojowego.</li>
</ol>
4. Leczenie
<ol>
	<li>Sprawdź stadium rozwoju zarodków pod mikroskopem w polu świetlnym, aby upewnić się, że są na etapie 10 somitów.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem białka czerwonej fluorescencji (RFP) wyizoluj jaskrawoczerwone zarodki.</li>
	<li>Przystąpić do indukcji rekombinacji Cre, dodając 10 μM roztworu hydroksytamoksyfenu do szalki Petriego i inkubując wyizolowane zarodki w temperaturze 28,5 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Zdekantować roztwór tamoksyfenu i kilkakrotnie przemyć zarodki E3, 
	OSTROŻNOŚĆ! Wyrzucić roztwór tamoksyfenu do specjalnego pojemnika na odpady biologiczne.</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C O/N.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną około stadium 28-29 somitów (około 24 godziny po zapłodnieniu), inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 °C w roztworze E3-PTU. 
	UWAGA: PTU jest tutaj stosowany w celu zahamowania powstawania melanoforów w rozwijających się zarodkach. Zabieg ten jest konieczny, aby uniknąć zniekształcenia sygnału fluorescencji przez autofluorescencyjne melanofory.</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C</li>
</ol>
5. Selekcja zarodków
<ol>
	<li>Aby uwidocznić w pełni rozwinięte struktury twarzoczaszki, wybierz zarodki po 4 dniach od zapłodnienia pod kątem intensywności pozytywnego sygnału czerwonego i markera ekspresji Cre (żółty w siatkówce).</li>
	<li>Znieczulić zarodki roztworem E3/0,015% tricainy. Znieczulenie potwierdza się, gdy podczas delikatnego szturchania zarodka nie obserwuje się żadnych aktywnych ruchów ani aktywności płetwy.</li>
</ol>
6. Montaż zarodka w metylocelulozie
<ol>
	<li>Przenieś wybrany zarodek do obrazowania na szalkę Petriego zawierającą kroplę metylocelulozy i delikatnie zabalsamuj zarodek metylocelulozą.</li>
	<li>Na czystym szkiełku konfokalnym umieść kroplę świeżej metylocelulozy i zamontuj zarodek w kropli za pomocą końcówki do mikroładowania. Ułóż zarodek grzbietowo, uważając, aby nie dotykać zarodka bezpośrednio.</li>
	<li>Przykryj zamontowany zarodek szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 x 25 i w razie potrzeby dostosuj położenie zarodka, manipulując szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.</li>
</ol>
7. Analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Użyj obiektywu z suchą soczewką 20x (apertura numeryczna 0,75; rozmiar otworu 2,0 μm) do ustawiania ostrości zarodka.</li>
	<li>Naciśnij przycisk L100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu.</li>
	<li>Wybierz przycisk konfiguracji konfokalnej i kliknij "auto" i wybierz następujące kanały przed zamknięciem okna: Ch1: CFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP lub mCherry</li>
	<li>Włącz Ch2 i Ch3 przed kliknięciem przycisku "usuń blokadę". Kliknij "odtwórz", aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Skoncentruj się na interesującej nas strukturze, co najlepiej zrobić, zaczynając od 1/2 klatki/s i wysokiego napięcia (HV) 150, a następnie odpowiednio dostosowując ustawienia, aż do uzyskania pożądanej jakości obrazu. Zapytanie ofertowe byłoby jaśniejsze niż inne kolory, dlatego dostosuj HV. Zmień położenie Z, aby znaleźć zarówno dodatnie komórki YFP, jak i RFP.</li>
	<li>Po ustawieniu ustawień uchwyć obraz swojego zarodka. Zapisz swoje zdjęcie w formacie oprogramowania do obrazowania konfokalnego i formacie TIFF w celu przetwarzania obrazu w każdym podzielonym kanale.</li>
	<li>Następnie, w przypadku obrazowania CFP, wyłącz Ch2 i Ch3 i włącz Ch1. Dostosuj ponownie ustawienia, jak w kroku 5, bez zmiany obszaru ostrości. 
	UWAGA: CFP może być naprawdę trudny do wykrycia ze względu na sygnał tła w niebieskim kanale, który można obejść, dostosowując rozmiar otworka. Większy rozmiar otworka pozwala na lepsze wykrywanie fluorescencji poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu tła. Jednak większy otwór zmniejszy efekt konfokalny, pogarszając jakość obrazu. Dlatego konieczne jest staranne dostosowanie ustawień, aby osiągnąć pożądaną jakość i intensywność obrazu.</li>
	<li>Przechwyć obraz i zapisz go w obu formatach (oprogramowanie konfokalne i TIFF) w celu przetworzenia obrazu. Obrazy mogą być następnie przetwarzane za pomocą popularnego oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu scalenia warstw i poprawy ustawień kolorów, zgodnie z opisem Pan i współpracowników 8.</li>
</ol>

<ol><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li>
<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10%3A+kaede+zebrafish+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+craniofacial+surgery%22%5BJournal%5D)">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li>
<li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10%3A+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).</li>
<li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research%5BTitle%5D)+AND+%22Part+C%2C+Embryo+today+%3A+reviews%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li>
<li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+education+and+CPD%3A+are+you+being+served%5BTitle%5D)+AND+%22British+dental+journal%22%5BJournal%5D)">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li>
<li>Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li>
<li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726(2014).</li>
<li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia%3A+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li>
<li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Alcian blue i fotokonwertowalne linie transgeniczne, jak opisano powyżej, uzupełniają się nawzajem, aby zdefiniować skomplikowany proces rozwoju chrząstki i kości. Jednak żywa migracja i organizacja komórek podczas organogenezy od dawna była hipotezą i pośrednio wykazywaną, ale nigdy nie wizualizowano. Linia transgeniczna Zebrabow-M w połączeniu z specyficznym dla chrząstki Cre pozwala na jednoczesną obserwację na żywo wszystkich tych odrębnych zdarzeń związanych z tworzeniem kości i chrząstek. Technika ta pozwala na bad...

Rozwój twarzoczaszki wymaga złożonych interakcji molekularnych, komórkowych i tkankowych, które napędzają proliferację, migrację i różnicowanie komórek1,2,3. Ten ściśle regulowany i złożony proces podlega perturbacjom genetycznym i środowiskowym, tak że deformacje twarzoczaszki należą do najczęstszych wad wrodzonych1-9. Podczas gdy interwencje chirurgiczne pozostają podstawą leczenia anomalii twarzoczaszki, zrozumienie podstaw rozwoju jest niezbędne do wprowadzania innowacji w przyszłych terapiach. W związku z tym badanie morfogenezy i mechanizmów konwergencji i wydłużania oraz integracji komórek dostarcza nowych informacji na temat powstawania szkieletu twarzoczaszki1.
Grzebień nerwowy czaszki migruje i wypełnia pierwszy łuk gardłowy, a następnie tworzy parzyste wyrostki żuchwowe, które rozciągają się, tworząc chrząstkę Meckla, która zapowiada żuchwę. Morfogeneza chrząstki Meckla wymaga organizacji chondrocytów poprzez kierunkową proliferację, polaryzację i różnicowanie komórek1,10. Jednak zawiłość organizacji chondrocytów we wzroście i wydłużaniu chrząstki Meckla pozostaje niejasna. Zrozumienie dynamicznego zachowania komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wrodzonych wad rozwojowych wpływających na rozmiar żuchwy, takich jak hipoplastyczne fenotypy żuchwy11.
Zarodki danio pręgowanego oferują wiele korzyści rozwojowych i genetycznych do szczegółowego badania morfogenezy chrząstki Meckela. Ich podatność genetyczna, przezroczystość, ex vivo i szybki rozwój są potężnymi zaletami, które dobrze nadają się do obserwacji ruchu i organizacji komórek za pomocą obrazowania na żywo6. Korzystając z narzędzi do śledzenia linii, takich jak linia transgeniczna sox10:kaede, my i inni określiliśmy pochodzenie grzebienia nerwowego embrionalnego szkieletu twarzoczaszki1,5. Korzystając z sox10:ERT2-Cre z linią transgeniczną ubi:Zebrabow-M, możliwe jest teraz badanie szczegółów ruchów komórkowych podczas rozwoju twarzoczaszki. Zebrabow-M to transgeniczna linia zaprojektowana z promotorem ubikwityny napędzającym ekspresję różnych fluoroforów, z których każdy jest otoczony miejscami Lox8. Domyślny fluorofor Zebrabow-M to czerwony, wyrażający RFP. Po indukcji ekspresji Cre konstrukt Zebrabow-M ulega rekombinacji, a komórki wyrażają kombinację różnych fluoroforów (RFP, CFP i YFP), tworząc wielospektralną ekspresję w zarodku. Wszystkie komórki potomne, które dzielą się z oznakowanych komórek po zdarzeniu rekombinacji, są następnie znakowane klonalnie, tak że populacje komórek, które pochodzą z różnych zestawionych komórek progenitorowych, są znakowane klonalnie. Poprzez to znakowanie komórek klonowania można śledzić proliferację i migrację komórek z rozdzielczością klonalną (ryc. 1 i 2).

<table><tbody><tr><td>Pronase</td><td>Roche Life Sciences</td><td>10165921001</td><td>Prepare 500 &mu; l podwielokrotności zapasów przy 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-fenylotiomocznik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7619</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>4-HydoxyTamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T176</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>25 x 25 szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540C</td><td></td></tr><tr><td>pENTR5'-TOPO TA Technologie</td><td>klonowania Life&nbsp;</td><td>K591-20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania pENTR/D-TOPO&NBSP;</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR3'-pA</td><td>Tol2Kit</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>pDEST</td><td></td><td></td><td>Prezent od Geoffrey Burns</td></tr><tr><td>labs Mikroskop jasnego pola&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>konfokalny</tr><tr><td>Oprogramowanie do</td><td></td><td></td><td></td> przetwarzania obrazu</tr></tbody></table>

wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych zebrabow w embrionalnej chrząstce meckla

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Rozwój struktur twarzoczaszki kręgowców wymaga precyzyjnej koordynacji migracji komórek, proliferacji, adhezji i różnicowania. Modelowanie chrząstki Meckla, pierwszej pochodnej łuku gardłowego, obejmuje migrację komórek grzebienia nerwowego czaszki (CNC) oraz postępujące dzielenie, proliferację i organizację zróżnicowanych chondrocytów. Kilka badań opisało migrację CNC podczas morfogenezy żuchwy, ale szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób chondrocyty osiągają organizację we wzroście i wydłużaniu chrząstki Meckla, pozostają niejasne. Ograniczona sox10 i chemicznie indukowana rekombinacja za pośrednictwem rekombinazy Cre generuje permutacje różnych białek fluorescencyjnych (RFP, YFP i CFP), tworząc w ten sposób wielospektralne znakowanie komórek progenitorowych i ich potomstwa, odzwierciedlając odrębne populacje klonów. Korzystając z konfokalnej fotografii poklatkowej, można zaobserwować zachowanie chondrocytów podczas rozwoju chrząstki Meckla danio pręgowanego.
Wielospektralne znakowanie komórek umożliwia naukowcom zademonstrowanie rozszerzenia chondrocytów Meckla. Podczas fazy wydłużania chrząstki Meckla, która poprzedza żuchwę, chondrocyty interkalują, aby uzyskać rozszerzenie, gdy układają się w zorganizowany rząd warstw jednokomórkowych. Niepowodzenie tego zorganizowanego procesu interkalacji w pośredniczeniu w wydłużaniu komórki dostarcza mechanistycznego wyjaśnienia hipoplastycznej żuchwy, które obserwujemy w wadach rozwojowych żuchwy.

Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą barwienia całych preparatów błękitem Alcianem była nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki Meckla i jest powszechnie stosowana do wizualizacji ostatecznej organizacji komórkowej12 (Rysunek 1A). Aby dalej analizować rozwijające się chondrocyty w czasie, śledzenie linii komórkowych z wykorzystaniem linii transgenicznych sox10:Kaede umożliwiło nam badanie migracji, konwergencji i ekstensji komórek w żywych embrionach2,12(...

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wizualizacja rozmieszczenia i rozrastania się chondrocytów za pomocą clonalnej analizy komórek zebra bow. Osiąga się to poprzez wygenerowanie linii zebra bow M z konstruktem SOX 10 ERT2 Cre w celu uzyskania tkankowo swoistej rekombinacji w chrząstkach kranialno-twarzowych embrionów do analizy klonalnej. Następnie embriony poddaje się impulsowej ekspozycji na tamoksyfen w stadium 10-somitu przez trzy godziny, aby wywołać proces rekombinacji.Następnie wybierane są embriony wykazujące aktywność CRE oraz silną ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), a następnie są one montowane w celu obrazowania chrząstki kraniofacialnej C. Wyniki przedstawiają wielospektralną analizę komórkową chondrocytów kraniofacialnych opartą na obrazowaniu konfokalnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie S w kolorze niebieskim lub linie transgeniczne, np. so i GFP lub SOX i kde, jest to, że zebra bow pozwala nam na specyficzną obserwację i śledzenie klonalnych populacji komórek biorących udział w formowaniu narządu.Aby przygotować się do zbioru embrionów w pierwszym dniu, należy umieścić kilka par samców i samic transgenicznych danio pręgowanych sox, 10 ERT two Cree zebra bow M w podzielonych zbiornikach do tarła między godziną 17:00 a 18:00. Następnego dnia, po zweryfikowaniu pod mikroskopem świetlnym, że embriony osiągnęły stadium 10 blastomerów, należy poddać je obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem RFP. Wyizoluj intensywnie czerwone embriony i przenieś je do nowej szalki Petriego z nowym medium E3, aby wywołać rekombinację Cree. Do szalki Petriego dodaj 10 µM roztworu hydroksytamoksifenu i inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C przez trzy godziny.Następnie zlej roztwór Tamoksyfenu do pojemnika na odpady biologiczne i kilkukrotnie przemyj zarodki medium E3. Po inkubacji zarodków przez noc do stadium 28–29 somytów, przenieś je do roztworu E3 z PTU i umieść ponownie w inkubatorze. Aby zwizualizować w pełni rozwinięte struktury kraniofacjalne, wybierz zarodki w 4. dniu po zapłodnieniu (DPF) wykazujące intensywny czerwony sygnał oraz żółtą ekspresję Cree w siatkówce. Po znieczuleniu zarodka w tricainie, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś go do szalki Petriego zawierającej kroplę metylocelulozy na czystym szkiełku do mikroskopu konfokalnego.Nanieś kroplę świeżej metylocelulozy i za pomocą końcówki micro loader zamocuj embrion w pozycji grzbietowej, dbając o to, aby nie dotknąć go bezpośrednio szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 by 25. Przykryj embrion, a w razie potrzeby użyj szkiełka nakrywkowego do jego manipulacji. Do obrazowania embrionu użyj suchego obiektywu 20 x.Aby ustawić ostrość na badanym obiekcie, naciśnij przycisk L 100 na mikroskopie, a następnie wybierz przycisk konfiguracji konfokalnej. Kliknij auto i wybierz CFP dla kanału pierwszego, GFP dla kanału drugiego oraz RFP lub M cherry dla kanału trzeciego. Następnie zamknij okno.Włącz kanały drugi i trzeci przed kliknięciem przycisku usuwania blokady (remove interlock). Następnie kliknij play, aby rozpocząć skanowanie. Po dostosowaniu ustawień zarejestruj pożądane obrazy i zapisz je w formacie oprogramowania konfokalnego, a także w formacie TIF w celu późniejszego przetwarzania obrazów z poszczególnych kanałów.Aby przeprowadzić obrazowanie CFP, wyłącz kanały drugi i trzeci oraz włącz kanał pierwszy, nie zmieniając obszaru ogniskowania. Przed wykonaniem zdjęć ponownie dostosuj ustawienia skanowania, zapisz obrazy w opisany wyżej sposób i przeprowadź przetwarzanie obrazów zgodnie z metodą opisaną przez Pana i współpracowników, jak pokazano tutaj. Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą barwienia całego preparatu błękitem Alcian jest nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki Meckla i jest powszechnie stosowana do wizualizacji końcowej organizacji komórkowej w celu dalszej analizy linii rozwojowych chondrocytów w czasie.Wykorzystanie transgenicznych linii SOX 10 kda służyło do badania migracji komórek oraz konwergencji i ekstensji w żywych embrionach przy użyciu obrazowania na żywo transgenicznej linii zebra bow m. Dalsze badanie organizacji chondrocytów w strukturze szkieletu kraniofacialnego C ujawnia proces interpolacji i wydłużania się chondrocytów, który pośredniczy w ekstensji i wzroście chrząstki Meckela. Rysunek ten przedstawia dolną szczękę z embrionów transgenicznych UI zebra bow M Sox 10 ERT dwa Cree między 3 dpf a 5 dniami po zapłodnieniu.Żuchwę najlepiej obrazować od strony brzusznej, aby uzyskać wyraźny wgląd w organizację komórek w chrząstce meles, jak pokazano tutaj. Stabilnie utrzymywane i dziedziczone kolory umożliwiają łatwe śledzenie linii komórkowych oraz mapowanie losów komórek grzebienia nerwowego czaszki. Pojedyncza niebieska komórka wydaje się migrować i interpolować z sąsiednimi komórkami, a następnie wydłuża się wzdłuż osi przednio-tylnej, tworząc jednorodnie ukształtowane miejsce chondrogenezy, utrzymując w ten sposób globalny kształt chrząstki meles w miarę jej rozciągania się ku przodowi.Technika ta otwiera badaczom zajmującym się rozwojem tkanek chrzęstnych możliwość analizy chondrocytów w procesie formowania szkieletu u danio pręgowanego.

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Przedstawiamy protokół do preparowania i hodowli embrionalnych kości śródstopia z dnia 15 (E15). Ten wysoce fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego ex vivo zapewnia warunki bliższe sytuacji in vivo niż komórki w hodowli jednowarstwowej lub 3D i jest niezbędnym narzędziem do badania wzrostu i rozwoju kości.

Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego

Opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia u myszy Rosa26tdtomato (wszechobecne w wszystkich komórkach)/Cre (specyficznie wyrażane w chondrocytach): jeden z 2.3Col1a1-GFP (specyficzny dla osteoblastów) i jeden z immunofluorescencją (specyficzny dla komórek kostnych). Dane wskazują na bezpośrednią transformację chondrocytów w komórki kostne.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.

Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Aby lepiej zrozumieć reakcję chondrocytów na mechaniczne przeciążenie chrząstki, protokół opisuje rozwój modelu wpływu chrząstki ex vivo, który był subletalny przez 24 godziny.

In vitro Model wpływu do generowania subletalnego uszkodzenia chondrocytów w eksplantatach chrząstki bydlęcej

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania metylacji DNA na podstawie plamy punktowej 5-metylocytozyny (5-mC). Określiliśmy poziomy 5-mC podczas dedyferencjacji chondrocytów. Ta prosta technika może być wykorzystana do szybkiego określenia fenotypu chondrocytów w leczeniu ACI.

Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

Poznaj metodę wizualizacji interkalacji chondrocytów w chrząstce twarzoczaszki Danio rerio przy użyciu analizy klonalnej Zebrabow. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych zachowań komórkowych podczas formowania narządów.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Przeglądaj więcej filmów