Name: Kwantyfikacja danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą MAPS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą oprogramowania MAPS. Technika ta umożliwia analizę rozkładu pierwiastków i stosunków stechiometrycznych w próbkach biologicznych i materiałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy finansowanie z Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w ramach umowy DE-EE0005948. Wykorzystanie Center for Nanoscale Materials i Advanced Photon Source, obu obiektów użytkowych Office of Science, było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, w ramach umowy nr 1. DE-AC02-06CH11357. Materiał ten opiera się na pracach wspieranych częściowo przez National Science Foundation (NSF) i Departament Energii (DOE) pod numerem NSF CA. EWG-1041895. Montaż wideo został wykonany przez VISLAB na Uniwersytecie Stanowym Arizony. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają opinie NSF lub DOE. T.N. jest wspierany przez stypendium IGERT-SUN ufundowane przez National Science Foundation (nagroda 1144616).

<ol><li>Geraki, K., Farquharson, M. J., Bradley, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+fluorescence+and+energy+dispersive+x-ray+diffraction+for+the+quantification+of+elemental+concentrations+in+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray fluorescence and energy dispersive x-ray diffraction for the quantification of elemental concentrations in breast tissue.</a> Phys. Med. Biol. 49, 99-110 (2004).</li>
<li>Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+fluorescence+microprobe+imaging+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine.</a> J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).</li>
<li>Twining, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Trace+Elements+in+Individual+Aquatic+Protist+Cells+with+a+Synchrotron+X-ray+Fluorescence+Microprobe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying Trace Elements in Individual Aquatic Protist Cells with a Synchrotron X-ray Fluorescence Microprobe.</a> Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).</li>
<li>de Jonge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+elemental+microtomography+of+Cylotella+meneghiniana+at+400-nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D elemental microtomography of Cylotella meneghiniana at 400-nm resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (36), 15676-15680 (2010).</li>
<li>Duĉić, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+in+statistical+and+image+analysis+for+in+situ+%C2%B5SXRF+studies+of+elemental+distribution+and+co-localization%2C+using+Dioscorea+balcanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Rad%22%5BJournal%5D)">Enhancement in statistical and image analysis for in situ µSXRF studies of elemental distribution and co-localization, using Dioscorea balcanica.</a> J. Synchrotron Rad. 20, 339-346 (2013).</li>
<li>Kemner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+and+Redox+Analysis+of+Single+Bacterial+Cells+by+X-ray+Microbeam+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elemental and Redox Analysis of Single Bacterial Cells by X-ray Microbeam Analysis.</a> Science. 306 (5696), 686-687 (2004).</li>
<li>Bertoni, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c1ee02083h/unauth#!divAbstract">Nanoprobe X-ray fluorescence characterization of defects in large-area solar cells.</a> Energy Environ. Sci. 4 (10), 4252-4257 (2011).</li>
<li>Fenning, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3575583?journalCode=apl">Iron distribution in silicon after solar cell processing: Synchrotron analysis and predictive modeling.</a> Appl. Phys. Lett. 98 (162103), (2011).</li>
<li>Buonassisi, T., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1997274">Quantifying the effect of metal-rich precipitates on minority carrier diffusion length in multicrystalline silicon using synchrotron-based spectrally resolved x-ray beam induced current.</a> Appl. Phys. Lett. 87 (044101), (2005).</li>
<li>Stuckelberger, M. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-materials-research/article/engineering-solar-cells-based-on-correlative-xray-microscopy/92322302DC0E494903FC457912ACE9A3">Engineering solar cells based on correlative X-ray microscopy.</a> J. Mat. Res. 32 (10), 1825-1854 (2017).</li>
<li>Streeck, C., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4821267?journalCode=apl">Grazing-incidence x-ray fluorescence analysis for non-destructive determination of In and Ga depth profiles in Cu(In,Ga)Se2 absorber films.</a> Appl. Phys. Lett. 103 (113904), (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.chemmater.6b02065">Spatially Heterogeneous Chlorine Incorporation in Organic-Inorganic Perovskite Solar Cells.</a> Chem. Mater. 28, 6536-6543 (2016).</li>
<li>Stuckelberger, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/abstract/document/7790832/">Charge Collection in Hybrid Perovskite Solar Cells: Relation to the Nanoscale Elemental Distribution.</a> IEEE J. Photovolt. 7 (2), 590-597 (2017).</li>
<li>Vogt, S., Maser, J., Jacobsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+for+X-ray+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+IV+France%22%5BJournal%5D)">Data analysis for X-ray fluorescence imaging.</a> J. Phys. IV France. 104, 617-622 (2003).</li>
<li>Applied X-ray Optics: AXO Dresden. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://axo-dresden.de/mainframe_products.htm">http://axo-dresden.de/mainframe_products.htm</a> (2017).</li>
<li>West, B. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211285516305754">Grain engineering: How nanoscale inhomogeneities can control charge collection in solar cells.</a> Nano Energy. 32, 488-493 (2017).</li>
<li>Krause, M. O. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.555594">Atomic Radiative and Radiationless Yields for K and L Shells.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 8 (2), 307-327 (1979).</li>
<li>Hubbell, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.555955">A Review, Bibliography, and Tabulation of K,L, and Higher Atomic Shell X-Ray Fluorescence Yields.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 23 (2), 339-364 (1994).</li>
<li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATHENA%2C+ARTEMIS%2C+HEPHAESTUS%3A+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Rad%22%5BJournal%5D)">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> J. Synchrotron Rad. 12, 537-541 (2005).</li>
<li>West, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+fluorescence+at+nanoscale+resolution+for+multicomponent+layered+structures%3A+a+solar+cell+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Rad%22%5BJournal%5D)">X-ray fluorescence at nanoscale resolution for multicomponent layered structures: a solar cell case study.</a> J Synchrotron Rad. 24, (2017).</li>
<li>De Boer, D. K. G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/xrs.1300190312/abstract">Calculation of X-Ray Fluorescence Intensities from Bulk and Multilayer Samples.</a> X-Ray Spectrom. 19 (3), 145-154 (1990).</li>
<li>Lachance, G. R., Claisse, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLachance%2C+GR+%22Quantitative+X-ray+Fluorescence+Analysis%3A+Theory+and+Application%22">Quantitative X-ray Fluorescence Analysis: Theory and Application</a>. , John Wiley & Sons. (1995).</li>
<li>Sokaras, D., Karydas, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Fluorescence+Enhancement+in+Confocal+X-ray+Microscopy+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary Fluorescence Enhancement in Confocal X-ray Microscopy Analysis.</a> Anal. Chem. 81 (12), 4946-4954 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rysunki pokazują, jak ważne jest dopasowanie danych za pomocą tej procedury. Rysunki 1 (po prawej) i 2 (u dołu) pokazują reprezentatywny wynik, który powinien wynikać z prawidłowego dopasowania. Jeśli dopasowanie jest niewystarczające, obraz integralnego widma będzie wyglądał zauważalnie inaczej, a wynikowe dane ilościowe będą zawierały błędy, chociaż w większości przypadków będą one trudne do wykrycia. W przypadku niektórych typów próbek, dla których norma nie jest reprezentatywna dla pierwiastków w pró...

Synchrotronowy XRF jest używany w wielu dyscyplinach od wielu dziesięcioleci. Na przykład, został on wykorzystany w biologii w badaniach takich jak to przeprowadzone przez Geraki i wsp., w których określili ilościowo śladowe ilości stężeń metali w rakowej i nienowotworowej tkance piersi 1. Mówiąc bardziej ogólnie, ilościowy XRF został zastosowany w szerokim zakresie badań biologicznych dotyczących stężeń metali w komórkach i tkankach, jak opisali Paunesku i wsp.2. Podobnie, protisty morskie były badane pod kątem pierwiastków śladowych 3,4, a nawet zaobserwowano rozkład mikro- i makroskładników odżywczych w komórkach roślinnych 5. Praca Kemnera i wsp.6, który zidentyfikował wyraźne różnice w morfologii i składzie pierwiastkowym w pojedynczych komórkach bakteryjnych, był również możliwy dzięki ilościowej analizie XRF. Dodatkowo, co jest szczególnie istotne dla przykładu przedstawionego w niniejszym dokumencie, materiałoznawcy badający urządzenia z ogniwami słonecznymi wykorzystali XRF o wysokiej rozdzielczości do badań nad istnieniem submikronowych zanieczyszczeń metalami w półprzewodnikach krzemowych 7,8, korelacyjne prace nad tym, jak rozkłady pierwiastków wpływają na wydajność elektryczną w urządzeniach solarnych 9,10oraz identyfikacja gradientów zależnych od głębokości cienkowarstwowych ogniw słonecznych CIGS za pomocą fluorescencji rentgenowskiej (GIXRF) 11.
Wiele z tych badań wykorzystuje nie tylko możliwości synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości do badania rozkładu przestrzennego, ale także kwantyfikację informacji do wyciągania wniosków numerycznych. W wielu badaniach kluczowe znaczenie ma znajomość stężeń pierwiastków związanych z wyżej wymienionymi rozkładami przestrzennymi. Na przykład w pracy Geraki i wsp. badanie wymagało ilościowego określenia różnicy w stężeniach żelaza, miedzi, i potasu w rakowych i nienowotworowych tkankach piersi, aby lepiej zrozumieć, jakie stężenia stają się szkodliwe dla tkanek ludzkich 1. Podobnie praca Luo i wsp. wykorzystano ilościowo określony XRF do identyfikacji niewielkich ilości chloru zawartego w perowskitowych ogniwach słonecznych podczas syntezy zarówno z prekursorami zawierającymi chlor, jak i bez nich 12. Dlatego w przypadku niektórych badań, w których potrzebne są stężenia pierwiastków, właściwym krokiem jest właściwa kwantyfikacja.
Proces ilościowego określania stężeń pierwiastków na podstawie pomiarów fluorescencji rentgenowskiej (XRF) przekształca intensywność fluorescencji na stężenia masowe (np. μg/cm2). Widma surowe przedstawiają liczbę fotonów zebranych przez detektor fluorescencji dyspersyjnej energii w funkcji energii. Widma są najpierw dopasowywane, a następnie porównywane ze standardowym pomiarem w celu obliczenia danych ilościowych. W szczególności pierwszy etap dopasowania widm fluorescencyjnych ma kluczowe znaczenie nawet dla analizy jakościowej pierwiastków. Dzieje się tak, ponieważ przed dopasowaniem zliczenia są kategoryzowane na podstawie ich energii, co staje się problemem, gdy w próbce znajdują się dwa pierwiastki o podobnych przejściach fluorescencyjnych. W takiej sytuacji liczniki mogą być nieprawidłowo skażone do koszy, a tym samym skojarzone z niewłaściwym elementem.
Często konieczne jest również ilościowe określenie widm XRF, aby dokładnie wyciągnąć wnioski na temat względnych ilości pierwiastków w próbce. Bez odpowiedniej kwantyfikacji, liczby ciężkich i lżejszych pierwiastków będą porównywane bezpośrednio, ignorując różnice w przekroju czynnym przechwytywania, prawdopodobieństwie absorpcji i fluorescencji, tłumieniu fotonów fluorescencyjnych oraz odległości krawędzi absorpcji pierwiastka od padającej energii, które wpływają na liczbę fotonów uderzających w detektor. W związku z tym proces dopasowywania widm do każdej mapy i porównywania natężeń pików ze wzorcem, które są wykonywane w poniższej procedurze, ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji każdego ze stężeń pierwiastków.
Pokazujemy, jak przeliczyć surowe liczby fotonów fluorescencji na jednostki mikrogramów na centymetr kwadratowy (μg/cm2), najpierw dopasowując integralne widmo lub zsumowane widmo wszystkich indywidualnych widm wytwarzanych w każdym punkcie pomiarowym lub pikselu na mapie 2D. Widmo to pokazuje względne natężenia różnych pierwiastków zawartych w próbce. Odległość, w jakiej znajduje się krawędź absorpcyjna danego pierwiastka od padającej energii wiązki, wpływa na intensywność ich pików fluorescencji. Ogólnie rzecz biorąc, im bliżej siebie znajdują się te dwie energie, tym większa intensywność wytwarzana dla tych pierwiastków, chociaż nie zawsze tak jest. Rysunek 4 w Ref 13 pokazuje zależność długości absorpcji fotonów promieniowania rentgenowskiego, która bezpośrednio odnosi się do wynikowej intensywności, dla większości pierwiastków w perowskitowym ogniwie słonecznym z jodkiem ołowiu metyloamonu. Pokazuje to reakcję fluorescencyjną pierwiastków w odniesieniu do energii i pokazuje, że nie jest to ciągły spadek odpowiedzi wraz ze wzrostem odległości od padającej energii, ale raczej, że jest ona również zależna od samego pierwiastka.
Wynikiem tej zależności jest to, że surowe stężenia pierwiastków mogą wydawać się wyższe dla kanałów pierwiastków o energiach wzbudzenia bliższych energii padania, nawet jeśli rzeczywiste ilości tych pierwiastków są niższe w stosunku do innych pierwiastków o energiach wzbudzenia dalej od padania. Dlatego zależność energetyczna intensywności, wraz z innymi czynnikami, takimi jak zmiany wydajności fluorescencji, różne krawędzie absorpcji, czułość detektora i tło pomiarowe itp., jest powodem, dla którego dopasowanie danych jest bardzo ważne przed wyciągnięciem wniosków na temat obserwowanych wielkości pierwiastków. Następnie stosujemy algorytm dopasowania do całkowego spektrum, w którym użytkownik definiuje elementy i parametry, które mają pasować, za pomocą dokumentu tekstowego.
Algorytm stworzony przez Vogta i wsp. 14, korzysta z filtrowania regionów zainteresowania (ROI), w którym integruje regiony szczytowe niektórych elementów, oraz analizy głównych składowych (PCA). Po pierwsze, PCA jest wykonywana w celu zidentyfikowania tylko tych elementów i pików, które są bardzo silnie widoczne. Pozwala to na oddzielenie szumu od prawdziwego sygnału. Następnie zidentyfikowane główne składniki są numerycznie określane ilościowo, co jest ważne dla dekonwolucji różnych pików pierwiastków o tej samej energii wzbudzenia, na przykład nakładających się na siebie Au Mα i P Kα. Wreszcie, filtrowanie ROI może być stosowane do danych numerycznych poprzez integrację w określonych regionach.
Aby powiązać liczby ze stężeniami pierwiastków, dobrze określone ilościowo odniesienie (często określane jako "standard") jest mierzone w tych samych warunkach pomiaru, geometrii i energii, co badana próbka. Norma ta często pochodzi z drezdeńskiego AXO lub z Narodowego Instytutu Standaryzacji i Technologii (NIST). Obejmują one wiele różnych elementów i zawierają tabelaryczne rozkłady pierwiastków. Normalizacja zmierzonych liczb próbki będącej przedmiotem zainteresowania do liczb wzorca w tych samych warunkach pomiaru stanowi podstawę do elementarnej kwantyfikacji próbki będącej przedmiotem zainteresowania.
Dokładniej, MAPS identyfikuje elementy i ich stężenia standardu albo na podstawie faktu, że informacje o standardzie są znane programowi (jak to ma miejsce w przypadku standardów AXO i NIST), albo poprzez dane wprowadzone do osobnego pliku (w przypadku użycia innego standardu). Na podstawie tych informacji program odnosi zmierzone intensywności elementów wzorcowych w ustawieniach pomiaru do przewidywanego stężenia osadzonego w MAPS. Następnie tworzy współczynnik skalowania, aby dostosować go do dowolnego przesunięcia i ekstrapoluje ten współczynnik skalowania na wszystkie pozostałe elementy, które nie są uwzględnione w normie. Współczynnik skalowania obejmuje następnie przesunięcie w stosunku do ustawień pomiaru oraz informacje dostarczone w MAPS do liniowego przeliczenia surowych zliczeń na gęstość powierzchniową w μg/cm2.
Tutaj pokazujemy, jak korzystać z programu MAPS, opracowanego przez Dr. S. Vogta, do ilościowego określania danych uzyskanych z linii badawczych zdolnych do fluorescencji w Argonne National Laboratory (ANL) 14. Dane użyte do demonstracji zostały uzyskane w sektorze 2-ID-D ANL przy użyciu konfiguracji pomiarowej pokazanej na rysunku 1 na rysunku 10. Procedura dopasowania może być również zastosowana do danych pobranych z innych linii badawczych, jednak należy pamiętać, że niektóre cechy linii ANL są wbudowane w program i będą wymagały aktualizacji.

kwantyfikacja danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą maps

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kwantyfikacja map mikroskopowych fluorescencji rentgenowskiej (XRF) poprzez dopasowanie surowych widm do znanego standardu jest kluczowa dla oceny składu chemicznego i rozkładu pierwiastków w materiale. XRF oparty na synchrotronie stał się integralną techniką charakteryzacji dla różnych tematów badawczych, szczególnie ze względu na jego nieniszczący charakter i wysoką czułość. Obecnie synchrotrony mogą pozyskiwać dane fluorescencyjne w rozdzielczościach przestrzennych znacznie poniżej mikrona, co pozwala na ocenę zmian składu w nanoskali. Dzięki odpowiedniej kwantyfikacji możliwe jest uzyskanie dogłębnego zrozumienia w wysokiej rozdzielczości segregacji pierwiastków, relacji stechiometrycznych i zachowań grupowych.
Ten artykuł wyjaśnia, jak korzystać z oprogramowania do dopasowania MAPS opracowanego przez Argonne National Laboratory do kwantyfikacji pełnych map XRF 2D. Jako przykład posłużymy się wynikami z ogniwa słonecznego Cu(In,Ga)Se2, wykonanymi na linii badawczej Advanced Photon Source 2-ID-D w Argonne National Laboratory. Pokazujemy standardową procedurę dopasowywania surowych danych, pokazujemy, jak ocenić jakość dopasowania i prezentujemy typowe dane wyjściowe generowane przez program. Ponadto w tym manuskrypcie omawiamy pewne ograniczenia oprogramowania i oferujemy sugestie, jak dalej korygować dane, aby były numerycznie dokładne i reprezentatywne dla przestrzennie rozdzielczych stężeń pierwiastków.

Przykład prawidłowych wyników dopasowania można zobaczyć na poniższych rysunkach. Po pierwsze, na Rysunku 1 przedstawiono bezpośrednie porównanie słabego i dobrego dopasowania widma całkowego. Słabe dopasowanie można poprawić, upewniając się, że nie pominięto żadnych pierwiastków – na przykład miedzi, która posiada wyraźny pik na Rysunku 1 (lewo), ale nie została uwzględniona w dopasowaniu – oraz dostosowując stosunki rozgałęzień...

Tutaj demonstrujemy użycie oprogramowania do montażu fluorescencji rentgenowskiej, MAPS, stworzonego przez Argonne National Laboratory do ilościowego oznaczania danych z mikroskopii fluorescencyjnej. Uzyskane dane ilościowe są przydatne do zrozumienia rozkładu pierwiastków i stosunków stechiometrycznych w badanej próbie.

Kwantyfikacja danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Synchrotronowa fluorescencja rentgenowska jest istotną techniką obserwacji segregacji pierwiastkowej, zależności stechiometrycznych oraz zachowania skupisk w próbkach z wielu dziedzin, w tym biologii, chemii i nauki o materiałach. Informacje uzyskane z tych badań mają charakter jakościowy, dopóki nie zostaną zastosowane odpowiednie procedury ilościowe w celu przeliczenia surowych zliczeń fluorescencji na powierzchniowe masy pierwiastków. Niniejszy film zademonstruje, jak korzystać z programu do analizy ilościowej stworzonego przez Argonne National Laboratory w celu generowania danych numerycznych dla dwuwymiarowych map fluorescencji rentgenowskiej.Aby korzystać z programu MAPS, w pierwszej kolejności należy pobrać oprogramowanie IDL z Internetu. Obecnie można to zrobić, przechodząc na stronę internetową IDL i tworząc konto. Następnie należy wybrać My Account, a potem Downloads, co wyświetli stronę ze wszystkimi dostępnymi programami.Przewiń w dół i wybierz najnowszą wersję IDL. Następnie pobierz MAPS ze strony internetowej Argonne National Laboratory. Po pobraniu i rozpakowaniu folderu zip powinny pojawić się cztery pliki. Compound.dat, henke. xdr, mapy i xrf_library.csv. Trzy pliki, poza mapami, należy skopiować i wkleić do podfolderu IDL o nazwie lib.W przypadku komputerów z systemem Windows folder ten najprawdopodobniej znajduje się w Program Files w katalogu Exelis. Zazwyczaj wygodnie jest uruchamiać dopasowanie z pulpitu, jednak krytyczne jest, aby nazwa folderu i ścieżka dostępu nie zawierały spacji ani znaków specjalnych; w przeciwnym razie program MAPS wyświetli błąd podczas próby wykonania dopasowania. Jeśli ścieżka do pulpitu zawiera spacje, należy umieścić folder w innym miejscu.Na przykład bezpośrednio na dysku C. Na potrzeby tej demonstracji umieszczę folder Fitting Folder oraz ikonę MAPS.sav na pulpicie, aby zapewnić do nich łatwy dostęp.W tym folderze należy umieścić pliki maps_fit_parameters_override.txt oraz maps_settings.txt. Przykłady tych plików są dostępne w dokumentach uzupełniających.Następnie należy utworzyć folder o nazwie mda i wkleić do niego wybrany plik mapy o wysokiej rozdzielczości, który zostanie wykorzystany do wstępnego dopasowania. Dodano również pliki do dopasowania standardowego, które powinny składać się z jednego lub czterech plików, w zależności od liczby elementów detektora używanych przez sektor. Pliki te określają standard.Jeśli użyto standardu AXO, plik powinien zostać nazwany axo_std. mca; w przeciwnym razie, jeśli użyto standardu NIST lub jakiegokolwiek innego standardu, plik może mieć dowolną nazwę kończącą się na mca, ponieważ pliki te zostaną wybrane w późniejszym etapie. W przypadku detektora czterokwadratowego pliki standardu oraz fit_parameter powinny być nazwane w następujący sposób: od mca0 do mca3 oraz od txt0 do txt3, w tym jeden plik fit_parameters kończący się na txt.Następnie sprawdź w pliku ustawień map, czy użyto prawidłowej liczby elementów detektora. W przypadku tego dopasowania wykorzystano jeden element detektora. Po przygotowaniu folderu z dopasowaniem otwórz program MAPS i zmień katalog na folder utworzony przed chwilą na pulpicie.Następnie kliknij OK i przejdź do konfiguracji. Okno konfiguracji zawiera szereg funkcji służących do ustawienia parametrów dopasowania. W pierwszej kolejności wybierz linię wiązki reprezentatywną dla linii wiązki wykorzystanej podczas pomiarów.Jeśli pomiary zostały wykonane w Argonne National Laboratory, linia wiązki powinna odpowiadać bezpośrednio. W przeciwnym razie w manuskrypcie zawarto dodatkowe informacje na temat tego, który wybór należy zastosować. Następnie wybierz plik mda, który zostanie użyty, a potem wpisz energię padającą zastosowaną podczas pomiaru.Wybierz opcję rozpoczęcia przetwarzania i poczekaj, aż program zakończy pracę. Po zakończeniu przejdź do pliku, a następnie wybierz pierwszą opcję. Otwórz średnią obrazu XRF lub pojedynczy element.Program powinien utworzyć serię nowych folderów; należy wybrać folder img, w którym powinny znajdować się wygenerowane pliki fit lub pliki h5. Wybierz plik odpowiadający mapie, a następnie zmień drugie od lewej menu rozwijane na normalizację. W tym przypadku dane są normalizowane względem komory jonizacyjnej dopływowej (USIC).Po wybraniu widoku wielopierwiastkowego (multi element view) zostaną wygenerowane obrazy dla poszczególnych kanałów pierwiastkowych. Jednostki wynoszą teraz mikrogramy na centymetr kwadratowy. Jednak wartości te nie reprezentują jeszcze ilości dopasowanych.Aby opracować dopasowanie, dane analizuje się jako sumę wszystkich widm z każdego piksela mapy, którą można wyświetlić, przechodząc do viewing, plot integral spectrum. Następnie należy przejść do generate output, export raw integrated spectra series long, aby zapisać obraz. Zamknij okno i przejdź do tools, spectrum tool, load spectrum.Zlokalizuj plik, który został właśnie wyeksportowany do folderu wyjściowego. Zazwyczaj sortowanie folderu wyjściowego według daty modyfikacji jest najszybszym sposobem znalezienia plików, ponieważ każde nowe dopasowanie aktualizuje pliki w folderze. Wyeksportowane widmo będzie nazywać się intspec, a następnie nazwa linii wiązki i numer skanu, zakończone rozszerzeniem txt.Po otwarciu widma otwórz plik maps_fit_parameters_override. Najpierw sprawdź, czy liczba elementów detektora jest poprawna. Następnie w linii „elements to fit” (elementy do dopasowania) wymień wszystkie elementy, których spodziewasz się w próbce.Należy zauważyć, że elementy linii L oraz elementy linii M zawierają odpowiednio przyrostki _L lub _M. W tym przypadku wiadomo, że w próbce znajduje się miedź, ale zostanie ona pominięta, aby przedstawić przykład niepełnego dopasowania. Przewiń w dół i wprowadź energię padającą dla energii rozpraszania koherentnego.Następnie w dwóch kolejnych liniach wprowadź maksymalny i minimalny zakres energii, które program będzie wykorzystywał jako granice. Zazwyczaj wystarczający jest zakres od +2 do -2 keV lub od +5 do -5 keV. Dalej upewnij się, że maksymalna i minimalna energia dopasowania obejmują energie interesujących nas pierwiastków.Dodatkowo należy sprawdzić, czy element detektora linii posiada właściwy numer odpowiadający detektorowi germanowemu lub krzemowemu. Na dole pliku znajduje się możliwość zmiany nazw kanałów detektora wykorzystywanych podczas dopasowania. Więcej informacji na temat sposobu ich zmiany opisano bardziej szczegółowo w manuskrypcie.Po wprowadzeniu zmian zapisz dokument. Następnie wybierz analizę, dopasowanie widma (fit spectrum), po czym pojawi się okno. W jego górnej części można ustawić zakres energii dla dopasowania oraz liczbę iteracji wykorzystanych do procesu dopasowywania.Po zmianie zakresu należy wybrać trzeci z czterech przycisków na dole, a program przeprowadzi dopasowanie. W oknie narzędzia spektroskopowego znajduje się seria rozwijanych menu, które umożliwiają wizualizację różnych krzywych. W tych menu należy ustawić jedną opcję na fitted, a pozostałe na none.W dolnym lewym rogu wybranie opcji dodaj element pozwala użytkownikowi przeszukać widmo w poszukiwaniu brakujących pików. Korzystając z plusa i klikając dalej, można zauważyć, że pikiem brakującym w dopasowaniu jest pik miedzi K alpha. W przypadku niektórych pików, zwłaszcza w lewej części obrazu, dopasowanie zdaje się uwzględniać poprawne pierwiastki, jednak linie nadal znacznie odbiegają pod względem natężenia od natężenia widma.Można to poprawić poprzez zwiększenie liczby iteracji. Zazwyczaj co najmniej 50 jest wystarczającą liczbą, aby uzyskać zauważalną różnicę. Po powrocie do pliku fit_parameters, dodaniu miedzi, zapisaniu i ponownym uruchomieniu dopasowania widać, że szczyt jest teraz dobrze dopasowany.Po poszukiwaniu wszystkich pozostałych brakujących elementów dopasowanie wydaje się prawidłowe. W niektórych przypadkach nadal występują piki, dla których linie nie są idealnie dopasowane. Na przykład dwa piki przy 4 keV, odpowiadające liniom Lg1–Lg4 indu, wydają się mieć dopasowany właściwy pierwiastek, jednak proces dopasowywania przypisuje intensywnościom pików wartości wyższe niż te, które faktycznie uzyskano podczas pomiaru.Sytuacja ta występuje najczęściej w przypadku elementów linii L. Wynika to z faktu, że dla elementów linii K w literaturze dostępne są zestawienia stosunków intensywności pików, podczas gdy stosunki wysokości pików dla linii L są znacznie bardziej zależne od energii padania. Aby poprawić dopasowanie tych linii, w pierwszej kolejności w pliku fit_parameters należy utworzyć linię służącą do korekty rodziny rozgałęzień.Liczby te oznaczają intensywności względne w porównaniu do literatury dla rodzin L1, L2 i L3, które w narzędziu spektralnym są przedstawione jako linie żółta, różowa i niebieska. Często liczby te mogą pozostać jako jedynki lub być równe wartościom literaturowym. Zamiast tego zmieniany będzie stosunek dla każdej poszczególnej linii.Przed przystąpieniem do korekty stosunków rozgałęzień dla indu należy zauważyć, że stosunki rozgałęzień dla linii L gamma są wszystkie ustawione na jeden. Analiza widma całego wskazuje, że wartość literaturowa jest zbyt wysoka. Poprzez oszacowanie procentowej różnicy między zieloną a białą linią dla każdej energii, a następnie zmianę stosunku rozgałęzień, zapisanie i ponowne uruchomienie dopasowania, można zaobserwować poprawę dopasowania zielonej linii do białej linii widma.Często proces ten wymaga kilku prób, co jest niezbędne dla zapewnienia dokładności dopasowania. Po zidentyfikowaniu fit_parameters, które zapewniają najlepsze możliwe dopasowanie, przeprowadź proces dopasowania raz jeszcze dla 10 lub 50 K iteracji. Jest to konieczne, ponieważ każde dopasowanie aktualizuje średni, wynikowy plik maps_fit_parameters_override, który będzie plikiem faktycznie zaimplementowanym podczas dopasowania.Po zakończeniu ostatniego dopasowania zamknij okno narzędzia spec. Następnie dodaj _input do pliku maps_fit_parameters i zmień nazwę wynikowego pliku średniego na maps_fit_parameters_override.txt. Po wykonaniu tej czynności wróć do okna konfiguracji i wybierz linię wiązki.Następnie zaznacz opcję „use fitting” i skopiuj oraz wklej wszystkie pliki mda przeznaczone do dopasowania do folderu mda. Używając funkcji „select mda files”, przejrzyj i zaznacz wszystkie pliki do dopasowania. Energia padająca zostanie automatycznie wprowadzona z procesu dopasowania.Po prawej stronie okna, korzystając z symboli plus i minus, przejdź przez listę i zaznacz pola dla pierwiastków zawartych w pliku fit_parameters. Niektóre pierwiastki nie są ujęte w tym polu. Przykładem jest ind nie jest ujęty.Aby dodać ind, zaznacz pole dla dowolnego z pozostałych pierwiastków, których nie będziesz dopasowywać. Następnie w kategorii nazwy ROI zmień nazwę na nazwę potrzebnego pierwiastka. W kolejnym kroku, korzystając z dowolnej bazy danych fluorescencji, na przykład aplikacji Hephaestus, znajdź energię dla głównej linii energetycznej.W tym przypadku chodzi o linię L $\alpha_1$ indu. Kontynuuj przewijanie listy pierwiastków aż do końca, wybierając również S_I, S_E, S_A, TFY oraz tło. W lewym górnym rogu wybierz opcję „right settings to config file”, aby zapisać ustawienia dopasowania do przyszłego użytku.W tym momencie, jeśli do dopasowania ma zostać użyty standard NIST, należy wybrać przycisk odpowiadający numerowi standardu NIST, albo NBS 1832, albo 1833. Następnie należy wybrać nazwę pliku dla standardu z folderu nadrzędnego. Po tej operacji dopasowanie jest gotowe.Należy więc wybrać „start processing”, aby rozpocząć proces. Po zakończeniu dopasowań można je zwizualizować w ten sam sposób co wcześniej, przechodząc do menu „file”, wybierając „open XRF image”, a następnie „average” lub „single element”. Następnie należy przejść do „viewing” i wybrać „multi element view”.Za pomocą elementów wyboru detektorów w prawym dolnym rogu można zmienić analizowane kanały. Na tej podstawie wyświetlane są wartości liczbowe w mikrogramach na centymetr kwadratowy, zgodne z wartościami oczekiwanymi dla próbki. Obliczenia wykorzystane do oszacowania przewidywanych wartości zostały opisane w manuskrypcie.Przykładowo, przedstawiono tutaj dane ilościowe dla głównych pierwiastków ogniwa słonecznego CIGS: miedzi, indu i galu. Ze względu na zastosowaną energię padania, pomiar nie był czuły na pik selenu i nie był w stanie go wykryć, dlatego został on pominięty.Na podstawie tych danych możliwe jest teraz zestawienie rozkładu poszczególnych pierwiastków w próbce, co pozwala na wyciągnięcie wniosków dotyczących rozmieszczenia różnych kationów w ogniwie słonecznym sig wewnątrz urządzenia oraz stopnia ich niejednorodności. Widmo dopasowania dla każdej z map dopasowań można ponownie wyświetlić, przechodząc do opcji viewing, plot integral spectrum. W tym miejscu powinno być widoczne widmo danych w kolorze białym oraz dopasowanie w kolorze.Można tego użyć do sprawdzenia dopasowania dla wszystkich plików danych, aby upewnić się, że proces został prawidłowo zastosowany do każdej mapy. Na koniec, aby wyeksportować dane, należy przejść do sekcji generowania wyników (generate output) i wybrać opcję eksportu (export), a następnie zaznaczyć opcję tworzenia połączonych plików ASCII dla map (make combined ASCII files of maps). Spowoduje to utworzenie pliku Excel zawierającego ilościowe dane fluorescencji dla wszystkich wyświetlanych elementów.Aby zmienić lub dodać elementy, należy użyć opcji wyboru detektorów elementów. Dane można następnie znaleźć w folderze wyjściowym. W niniejszym filmie krok po kroku wyjaśniono, jak korzystać z oprogramowania do dopasowania MAPS, stworzonego przez Argonne National Laboratory, w celu ilościowego oznaczenia danych fluorescencji rentgenowskiej.Choć procedura ta jest bardzo użyteczna w wielu sytuacjach, istnieje wiele szczególnych przypadków i wyzwań, które wymagają dodatkowego rozważenia. Są one opisane poniżej bardziej szczegółowo, a stale wprowadzane ulepszenia mają na celu dalsze zwiększenie dokładności dopasowania widm fluorescencji rentgenowskiej. Niemniej jednak zdolność programu do przekształcania jakościowych, wysokorozdzielczych map fluorescencji 2D w ilościowe, przestrzennie rozdzielone wartości pierwiastkowe zapewnia znaczący wzrost ilości informacji możliwych do uzyskania z tych pomiarów.Mamy nadzieję, że ta demonstracja pomogła w lepszym zrozumieniu procesu ilościowego analizowania danych z mikroskopii fluorescencji rentgenowskiej. Dziękujemy za oglądanie.

quantifying-x-ray-fluorescence-data-using-maps

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Opisujemy nieinwazyjną platformę obrazowania zwierząt, która pozwala na wykrywanie, kwantyfikację i monitorowanie wzrostu i nawrotów raka jajnika. Ten model ksenoprzeszczepu dootrzewnowego naśladuje profil kliniczny pacjentek z rakiem jajnika.

Mysi model do nieinwazyjnego obrazowania w celu wykrywania i monitorowania nawrotu raka jajnika

Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Opisano zastosowanie tomografii rentgenowskiej z dyspersją energii w skaningowym transmisyjnym mikroskopie elektronowym do scharakteryzowania rozkładów pierwiastków w pojedynczych nanocząstkach w trzech wymiarach.

Tomografia rentgenowska z dyspersją energii do mapowania pierwiastkowego 3D pojedynczych nanocząstek

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Ten artykuł opisuje protokół do tworzenia trójwymiarowych map chemicznych łączących obrazowanie z filtrem energii i tomografię elektronową. Zbadano rozkład chemiczny dwóch nośników katalizatora utworzonych przez pierwiastki trudne do odróżnienia za pomocą innych technik obrazowania. Każda aplikacja polega na mapowaniu nakładających się na siebie pierwiastków chemicznych - odpowiednio rozstawionych krawędzi jonizacji.

Uzyskiwanie map chemicznych 3D za pomocą tomografii tomografii mikroskopii elektronowej z filtrowaną transmisją energii

Tutaj prezentujemy protokół dla typowych eksperymentów miękkiej spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego (sXAS) i rezonansowego nieelastycznego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (RIXS) z zastosowaniem w badaniach materiałów akumulatorowych.

Wrażliwe na pierwiastki wykrywanie chemii w bateriach za pomocą miękkiej spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego i rezonansowego nieelastycznego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Opisano konfigurację do pomiarów prądu indukowanego promieniowaniem rentgenowskim na liniach synchrotronowych. Przedstawiono w nim wyniki badań nad ogniwami słonecznymi w nanoskali i rozszerzono zestaw technik multimodalnej mikroskopii rentgenowskiej. Od okablowania po optymalizację sygnału do szumu, pokazano, jak wykonywać najnowocześniejsze pomiary XBIC na twardej mikrosondzie rentgenowskiej.

Pomiary prądu indukowanego wiązką promieniowania rentgenowskiego do multimodalnej mikroskopii rentgenowskiej ogniw słonecznych

Poznaj metodę kwantyfikacji danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą oprogramowania MAPS. Technika ta umożliwia analizę rozkładu pierwiastków i stosunków stechiometrycznych w próbkach biologicznych i materiałowych.

Kwantyfikacja danych fluorescencji rentgenowskiej za pomocą MAPS

Przeglądaj więcej filmów