Name: Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 13 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej TIRF. Technika ta umożliwia analizę dynamiki, rozmiarów kompleksów i przejściowych interakcji receptorowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Rozwój tego protokołu był wspierany przez granty Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (Advanced Grant TOPAS dla M.J.L.) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (Granty CA 1014/1-1 dla D.C. i SFB487 dla M.J.L.). T.S. był wspierany przez Fundację Alexandra von Humboldta.

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek nakrywkowych 
	UWAGA: Pracować pod wyciągiem.
	<ol>
		<li>Za pomocą czystej pęsety umieścić szkiełka nakrywkowe (średnica 24 mm) w uchwycie do szkiełek nakrywkowych, który rozdziela poszczególne szkiełka.</li>
		<li>Umieścić uchwyt ze szkiełkami w zlewce i dodać chloroform, aż szkiełka zostaną całkowicie przykryte. Przykryć zlewkę folią aluminiową, aby ograniczyć parowanie, i poddać sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 1 hr w RT. Wyjąć uchwyt ze zlewki i pozostawić szkiełka do wyschnięcia.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.1.2, stosując roztwór 5M NaOH zamiast chloroformu.</li>
		<li>Przenieść uchwyt ze szkiełkami do nowej zlewki i przemyć trzykrotnie wodą destylowaną. Umieścić oczyszczone szkiełka w szklanej płytce do hodowli komórkowej wypełnionej 100% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek kalibracyjnych
	<ol>
		<li>Rozpuścić barwnik fluorescencyjny w odpowiednim rozpuszczalniku.</li>
		<li>Przygotować szereg rozcieńczeń 1:10 barwnika fluorescencyjnego w zakresie od 1 pM do 1 nM w wodzie sterylizowanej filtrem (0,22 µm).</li>
		<li>Wziąć oczyszczone szkiełka przechowywane w 100% etanolu i przemyć je wodą sterylizowaną filtrem. Nanieść po 20 µl każdego rozcieńczenia barwnika fluorescencyjnego na oddzielne oczyszczone szkiełko. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia pod sterylnym dygestorium. Chronić szkiełka przed światłem i kurzem do momentu użycia. Wykorzystać te próbki do oszacowania intensywności pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych (patrz krok 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja
	<ol>
		<li>Hodować komórki CHO w pożywce DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle medium/nutrient mixture F-12) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C, w 5% CO2. UWAGA: Przez cały eksperyment stosować pożywki bez czerwieni fenolowej, aby zminimalizować autofluorescencję.</li>
		<li>Wyjąć oczyszczone szkiełka z 100% roztworu etanolu, przemyć je sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i umieścić jedno szkiełko w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Poddać komórki CHO trypsynizacji, policzyć je i wysiać z gęstością 3 x 105 komórek/dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka. Pozostawić komórki do wzrostu w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 24 hr, aby osiągnąć ok. 80% konfluencji, co jest optymalną gęstością komórek do transfekcji.</li>
		<li>Dla każdego dołka rozpuścić 2 µg pożądanego plazmidowego DNA (np., receptora β2-adrenergicznego z tagiem SNAP) oraz 6 µl Lipofectamine 2000 w dwóch osobnych probówkach zawierających 500 µl pożywki OptiMem. Inkubować w RT przez 5 min.</li>
		<li>Połączyć roztwory z kroku 1.3.4 w jednej probówce i wymieszać w celu uzyskania mieszaniny do transfekcji. Inkubować mieszaninę w RT przez 20 min.</li>
		<li>Podczas inkubacji (1.3.5) przemyć komórki CHO dwukrotnie podgrzanym (37 °C) PBS. Zastąpić PBS 1 ml/dołek pożywki DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej o 10% FBS, ale bez antybiotyków.</li>
		<li>Dodać kroplami całą mieszaninę do transfekcji (1 ml) z kroku 1.3.5 do każdego dołka i delikatnie kołysać płytką w przód i w tył, aby zapewnić całkowite wymieszanie.</li>
		<li>Inkubować przez 2 do 4 hr w 37 °C, w 5% CO2 i bezzwłocznie przejść do następnego kroku. UWAGA: Te warunki transfekcji zostały zoptymalizowane w celu uzyskania gęstości receptorów &lt;0,45 cząsteczki/µm2, co jest odpowiednie do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Może być wymagana korekta przy zastosowaniu innych komórek, konstruktów lub odczynników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie białek
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 µl roztworu zapasowego fluorofor-BG w 1 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 µM. Wyjąć transfektowane komórki z inkubatora i przemyć dwukrotnie podgrzanym (37 °C) PBS. Zastąpić PBS 1 ml roztworu fluorofor-BG o stężeniu 1 µM i inkubować przez 20 min w 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
		<li>Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie pożywką DMEM/F12 uzupełnioną o 10% FBS, za każdym razem po 5 min inkubacji w 37 °C. Wyjąć pęsetą szkiełko (z oznakowanymi komórkami) i umieścić je w komorze obrazowej.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 300 µl buforu do obrazowania. Dodać 300 µl świeżego buforu do obrazowania i niezwłocznie przystąpić do obrazowania (Część 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazów
UWAGA: Do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), wyposażonego w obiektyw imersyjny olejowy o wysokiej aperturze numerycznej (np. powiększenie 100X/apertura numeryczna 1,46), odpowiednie lasery (np. lasery diodowe 405 nm, 488 nm, 561 nm i 645 nm), kamerę EMCCD (electron multiplying charge coupled device), inkubator oraz system kontroli temperatury.
<ol>
	<li>Ustaw odpowiednie parametry mikroskopu, t.j. linię lasera, kąt TIRF (parametr ten kontroluje głębokość penetracji pola ewanescentnego), czas ekspozycji, częstotliwość klatek oraz liczbę obrazów na film10. Grzałkę/inkubator oraz kontrolę temperatury należy pozostawić stale włączone, aby uniknąć dryftu temperatury i kondensacji wilgoci.</li>
	<li>Nanieś kroplę olejku imersyjnego na obiektyw 100X mikroskopu. Umieść komorę obrazującą z oznakowanymi komórkami na uchwycie preparatu mikroskopu i ustaw ostrość obrazu komórek, korzystając z oświetlenia w polu jasnym.</li>
	<li>Przełącz na oświetlenie TIRF. Utrzymuj moc lasera na jak najniższym poziomie, aby umożliwić wyszukanie odpowiedniej komórki, a jednocześnie zminimalizować fotoblaknięcie.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią komórkę i precyzyjnie dostrój ostrość. Ustaw moc lasera na poziomie umożliwiającym wizualizację pojedynczych fluoroforów. Pozyskaj sekwencję obrazów i zapisz plik surowej sekwencji obrazów w formacie .tiff.</li>
</ol>
3. Kalibracja (pojedyncze fluorofory na szkle oraz kontrolne receptory monomerowe/dimerowe)
<ol>
	<li>Przygotuj każdą próbkę kalibracyjną, sporządzoną zgodnie z opisem w punkcie 1.2, w komorze obrazowania. Umieść każdą próbkę pod mikroskopem i wybierz tę, która zawiera dobrze odseparowane plamki ograniczone dyfrakcyjnie, ulegające wybieleniu w jednym kroku. UWAGA: Plamki te reprezentują pojedyncze cząsteczki barwnika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Pozyskaj sekwencje obrazów TIRF zgodnie z opisem w kroku 2. Ważne: dla wszystkich eksperymentów, w tym dla kalibracji, należy stosować te same parametry obrazowania.</li>
	<li>Przeprowadź analizę detekcji i śledzenia, zgodnie ze szczegółami w punktach 4.1 - 4.2. Wyodrębnij intensywność każdej cząstki zgodnie z opisem w punkcie 4.2.6. Na podstawie tych danych oblicz średnią (µ) i odchylenie standardowe (σ) intensywności pojedynczych fluoroforów.</li>
	<li>Opcjonalnie: przeprowadź tę samą analizę na komórkach transfekowanych monomerycznym receptorem powierzchniowym (np. CD86), znakowanym na N-końcu jedną lub dwiema kopiami SNAP10 i znakowanym pochodną fluorofor-BG. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej dla pojedynczego fluoroforu na szkle. Oszacuj wydajność znakowania zgodnie z opisem w Calebiro, D. et al.10</li>
</ol>
4. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Przygotowanie sekwencji obrazów
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. ImageJ), aby przyciąć obrazy.</li>
		<li>Zapisz poszczególne klatki jako oddzielne obrazy .tiff w nowym folderze, oznaczając na każdym obrazie numer klatki.</li>
		<li>Zmierz powierzchnię komórki, rysując obszar zainteresowania (ROI) wzdłuż konturu komórki i używając narzędzia pomiarowego (measure tool) w programie ImageJ lub podobnego narzędzia w innym oprogramowaniu. Wykorzystaj tę wartość do obliczenia gęstości cząstek, dzieląc całkowitą liczbę cząstek na początku filmu przez powierzchnię komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja i śledzenie cząstek 
	UWAGA: Użyj niekomercyjnego oprogramowania, takiego jak u-track13, działającego w środowisku Matlab, aby automatycznie wykrywać i śledzić pojedyncze cząstki receptorów. 
	UWAGA: Algorytm u-track opiera się na podejściu śledzenia wielohipotetycznego. Podejście to łączy cząstki między klatkami poprzez budowanie macierzy kosztów, w których przypisuje się poszczególne prawdopodobieństwa tego, że dana cząstka w jednej klatce odpowiada danej cząstce w następnej klatce, pojawia się, znika lub łączy się/rozdziela z innymi cząstkami. Ostatecznie wybierane jest rozwiązanie, które globalnie minimalizuje koszty, tzn. to o najwyższym prawdopodobieństwie. Pozwala to również na śledzenie tymczasowo znikającej cząstki, co jest typowym zjawiskiem spowodowanym migotaniem fluoroforu. Najnowsza wersja u-track (2.1.0) posiada graficzne interfejsy użytkownika, które ułatwiają wykonywanie tych analiz.
	<ol>
		<li>W wierszu poleceń Matlab wpisz „movieSelectorGUI”, aby otworzyć interfejs wyboru filmu. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nową bazę danych filmu na podstawie wcześniej zapisanych oddzielnych obrazów (patrz 4.1.2).</li>
		<li>Podaj rozmiar piksela w nm, odstęp czasu w sekundach, aperturę numeryczną, głębokość bitową kamery i długość fali emisji fluoroforu, które są wymagane do detekcji i śledzenia cząstek. Zapisz bazę danych filmu.</li>
		<li>Z interfejsu wyboru filmu uruchom analizę, wybierając „single-particles” jako typ obiektów. Pojawi się nowe okno, w którym można zdefiniować parametry używane do detekcji i śledzenia cząstek. Zacznij od parametrów domyślnych. Następnie dostosuj te parametry, jeśli jakość detekcji i/lub śledzenia nie jest satysfakcjonująca (np. niektóre cząstki nie są wykrywane lub trajektorie są pofragmentowane). Opcjonalnie: w ustawieniach śledzenia zaznacz „Export tracking results to matrix format”, aby zapisać współrzędne i amplitudy wszystkich cząstek w jednej macierzy (pole o nazwie „trackedFeaturedInfo”). Szczegółowy opis tych parametrów znajduje się w dokumentacji u-track.</li>
		<li>Uruchom algorytm detekcji. Algorytm ten automatycznie określa położenie i intensywność powyżej tła każdej plamki ograniczonej dyfrakcją (tzn. pojedynczych receptorów/kompleksów receptorowych) poprzez dopasowanie dwuwymiarowej funkcji Gaussa z odchyleniem standardowym równym funkcji rozproszenia punktowego mikroskopu wokół lokalnych maksimów intensywności. Następnie uruchom algorytm śledzenia. Zapisz wyniki analiz w pliku .mat.</li>
		<li>Użyj rutyny „movieViewer”, zawartej w pakiecie u-track, lub podobnych rutyn niestandardowych, aby zwizualizować trajektorie i sprawdzić jakość detekcji i śledzenia.</li>
		<li>Otwórz plik .mat, aby zobaczyć pozycję i amplitudę (tzn. intensywność) śledzonych cząstek w każdej klatce. Dane wygenerowane w kroku 4.2.4 znajdują się w polu tracksCoordAmpCG tablicy tracksFinal i/lub w trackedFeaturedInfo. Z całkowitej liczby wykrytych cząstek oblicz gęstość cząstek, dzieląc tę wartość przez powierzchnię komórki zmierzoną w punkcie 4.1.3.</li>
		<li>Opcjonalnie: Użyj współrzędnych cząstek w czasie (patrz 4.2.6), aby przeanalizować ruch cząstek receptorów. Oblicz średnie kwadratowe przemieszczenia (MSD) i współczynniki dyfuzji (D) za pomocą programu Matlab lub podobnego oprogramowania. Dla każdej cząstki i każdego rozważanego odstępu czasu (Δt) oblicz średnie kwadratowe przemieszczenie (MSD) za pomocą następującego wzoru: 
		<img align="middle" alt="Równanie średniego kwadratowego przemieszczenia (MSD); analizuje dynamikę cząstek; wzór: MSD(Δt)=1/NΣ(Δx²+Δy²)." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie Δt jest odstępem czasu w klatkach, N jest liczbą analizowanych kroków, a x i y to współrzędne x i y cząstki w klatce wskazanej przez indeks. Wykorzystaj wykresy MSD w czasie do oceny rodzaju ruchu danej cząstki: zależności liniowe wskazują na dyfuzję swobodną (tzn. ruchy Browna), dodatnia krzywizna (tzn. krzywa przypomina parabolę) sugeruje ruch ukierunkowany, a ujemna krzywizna świadczy o ruchu ograniczonym14. W przypadku cząstek dyfundujących swobodnie, oblicz współczynnik dyfuzji (D) każdej cząstki, dopasowując uzyskane dane MSD do następującego równania: 
		<img align="middle" alt="Równanie średniego kwadratowego przemieszczenia, MSD=4Dt, ilustrujące proces dyfuzji, format równania." src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenie rozmiaru cząstek metodą dopasowania Gaussa 
	UWAGA: Po ustaleniu rozkładu intensywności próbek kalibracyjnych (pojedynczych fluoroforów na szkle i/lub monomerycznych receptorów znakowanych fluorescencyjnie), wykonaj mieszane dopasowanie Gaussa do rozkładu intensywności cząstek na początku sekwencji obrazów, aby określić rozmiar kompleksów receptorowych (tzn. liczbę receptorów na cząstkę)10. Przeprowadź te analizy za pomocą programu Matlab lub podobnego oprogramowania.
	<ol>
		<li>Oblicz intensywność każdej cząstki, uśredniając intensywność cząstki od pierwszej klatki do klatki poprzedzającej pierwszą zmianę intensywności (w większości przypadków jest to spadek spowodowany fotobieleniem).</li>
		<li>Wykonaj mieszane dopasowanie Gaussa zgodnie z następującym równaniem: 
		<img align="middle" alt="Wyrażenie matematyczne funkcji Gaussa; równanie; stosowane w analizie statystycznej." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
		gdzie φ(i) jest częstotliwością występowania cząstek o intensywności i, n jest numerem komponentu, αn jest parametrem wpływającym na wysokość komponentu n, a μ i σ są średnią i odchyleniem standardowym intensywności referencyjnych pojedynczych fluoroforów (obliczonymi zgodnie z opisem w kroku 3). UWAGA: Określ maksymalną liczbę komponentów (nmax) dla każdej sekwencji obrazów, stopniowo zwiększając nmax, aż dodanie kolejnego komponentu nie będzie już dawało statystycznie lepszego dopasowania, ocenianego za pomocą testu F.</li>
		<li>Opcjonalnie: Wykonaj mieszane dopasowanie Gaussa do rozkładu intensywności uzyskanego na ostatnich klatkach filmu (np. ostatnich 60 klatkach z sekwencji 400 klatek). Zastąp μ i σ wartościami uzyskanymi po tym dopasowaniu, które zapewniają doprecyzowane szacunki dla tych parametrów, i powtórz krok 4.3.2.</li>
		<li>Oblicz pole pod krzywą (AUC) dla każdego komponentu mieszanego dopasowania Gaussa. Oblicz względną liczebność cząstek receptorów o różnych rozmiarach (tzn. monomerów, dimerów, trimerów itd.), dzieląc wartość AUC każdego komponentu przez AUC całego rozkładu.</li>
		<li>Opcjonalnie: Użyj danych z różnych komórek i odpowiadających im gęstości cząstek (obliczonych zgodnie z opisem w 4.2.6), aby wygenerować wykresy, na których rozkład cząstek o różnych rozmiarach jest skorelowany z gęstością cząstek10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenie rozmiaru cząstek metodą dopasowania schodkowego 
	UWAGA: Użyj analizy dopasowania schodkowego jako alternatywnej metody określania rozmiaru kompleksów receptorowych10. Podstawą tej analizy jest fakt, że indukowane światłem zniszczenie (fotobielenie) pojedynczego fluoroforu skutkuje jego natychmiastowym zniknięciem – zatem oczekuje się, że cząstki zawierające n fluoroforów będą stopniowo blaknąć, tworząc profil intensywności z n stopniami.
	<ol>
		<li>Wyodrębnij profile intensywności każdej cząstki z pliku .mat wygenerowanego przez u-track lub podobne oprogramowanie do detekcji/śledzenia (patrz 4.2.6).</li>
		<li>Użyj algorytmu dopasowania schodkowego, takiego jak ten przedstawiony w ref. 10, aby policzyć liczbę stopni fotobielenia dla każdej cząstki.</li>
		<li>Opcjonalnie: wykorzystaj wyniki do wygenerowania rozkładów pokazujących względną liczebność cząstek receptorów o różnych rozmiarach i skoreluj je z gęstością cząstek w sposób opisany wcześniej dla wyników mieszanego dopasowania Gaussa (patrz 4.3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%3A+an+emerging+concept+for+G+protein-coupled+receptor+ontogeny+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).</li>
<li>Ferré, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+new+conceptual+framework+for+receptor+heteromers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a new conceptual framework for receptor heteromers.</a> Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).</li>
<li>Milligan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+hetero-dimerization%3A+contribution+to+pharmacology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function.</a> Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).</li>
<li>Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+in+GPCR+mobility+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dimerization in GPCR mobility and signaling.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nat Methods. 4, 319-321 (2007).</li>
<li>Triller, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+synaptic+biology+derived+from+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging.</a> Neuron. 59, 359-374 (2008).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).</li>
<li>Kasai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+characterization+of+GPCR+monomer-dimer+dynamic+equilibrium+by+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging.</a> J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chem Biol. 15, 128-136 (2008).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany protokół pozwala na analizę rozmieszczenia przestrzennego, ruchliwości i wielkości kompleksów receptorów na powierzchni komórki na poziomie pojedynczej cząsteczki. W porównaniu z zastosowaniem białek fluorescencyjnych, znakowanie małymi fluoroforami organicznymi, które są jaśniejsze i bardziej fotostabilne, ma tę zaletę, że umożliwia rozszerzoną wizualizację pojedynczych cząstek receptora. Ponieważ osiągane są ekstremalnie niskie poziomy ekspresji (<0,45 cząstki receptora/μm2), właściwości receptorów i...

Receptory znajdujące się na powierzchni komórki wyczuwają środowisko zewnątrzkomórkowe i reagują na różne bodźce, takie jak substancje zapachowe, jony, małe neuroprzekaźniki i duże hormony białkowe. Płynna natura błon komórkowych umożliwia ruchy receptorów i innych białek błonowych. Jest to niezbędne do tworzenia kompleksów białkowych i występowania przejściowych interakcji białko-białko, takich jak te wykorzystywane przez receptory do łączenia się w jednostki funkcjonalne i przekazywania sygnałów do wnętrza komórki. Na przykład sugeruje się, że receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które stanowią największą rodzinę receptorów na powierzchni komórki1, tworzą di-/oligomery, co wydaje się być zaangażowane w precyzyjnie dostrojoną regulację transdukcji sygnału i może mieć ważne konsekwencje fizjologiczne i farmakologiczne2-5.
Mikroskopia jednocząsteczkowa ma ogromny potencjał bezpośredniego obrazowania z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną dynamicznego zachowania poszczególnych receptorów znajdujących się na powierzchni żywych komórek, w tym ich powiązania w celu tworzenia dimerów i kompleksów molekularnych wyższego rzędu6-10. Ma to kilka zalet w porównaniu ze standardowymi metodami biochemicznymi i mikroskopowymi, które zwykle informują o średnim zachowaniu tysięcy lub milionów cząsteczek.
Znakowanie białek za pomocą wystarczająco jasnego i fotostabilnego fluoroforu jest niezbędne dla mikroskopii jednocząsteczkowej. Protokół ten wykorzystuje niedawno wprowadzony znacznik SNAP11 do kowalencyjnego przyłączania małych i jasnych fluoroforów organicznych do receptorów na powierzchni komórki. SNAP jest znacznikiem białkowym o masie 20 kD pochodzącym z enzymu naprawy ludzkiego DNA Alkilotransferazy O-6-alkiloguaniny-DNA, który może być nieodwracalnie znakowany pochodnymi benzyloguaniny sprzężonej z fluoroforem (fluorofor-BG). CLIP, kolejny zmodyfikowany znacznik pochodzący z SNAP, może być zamiast tego znakowany za pomocą sprzężonych z fluoroforem pochodnych benzylocozyny12.
Protokół opisany w tym manuskrypcie wyjaśnia, jak transfekować i oznaczać11 receptorów oznaczonych SNAP małymi organicznymi fluoroforami i używać mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji (TIRF) do wizualizacji pojedynczych receptorów lub kompleksów receptorów na powierzchni żywych komórek10. Zgłoszony protokół skutkuje >90% skutecznością znakowania zewnątrzkomórkowego białka na powierzchni komórkiznakowanego SNAP 10. Podano dalsze informacje na temat wykorzystania danych dotyczących pojedynczych cząsteczek do analizy wielkości i ruchliwości kompleksów receptorowych, a także do wychwytywania przejściowych interakcji receptor-receptor. Schematyczny przebieg pracy całego protokołu przedstawiono na rysunku 1. Jako przykład opisano transfekcję komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) znakowanymi SNAP, a następnie znakowanie pochodną fluoroforu BG, a także jej zastosowanie do ilościowego określania i monitorowania di-/oligomeryzacji receptora. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka powierzchniowe komórki i znaczniki fluorescencyjne (np. CLIP), a także na inne metody transfekcji i znakowania.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1585</td><td>UWAGA: substancja toksyczna i drażniąca, a także możliwy czynnik rakotwórczy</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>UWAGA: mocna zasada i silnie odczynnik</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe&nbsp;</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111640</td><td>Średnica 24 mm, grubość 0,13-0,16 mm</td></tr><tr><td>Sterylny filtr 0,2 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Komórki CHO</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC CCL-61</td><td>Linia komórkowa jajnika chomika chińskiego</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Pożywka wolna od czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina - streptomycyna&nbsp;</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P06-07 100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P10-23100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica</td><td>Medium Invitrogen, Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Benzyloguanina sprzężona z fluoroforem&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>S9136S</td><td>SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Przygotuj roztwór podstawowy o pojemności 1 mM w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Bufor obrazowania:</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; NaCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1371</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; CaCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; MgCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Komora obrazowania</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>A-7816</td><td>Komora komórkowa Attofluor, do mikroskopii</td></tr><tr><td>TIRF-M</td><td>Leica</td><td></td><td>Model: DMI6000B</td></tr><tr><td>Obiektyw TIRF</td><td>Leica</td><td>11 506 249&nbsp;</td><td>HCX PL Apo 100x/1.46 Olej CORR&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera EM-CCD&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>Photometrics Cascade 512B</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Pecon</td><td></td><td>Tempcontrol 37-2 cyfrowe</td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH, USA</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>oprogramowanie u-track</td><td>Laboratorium obliczeniowej biologii komórki, Wydział Biologii Komórki, Harvard Medical School, USA</td><td></td><td>http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td></tr><tr><td>Matlab oprogramowanie</td><td>The MathWorks, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Mikroskopia pojedynczych cząsteczek staje się potężnym podejściem do analizy zachowania cząsteczek sygnałowych, w szczególności w odniesieniu do tych aspektów (np. kinetyka, współistnienie różnych stanów i populacji, przejściowe interakcje), które są zazwyczaj ukryte w pomiarach zespołowych, takich jak te uzyskane za pomocą standardowych metod biochemicznych lub mikroskopowych. W ten sposób dynamiczne zdarzenia, takie jak interakcje receptor-receptor, mogą być śledzone w czasie rzeczywistym w żywej komórce z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten opisuje metodę opartą na znakowaniu za pomocą małych i jasnych fluoroforów organicznych oraz mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w celu bezpośredniej wizualizacji pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek. Takie podejście pozwala na precyzyjną lokalizację receptorów, pomiar wielkości kompleksów receptorowych i uchwycenie dynamicznych zdarzeń, takich jak przejściowe interakcje receptor-receptor. Protokół zawiera szczegółowy opis sposobu przeprowadzenia eksperymentu z pojedynczą cząsteczką, w tym przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy obrazu. Jako przykład przedstawiono zastosowanie tej metody do analizy dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G, tj. receptora βkwasu 2-adrenergicznego i γ-aminomasłowego typu B (GABAB). Protokół można dostosować do innych białek błonowych i różnych modeli komórek, metod transfekcji i strategii znakowania.

Opisany protokół można zastosować do wielu różnych białek błonowych. Jako przykład przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane dla receptorów β2-adrenergicznych i GABAB10. Ponieważ sygnały fluorescencyjne z pojedynczych cząsteczek są słabe, pierwszym kluczowym krokiem do uzyskania pomyślnych wyników jest minimalizacja fluorescencji tła. Dlatego ważne jest stosowanie dokładnie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych (Rysunek 2A) oraz minimalizacja autofluorescencji próbek (<...

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek i analiza ich lokalizacji, ruchu i dynamicznej asocjacji w kompleksy supramolekularne. Osiąga się to poprzez ekspresję receptorów znakowanych snap na bardzo niskich poziomach na powierzchni żywych komórek i znakowanie ich jasnymi organicznymi fluoroforami, aby umożliwić wykrycie pojedynczej cząsteczki. Drugim krokiem jest wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, która pozwala na uzyskanie szybkiej sekwencji obrazowej poszczególnych cząstek receptora poruszających się po powierzchni komórki.Następnie do sekwencji obrazu stosuje się zautomatyzowane algorytmy wykrywania i śledzenia w celu uzyskania pozycji i intensywności każdej cząstki receptora w czasie. Uzyskano wyniki, które pokazują precyzyjną analizę wielkości kompleksów receptorowych w tym przykładzie, beta dwa receptory adrenergiczne oparte na mieszanym dopasowaniu Gaussa rozkładu intensywności cząstek na początku sekwencji obrazu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak to, w jaki sposób nasze receptory organiz

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę wizualizacji pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej TIRF. Technika ta umożliwia analizę dynamiki, rozmiarów kompleksów i przejściowych interakcji receptorowych w czasie rzeczywistym.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów