Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek i analiza ich lokalizacji, ruchu i dynamicznej asocjacji w kompleksy supramolekularne. Osiąga się to poprzez ekspresję receptorów znakowanych snap na bardzo niskich poziomach na powierzchni żywych komórek i znakowanie ich jasnymi organicznymi fluoroforami, aby umożliwić wykrycie pojedynczej cząsteczki. Drugim krokiem jest wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, która pozwala na uzyskanie szybkiej sekwencji obrazowej poszczególnych cząstek receptora poruszających się po powierzchni komórki.

Następnie do sekwencji obrazu stosuje się zautomatyzowane algorytmy wykrywania i śledzenia w celu uzyskania pozycji i intensywności każdej cząstki receptora w czasie. Uzyskano wyniki, które pokazują precyzyjną analizę wielkości kompleksów receptorowych w tym przykładzie, beta dwa receptory adrenergiczne oparte na mieszanym dopasowaniu Gaussa rozkładu intensywności cząstek na początku sekwencji obrazu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak to, w jaki sposób nasze receptory organizują się w domenach powierzchni żywych komórek.

W jaki sposób oddziałują one ze sobą, tworząc dimery i oligomery oraz jak w rzeczywistości zachodzą dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw sygnalizacji receptorowej. Główną przewagą tej techniki nad standardowymi metodami biochemicznymi i mikroskopowymi jest to, że bada ona zachowanie pojedynczych receptorów w środowisku naturalnym, co pozwala nam badać ważne aspekty, które zwykle są ukryte w pomiarach zespołowych. Szkiełka nakrywkowe do próbek muszą być dokładnie oczyszczone, aby zminimalizować fluorescencję tła Podczas obrazowania użyj czystej pęsety, aby umieścić średnicę 24 milimetrów.

Szklana okładka wsuwa się do uchwytu na szkiełko nakrywkowe, które oddziela poszczególne szkiełka nakrywkowe. Umieścić uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce i dodawać chloroform, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte. Przykryj zlewkę folią aluminiową, aby zmniejszyć parowanie i poddać sonikacji w kąpieli.

Sonikować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie wyjąć uchwyt szkiełka nakrywkowego ze zlewki i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia. Następnie umieść uchwyt z szkiełkami nakrywkowymi w innej zlewce i dodaj pięć molowych roztworów wodorotlenku sodu, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte.

Tak jak poprzednio, przykryć zlewkę folią i sonikować przez godzinę w temperaturze pokojowej, przenieść uchwyt szkiełka nakrywkowego do nowej zlewki i umyć trzykrotnie wodą destylowaną. Na koniec umieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe w szklanym naczyniu do hodowli komórek wypełnionym 100% etanolem. Pokazano tutaj szkiełka nakrywkowe przed i po czyszczeniu, zobrazowane za pomocą fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia lub mikroskopii darniowej.

Próbki kalibracyjne Cal służą do oszacowania intensywności pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych podczas mikroskopii murawy. Aby przygotować próbki, należy rozpuścić barwnik fluorescencyjny w odpowiednim rozpuszczalniku. Przygotować seryjne rozcieńczenie barwnika fluorescencyjnego od 1 do 10 metrów od jednego zęba pikamolowego do jednego zęba trzonowego.

W filtrowanej wysterylizowanej wodzie. Umyj wcześniej oczyszczone szkiełka nakrywkowe, przenosząc je do naczynia do hodowli komórkowych wypełnionego przefiltrowaną wysterylizowaną wodą. Następnie umieść każde szkiełko nakrywkowe w studzience z sześciodołkową płytką do hodowli komórkowej i poczekaj, aż wyschną, umieść 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia barwnika fluorescencyjnego na oddzielnym, oczyszczonym szkiełku nakrywkowym.

Pozostaw okładkę do wyschnięcia pod sterylnym kapturem. Chroń szkiełka okładki przed światłem i kurzem do czasu użycia przed transfekcją. Przygotować sześciodołkową płytkę do hodowli komórkowej Umyć oczyszczone szkiełka nakrywkowe sterylnym PBS i umieścić po jednym szkiełku przykrywkowym w każdym dołku z sześciodołkową płytką do hodowli komórkowych.

Komórki CHO, które mają być transfekowane do tego badania, są hodowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 w jednej, zmodyfikowanej ECCOs pożywce odżywczej F 12 jeden do jednego, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą penicyliny i streptomycyną po trypsynie i licząc komórki zgodnie ze standardowymi metodami, nasiona o gęstości trzy razy 10 do piątej komórki na studzienkę. Na szóstej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze przez 24 godziny, aby osiągnąć około 80% płynności CO, co jest optymalną gęstością komórek. Do transfekcji.

Najtrudniejszym aspektem tego protokołu jest osiągnięcie wyjątkowo niskiego poziomu ekspresji receptorów błonowych na powierzchni komórki, aby zapewnić sukces. Warunek transfekcji. Na przykład ilość plus media NA i czas po transfekcji muszą być zoptymalizowane W dniu transfekcji.

Przygotuj odczynniki do transfekcji dla każdego z nich, rozcieńczyć dwa mikrogramy pożądanego DNA w kratę w 500 mikrolitrach optymalnego podłoża w innej probówce. Na każdą studzienkę rozcieńczyć sześć mikrolitrów Lipectomy 2000 w 500 mikrolitrach pożywki Optum. Inkubować obie probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Po pięciu minutach połącz oba roztwory w jednej probówce i wymieszaj, aby uzyskać mieszaninę transfekcji. Mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przygotuj komórki CHO.

Umyj komórki dwukrotnie uprzednim ostrzeżeniem PBS Po drugim płukaniu zastąp PBS jednym mililitrem na studzienkę pożywki D-M-E-M-F 12 wolnej od czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS, ale bez antybiotyków. Dodaj jeden mililitr mieszanki transfekcyjnej, kroplami do każdej studzienki i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez dwie do czterech godzin przed natychmiastowym przystąpieniem do znakowania białka.

Aby rozpocząć tę procedurę, rozcieńczyć jeden mikrolitr sprzężonej pochodnej benzogwinowej fluoro czterech lub roztworu podstawowego fluoro four BG w jednym mililitrze pożywki D-M-E-M-F 12 uzupełnionej 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola. Pobrać transfekowane komórki z inkubatora i przemyć dwukrotnie ciepłym PBS. Zastąp PBS jednym mililitrem jednego mikromolowego roztworu fluoro four BG i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 20 minut.

Następnie umyj komórki trzykrotnie pożywką D-M-E-M-F 12 uzupełnioną za każdym razem 10% FBS, a następnie wykonaj pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyto pęsety do przeniesienia szkiełek nakrywkowych z oznakowanymi komórkami do komory obrazowania. Przemyć dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu do obrazowania.

Dodaj 300 mikrolitrów świeżego bufora do obrazowania i natychmiast przystąp do obrazowania, które są uzyskiwane. Za pomocą mikroskopu darniowego wyposażonego w zanurzenie w olejku, obiektyw o dużej aperturze numerycznej, odpowiednie lasery, urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotnienia elektronów, kamerę i inkubator oraz kontrolę temperatury. Ustaw żądane parametry mikroskopu, czyli linię lasera, kąt naświetlania, czas naświetlania i liczbę obrazów w filmie.

Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw mikroskopu o powiększeniu 100x. Umieść komorę obrazowania z oznaczonymi komórkami na uchwycie próbki mikroskopu i ustaw ostrość komórek. Korzystanie z oświetlenia w jasnym polu.

Przełącz się na oświetlenie murawy. Utrzymuj moc lasera na jak najniższym poziomie, aby umożliwić wyszukiwanie żądanej komórki, ale jednocześnie minimalizując wybielanie zdjęć. Wybierz żądaną komórkę i dobrze.

Dostosuj ostrość. Zwiększ moc lasera do poziomu umożliwiającego wizualizację pojedynczych czwórek florystycznych. Uzyskaj sekwencję obrazów i zapisz ją jako plik tiff do kalibracji.

Zbierz każdą próbkę kalibracyjną w komorze obrazowania i umieść na mikroskopie. Wybrać próbkę zawierającą dobrze oddzieloną dyfrakcję. Ograniczone plamy, które wybielają się w jednym kroku.

Sekwencje obrazu murawy są następnie pozyskiwane w taki sam sposób, jak pokazano dla znakowanych komórek. Aby przygotować sekwencję obrazów, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak Image J, aby przyciąć obrazy. Poszczególne klatki można zapisywać jako osobne obrazy TIFF w nowym folderze, w którym znajduje się numer klatki na każdym obrazie.

Wykrywanie i śledzenie cząstek odbywa się za pomocą niekomercyjnego oprogramowania, takiego jak U Track w środowisku MATLAB. W wierszu polecenia MATLAB wpisz selektor filmu, GUI. Aby otworzyć interfejs wyboru filmów, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nową bazę danych filmów, zaczynając od wcześniej zapisanych oddzielnych obrazów.

Podaj rozmiar piksela w nanometrach, interwał czasowy w sekundach, aperturę numeryczną, głębię bitową kamery i długość fali emisji fluoroforu wymaganą do wykrywania i śledzenia cząstek. Zapisz bazę danych filmów z interfejsu wyboru filmu. Uruchom analizę, wybierając pojedyncze cząstki jako typ obiektu.

Uruchom algorytm wykrywania, a następnie uruchom algorytm śledzenia. Użyj procedury przeglądarki filmów zawartej w pakiecie URAC w celu wizualizacji ścieżek i sprawdzenia jakości wykrywania i śledzenia. Otwórz plik kropkowy MAT, aby zobaczyć położenie i amplitudę śledzonych cząstek w każdej klatce.

Na podstawie uzyskanych danych można również obliczyć wielkość cząstek. Pokazana tutaj jest pierwsza klatka typowej sekwencji obrazu murawy komórki transfekowanej zatrzaskowo oznaczonymi receptorami beta two adrenergicznymi i znakowanej fluoro-czteroma sprzężoną pochodną gwinei benzylowej. Plamki reprezentują pojedyncze receptory lub kompleksy receptorów.

Algorytm detekcji jest stosowany do tej samej sekwencji obrazu, a każda wykryta cząstka jest oznaczona niebieskim kółkiem algorytmu śledzenia. Do tej samej sekwencji obrazów uzyskuje się trajektorie poszczególnych cząstek zaznaczone na niebiesko. Zielone segmenty reprezentują zdarzenia scalania, a czerwone segmenty reprezentują zdarzenia podziału.

Ta metoda przechwytuje również zdarzenia dynamiczne. W tym przykładzie dwie cząstki przechodzą przejściowe oddziaływanie, poruszają się razem przez kilka klatek i ponownie się rozdzielają. Trajektorie poszczególnych cząstek służą do obliczania ich współczynników dyfuzji.

Ten reprezentatywny wynik pokazuje, że receptor adrenergiczny beta dwóch ma wysoką ruchliwość. Podczas gdy receptor GABA B ma ograniczoną ruchliwość, wielkość kompleksów receptorowych można precyzyjnie oszacować, dopasowując rozkłady intensywności cząstek do mieszanego modelu Gaussa. Analiza ta może również ujawnić współistnienie monomerów i dimerów.

Pokazano tutaj przykłady wybielania cząstek receptora monomerycznego w jednym kroku i wybielania cząstek receptora średnicowego w dwóch etapach. Procedury te mogą być rozszerzone i dostosowane do pracy z innymi białkami powierzchniowymi komórek, metodami niwelacji i modelami komórkowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać czysty sen okrywowy, jak uzyskać niski poziom ekspresji i skuteczne znakowanie jasnymi organicznymi fluorami, a także jak pozyskiwać i analizować obrazy murawy, które reprezentują wszystkie kluczowe kroki dla udanej pojedynczej cząsteczki.