Name: Ocena wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Naucz się oceny wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację struktur układu moczowego i identyfikację anomalii rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) za wsparcie w złożeniu tego manuskryptu. Dziękuję również dr Michaelowi Hallowi (CDBL/NCI/NIH) i Nirmali Sharmie (CDBL/NCI/NIH) za redakcję tego manuskryptu. Jestem wdzięczny Lai Thangowi (SAIC) za jego doskonałą hodowlę myszy. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health, National Cancer Institute i Center for Cancer Research.

Myszy (myszy Wnt5a flox/flox (Wnt5atm1.1Tpy) i linia Dll1Cre, model myszy UVJO)7 były zarządzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i badane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez NCI-Frederick Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie roztworu barwnika błękitu metylenowego
<ol>
	<li>Odmierz 0,1 g niebieskiego metylenu w proszku.</li>
	<li>Błękit metylenowy należy całkowicie rozpuścić w 10 ml soli fizjologicznej lub 1 roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez wirowanie.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór błękitu metylenowego o stężeniu 10 mg/ml za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów membrany 0,45 μm), aby wyeliminować zatykanie podczas wstrzykiwania.</li>
	<li>Złóż sterylny zestaw do żył skóry głowy (27GX3/4") z jednorazową strzykawką o pojemności 3 ml i napełnij strzykawkę 3 ml przefiltrowanym roztworem błękitu metylenowego. 
	UWAGA: Aby zapobiec ciśnieniu hydrostatycznemu i późniejszemu przepływowi barwnika, umieść końcówkę igły nad strzykawką wypełnioną roztworem błękitu metylenowego.</li>
</ol>
2. Sekcja prenatalnych embrionów
<ol>
	<li>Wyczyść nożyczki preparacyjne i kleszcze 70% etanolem.</li>
	<li>Aby pobrać zarodki okołoporodowe w E18.5 lub E19.5, najpierw poddaj eutanazji ciężarne myszy za pomocą inhalacji CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi NIH. 
	UWAGA: Ciężarna samica myszy zwykle rodzi od E18,5, jednak większe nerki są łatwiejsze do manipulowania. W związku z tym nerki w wieku E19,5 bliżej urodzenia są łatwiejsze do przeprowadzenia tej analizy. Jednak szczenięta z obustronną niedrożnością dróg moczowych umierają po urodzeniu. W zależności od charakterystyki myszy doświadczalnych, odpowiedni dzień/godzina zbierania powinna być empirycznie określona.</li>
	<li>Rozpyl 70% etanolu na brzuszną powierzchnię brzucha, a następnie otwórz jamę brzuszną brzusznie za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.</li>
	<li>Podnieś całą macicę i oddziel ją od ciała, przecinając nożyczkami preparacyjnymi na końcach rogów macicy.</li>
	<li>Przepłucz całą macicę 1x PBS na szalce Petriego.</li>
	<li>Przeciąć macicę segmentowo nożyczkami preparacyjnymi i usunąć decyduę łożyskową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby odsłonić zarodki w woreczkach żółtkowych.</li>
	<li>Najpierw usuń woreczek żółtkowy, a następnie usuń błonę owodniową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby uwolnić zarodki okołoporodowe.</li>
	<li>Odetnij głowę zarodkowi nożyczkami do preparowania. Zetrzyj nadmiar krwi sterylnymi gazikami. Przypnij zarodek jego brzuszną powierzchnią do góry na mikroskopie preparacyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową do obrazowania. W razie potrzeby zbierz jego ogon do genotypowania. 
	UWAGA: Wykonuj zastrzyki po jednym zarodku na raz.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz jamę brzuszną zarodka za pomocą kleszczy, rozrywając skórę. Następnie ostrożnie usuń nadmiar narządów i tkanek, takich jak wątroba, żołądek i jelito, za pomocą kleszczy, przecinając je lub wyciągając, aby odsłonić nerki, moczowody i pęcherz, które znajdują się grzbietowo (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). W razie potrzeby wchłonąć nadmiar krwi z wypreparowanego zarodka za pomocą sterylnych gazików. 
	UWAGA: Nadmiar krwi przeszkadza w identyfikacji miedniczki nerkowej do wstrzyknięcia barwnika.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej i monitorowanie przepływu barwnika
<ol>
	<li>Usunąć pęcherzyki z igły i rurki, usuwając roztwór błękitu metylenowego z końcówki igły za pomocą ciśnienia hydrostatycznego. Podnieś strzykawkę zawierającą roztwór barwnika powyżej poziomu końcówki igły, aby rozpocząć przepływ, a następnie opuść strzykawkę, aby zatrzymać przepływ.</li>
	<li>Wbić igłę do miedniczki nerkowej w pobliżu bliższego moczowodu, uważając, aby nie naruszyć jej po umieszczeniu. Wykonaj wstrzyknięcie barwnika do nerki, aby określić jej niedrożność dróg moczowych. 
	UWAGA: Najpierw wykonaj wstrzyknięcie barwnika do każdej nieprawidłowej nerki7, postępując w ten sam sposób, aby określić niedrożność dróg moczowych.</li>
	<li>Podnieś strzykawkę na około 20 cm, aby zapewnić ciśnienie hydrostatyczne i pozwól przepłynąć 15 μl - 60 μl roztworu barwnika. Natężenie przepływu wyniesie około 3 μl/s, jeśli strzykawka zostanie podniesiona do tej wysokości nad zarodkiem.</li>
	<li>Monitoruj niebieski kolor barwnika, zaczynając najpierw w miedniczce nerkowej, następnie na długości moczowodu, a na końcu w świetle pęcherza. 
	UWAGA: Potrzeba około 5 sekund, aby zobaczyć, jak w świetle pęcherza pojawia się słaby kolor barwnika, jeśli moczowód jest prawidłowo wprowadzony do pęcherza. Pozwól, aby barwnik zgromadził się w zablokowanym miejscu przez około 15 sekund, jeśli w świetle pęcherza nie pojawi się żaden kolor barwnika.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w dół, aby zatrzymać przepływ barwnika i wyjąć igłę z nerki.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia nerki, moczowodu i pęcherza moczowego prześledzone roztworem barwnika za pomocą aparatu i programu do obrazowania podłączonego do mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Zapisz wodonercze nerki, wodonerek i końcowe położenie roztworu barwnika w zeszycie laboratoryjnym.</li>
	<li>Wykonać wstrzyknięcie do przeciwległej nerki zgodnie z opisem w punktach 3.1) do 3.5) i pozostawić przepływ barwnika łącznie około 20 s. 
	UWAGA: Światło pęcherza zostanie wypełnione roztworem barwnika, oznaczonym mocnym niebieskim kolorem, jeśli moczowód zostanie prawidłowo wprowadzony do światła pęcherza. Po ocenie niedrożności połączenia dróg moczowych, moczowody i pęcherz moczowy mogą zostać przymocowane do sekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Rasouly, H. M., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+urinary+tract+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lower urinary tract development and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).</li>
<li>Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Box+Genes+in+the+Kidney+and+Urinary+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract.</a> Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).</li>
<li>Bohnenpoll, T., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureter+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ureter growth and differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).</li>
<li>Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic%2C+environmental%2C+and+epigenetic+factors+involved+in+CAKUT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).</li>
<li>Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+canonical+Smad+signaling+in+ureteral+and+bladder+mesenchyme+causes+ureteropelvic+junction+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+haploinsufficiency+in+mice+leads+to+congenital+hydronephrosis+resembling+that+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans.</a> Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).</li>
<li>Yun, K., Perantoni, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydronephrosis+in+the+Wnt5a-ablated+kidney+is+caused+by+an+abnormal+ureter-bladder+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection.</a> Differentiation. 94, 1-7 (2017).</li>
<li>Uetani, N., Bouchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumbing+in+the+embryo%3A+developmental+defects+of+the+urinary+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts.</a> Clin Genet. 75, 307-317 (2009).</li>
<li>Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+urinary+tract+defects+in+mice%3A+methods+to+detect+the+presence+of+vesicoureteric+reflux+and+urinary+tract+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction.</a> Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).</li>
<li>Weiss, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephric+duct+insertion+requires+EphA4%2FEphA7+signaling+from+the+pericloacal+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme.</a> Development. 141, 3420-3430 (2014).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Nerki myszy funkcjonują od poziomu E16,5 i teoretycznie możliwy jest test wstrzykiwania barwnika od tego momentu. Jednak nerka jest zbyt mała, aby można ją było wstrzyknąć roztworem barwnika, a fenotypy, takie jak wodonercze i wodomoczowód, nie są wyraźnie obserwowane, ponieważ te fenotypy są wtórnym efektem moczu nagromadzonego w wyniku nieprawidłowego transportu moczu. Te fenotypy, wynikające z przeszkód takich jak UPJO lub UVJO, są widoczne w E18.5 przez rozdęte nerki i moczowody. Większe nerki zarodków w wieku E19,5 ...

Układ moczowy składa się z pary nerek i moczowodów oraz wspólnego pęcherza moczowego i cewki moczowej. Główną funkcją układu moczowego jest utrzymanie homeostazy organizmu poprzez zarządzanie równowagą wodno-elektrolitową krwi. Nerki filtrują krew, aby kontrolować stężenie elektrolitów i równowagę kwasowo-zasadową, a także wytwarzają mocz w celu wydalenia nadmiaru wody i odpadów, w tym substancji rozpuszczonych i metabolitów. Mocz jest następnie transportowany przez moczowód z miedniczki nerkowej nerki do pęcherza moczowego w sposób jednokierunkowy, gdzie jest przechowywany i ostatecznie wydalany przez cewkę moczową1.
Moczowody to proste rurki wychodzące z przewodu nerkowego. Po pączkowaniu z przewodu nerkowego w 10,5 dniu embrionalnym (E10,5) u myszy, łodyga moczowodu wydłuża się i różnicuje w wielowarstwową strukturę zwaną urotelią, która jest nieprzepuszczalna dla mysich E12,5 i E16,5. Komórki mezenchymalne otaczające łodygę moczowodu są również zróżnicowane w trzy warstwy składające się z wewnętrznych komórek zrębu, pośrednich grubych komórek mięśni gładkich i zewnętrznych fibroblastów przybyszowych. Fale perystaltyczne moczowodu inicjowane w miedniczce nerkowej są rozchodzone przez warstwę mięśni gładkich ściany moczowodu do pęcherza moczowego w celu transportu moczu2,3, który jest wytwarzany począwszy od E16.5 w mouse1.
Wrodzone anomalie nerek i dróg moczowych (CAKUT) są jednymi z najczęstszych chorób genetycznych, występują u około 1% płodów ludzkich1,4, i składają się z różnych fenotypów, w tym wodonercza i wodniaka. Nieprawidłowe gromadzenie moczu w nerkach i moczowodach powoduje powstawanie wodonercza nerek i wodniaka. Jedną z przyczyn wodonercza i/lub powstawania wodomoczowodu jest niedrożność dróg moczowych. Niedrożność połączenia moczowodowo-miednicznego (UPJO) jest spowodowana nieprawidłowym przepływem moczu z powodu zablokowania między bliższym moczowodem a miedniczką nerkową, co powoduje wodonercze i zwężenie proksymalnej wodniaki moczowodowej z kątowaniem lub uporczywym fałdowaniem5,6. Ponadto ektopowe wprowadzenie dystalnego moczowodu do ściany pęcherza moczowego lub do układu rozrodczego nazywa się niedrożnością połączenia moczowodowo-pęcherzowego (UVJO). UVJO może również indukować wodonercze i tworzenie się wodonercza7,8. Dodatkowym ubytkiem połączenia moczowodowo-pęcherzowego (UVJ) jest refluks pęcherzowo-moczowodowy (VUR). VUR charakteryzuje się wstecznym przepływem moczu z pęcherza w kierunku nerki w UVJ. W porównaniu z UVJO, zarodki okołoporodowe z VUR nie wykazują wyraźnie rozdętego fenotypu nerki wodonerczej ani ciężkiego fenotypu wodniaka moczowodowego9.
U myszy laboratoryjnej przepływ moczu może być badany przez wstrzyknięcie barwnika, takiego jak błękit metylenowy, do miedniczki nerkowej9. Wstrzyknięty roztwór błękitu metylenowego będzie śledził trajektorię moczu od miedniczki nerkowej przez moczowód do pęcherza moczowego. Wodonercze można rozpoznać po rozszerzeniu barwnika w nerkach. UPJO można wykryć jako zablokowanie przepływu barwnika w bliższym moczowodzie z rozdętą miedniczką nerkową5. Każde rozszerzenie moczowodu wskazane przez poszerzoną średnicę pokazuje przykład hydromoczowodu. Wreszcie, nagromadzenie barwnika na ścianie pęcherza moczowego lub w miejscu układu rozrodczego wskazuje na UVJO z rozdętą nerką wodonerczą i rozszerzonym hydromoczowodem 7,10. Aby wykryć VUR, roztwór barwnika jest wstrzykiwany do pęcherza moczowego, a następnie monitorowany jest przepływ wsteczny w nerce9.
Tutaj przedstawiono protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej zarodka okołoporodowego. Protokół ten umożliwia śledzenie przepływu moczu z miedniczki nerkowej przez moczowód do pęcherza moczowego i weryfikuje potencjalne niedrożności połączeń dróg moczowych, takie jak UPJO lub UVJO.

<table><tbody><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc. NORMALNA SÓL FIZJOLOGICZNA - 500ML</td><td>Fisherscientific</td><td>50-983-204</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 3 ml z końcówką BD Luer-Lok</td><td></td><td>Filtry</td> strzykawkowe BD 309657 <td></td></tr><tr><td>Acrodisc z membraną Supor</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Exel Zestawy żył skóry głowy (motyla); 27G x 3/4" 12"&nbsp;</td><td>EXELINT</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki operacyjne</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kleszcze preparacyjne</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont; Wzór #5</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>BD Igły PrecisionGlide 30 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Wady niedrożności połączeń dróg moczowych to wrodzone anomalie wywołujące wodonercze i wodnik. Wady niedrożności połączeń dróg moczowych u myszy można ocenić, śledząc przepływ barwnika błękitu metylenowego w układzie moczowym. Barwnik błękitu metylenowego jest wstrzykiwany do miedniczki nerkowej okołoporodowych nerek embrionalnych, a przepływ barwnika jest monitorowany z miedniczki nerkowej nerki przez moczowód i do światła pęcherza moczowego po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego. Nagromadzenie barwnika będzie widoczne w świetle pęcherza moczowego normalnych okołoporodowych dróg moczowych, ale będzie ograniczone między miedniczką nerkową a punktem końcowym nieprawidłowego moczowodu, jeśli wystąpi niedrożność dróg moczowych. Metoda ta ułatwia stwierdzenie niedrożności połączeń dróg moczowych oraz uwidocznienie wodonercza i wodniaka. Manuskrypt ten opisuje protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej w celu potwierdzenia niedrożności połączeń dróg moczowych.

Nerki i dolny układ moczowy znajdują się grzbietowo względem większości pozostałych narządów wewnętrznych, takich jak wątroba i jelita. Po usunięciu tych narządów widoczna jest para nerek i moczowodów oraz pojedynczy pęcherz moczowy (Rycina 1A). Po prawidłowym przeprowadzeniu sekcji barwnik wstrzyknięty do miedniczki nerkowej będzie przepływać z nerki do pęcherza moczowego poprzez moczowód. Miedniczka nerkowa to lejkowata, rozszerzona część proksymalna moczow...

Wstrzyknięcie barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej ułatwia ocenę wad niedrożności połączeń dróg moczowych podczas rozwoju embrionalnych dróg moczowych myszy. W tym miejscu opisano protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej.

Ocena wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie obecności niedrożności połączeń dróg moczowych poprzez wstrzyknięcie barwnika treścienowego do nerek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju nerek i dolnych dróg moczowych, takie jak połączenie moczowodery z pęcherzem. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona prosty sposób wizualizacji struktury dróg moczowych w przypadku rozwoju mas tkankowych, co umożliwia analizę rozwoju dróg moczowych.Aby rozpocząć eksperyment, odważ 0,1 g proszku błękitu metylenowego. Rozpuść błękit metylenowy w 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) i wymieszaj całość za pomocą wortexa. Następnie przefiltruj roztwór błękitu metylenowego o stężeniu 10 mg/ml za pomocą filtra strzykawkowego, aby zapobiec zatykaniu się igły podczas wstrzykiwania.Następnie przygotuj sterylny zestaw do pobierania krwi z żyły z jednorazową strzykawką o pojemności trzech mililitrów i napełnij strzykawkę trzema mililitrami przefiltrowanego roztworu błękitu metylenowego. Oczyść nożyczki i pęsetę anatomiczną 70% etanolem. Aby pobrać embriony w okresie okołoporodowym w dniach E18.5 lub E19.5, w pierwszej kolejności uśmierć ciężarne myszy poprzez inhalację dwutlenkiem węgla.Następnie przeprowadzić zwichnięcie stawów szyjnych zgodnie z wytycznymi NIH. Następnie spryskać 70% ethanol brzuszną powierzchnię brzucha zwierzęcia. Po tym czasie, używając sterylnych nożyczek do dyssekcji i pęsety, otworzyć jamę brzuszną od strony brzusznej.Wyjmij całą macicę i oddziel ją od organizmu w obrębie końców rogów macicy. Następnie przepłucz całą macicę w 1x PBS w szalce Petriego. Przetnij macicę segmentowo za pomocą nożyczek preparacyjnych i usuń błonę decydualną łożyska pęsetą preparacyjną, aby odsłonić zarodki i pęcherzyki żółtkowe.Najpierw usuń pęcherzyk żółtkowy, a następnie za pomocą pęsety sekcyjnej usuń błonę owodniową, aby uwolnić embriony perinatalne. Odetnij głowę embrionu za pomocą nożyczek sekcyjnych. Przymocuj embrion szpilkami stroną brzuszną do góry na mikroskopie sekcyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową do obrazowania.Pobrać ogon do genotypowania. Za pomocą pęsety ostrożnie rozciąć skórę, aby otworzyć jamę brzuszną zarodka. Następnie ostrożnie usunąć nadmiar narządów i tkanek, takich jak wątroba, żołądek i jelita, używając pęsety poprzez ich wycięcie lub wyciągnięcie, aby odsłonić położone grzbietowo nerki, moczowody i pęcherz moczowy.Nadmiar krwi z wypreparowanego zarodka wchłoń za pomocą sterylnych gazików, a następnie przejdź do wstrzykiwania barwnika. Usuń pęcherzyki powietrza z igły i cewki, wypychając roztwór błękitu metylenowego z końcówki igły za pomocą ciśnienia hydrostatycznego. Unieś strzykawkę z roztworem barwnika powyżej poziomu końcówki igły, aby rozpocząć przepływ.Następnie opuść strzykawkę, aby zatrzymać przepływ. Dalej wprowadź igłę do miednicy nerkowej w pobliżu proksymalnego odcinka moczowodu, uważając, aby nie przesunąć jej po umieszczeniu. Wykonaj wtryskiwanie barwnika do nerki w celu oceny niedrożności dróg moczowych.Po wprowadzeniu jednej igły do miednicy nerkowej w celu potwierdzenia sukcesu tego testu, należy wprowadzić igłę do miednicy nerkowej w kierunku moczowodu, tak aby nie przechodziła ona przez nerkę ani nie znajdowała się w pobliżu naczyń krwionośnych. Unieś strzykawkę na wysokość około 20 centymetrów, aby zapewnić ciśnienie hydrostatyczne, i pozwól na wpłynięcie od 15 do 16 µl roztworu barwnika. Następnie monitoruj niebieski kolor barwnika, pojawiający się najpierw w miednicy nerkowej, następnie wzdłuż moczowodu, a na koniec w świetle pęcherza moczowego.Połóż strzykawkę, aby zatrzymać przepływ barwnika, a następnie wyjmij igłę z nerki. Odnotuj w dzienniku laboratoryjnym występowanie wodniaka nerki, wodniaka moczowodu oraz końcowe położenie roztworu barwnika. Na koniec wykonaj wstrzykiwanie do nerki przeciwległej i pozwól barwnikowi przepływać przez łącznie 20 sekund.Za pomocą kamery i programu do obrazowania podłączonego do stereomikroskopu należy wykonać zdjęcia nerki, moczowodu i pęcherza moczowego wypełnionych roztworem barwnika. Po wstrzyknięciu do jednej nerki barwnik błękitu metylenowego przepływa z miedniczki nerkowej przez moczowód do pęcherza moczowego, co powoduje widoczne niebieskie zabarwienie światła moczowodu i pęcherza. Silniejszy odcień niebieskiego pojawia się w świetle pęcherza moczowego po około 20 sekundach od wstrzyknięcia barwnika do obu nerek w wyniku dłuższego przepływu, co wskazuje na brak niedrożności złączy dróg moczowych w drugim układzie moczowym.Podczas wstrzykiwania do nieprawidłowo poszerzonego wodomoczowodu końcowa pozycja roztworu barwnika pozostaje niejasna. Ponadto niedrożności połączenia moczowód-pęcherz (UVJO) nie można zweryfikować mimo braku barwnika w świetle pęcherza, ponieważ patologicznie poszerzony moczowód uległ uszkodzeniu w części środkowej. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury należy pamiętać o obliczeniu ilości barwnika dla embrionów okołorodnych, aby uzyskać nienaruszony układ moczowy.Należy usunąć pęcherzyki powietrza, aby nie blokowały przepływu barwnika.

assessing-urinary-tract-junction-obstruction-defects-methylene-blue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Utrata integralności otrzewnej stanowi nowy paradygmat w rozumieniu i leczeniu przewlekłego bólu miednicy u kobiet z łagodnymi postaciami endometriozy i może być łatwo wykryta poprzez śródoperacyjne podanie barwnika podczas laparoskopii.

Śródoperacyjne wykrywanie subtelnej endometriozy: nowy paradygmat diagnostyki i leczenia bólu miednicy związanego z utratą integralności otrzewnej

Sondowa konfokalna laserowa endomikroskopia umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym dróg moczowych człowieka podczas cystoskopii, zapewniając dynamiczne obrazowanie intravitalne stanów patologicznych, takich jak rak pęcherza moczowego, z rozdzielczością komórkową. Endomikroskopia może zwiększyć dokładność diagnostyczną standardowej endoskopii w białym świetle oraz zapewnić śródoperacyjne prowadzenie obrazowe w celu usprawnienia resekcji chirurgicznej.

Sondowa konfokalna laserowa endomikroskopia dróg moczowych: Technika

W tym filmie podajemy iniekcję barwnika błękitu metylenowego do dróg moczowych myszy embrionalnej, aby ocenić wrodzone anomalie związane z niedrożnością dróg moczowych.

Wstrzyknięcie barwnika błękitu metylenowego w zarodkowych drogach moczowych myszy: metoda oceny wrodzonej niedrożności dróg moczowych

Cystografia fotoakustyczna (PAC) ma ogromny potencjał do mapowania pęcherzy moczowych, wrażliwego na promieniowanie narządu wewnętrznego u pacjentów pediatrycznych, bez użycia promieniowania jonizującego lub toksycznego środka kontrastowego. Tutaj demonstrujemy zastosowanie PAC do mapowania pęcherzy moczowych z wstrzyknięciem nieprzezroczystych optycznie znaczników u szczurów in vivo.

Cystografia fotoakustyczna

Inkraplanie przezcewkowe jest trudną procedurą i nie zostało dobrze opisane w literaturze. Celem pracy jest opisanie techniki przezcewkowego wprowadzania cewnika do dopęcherzowego podawania płynów z substancjami czynnymi do pęcherza moczowego i/lub prostaty u dorosłych samców myszy.

Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy

Opisujemy użycie ultradźwięków o wysokiej częstotliwości z obrazowaniem kontrastowym jako metody pomiaru objętości pęcherza, grubości ściany pęcherza, prędkości moczu, objętości miki, czasu trwania miki i średnicy cewki moczowej. Strategia ta może być stosowana do oceny dysfunkcji mikcji i skuteczności leczenia w różnych mysich modelach dysfunkcji dolnych dróg moczowych (LUTD).

Ultrasonografia dróg moczowych dorosłego mężczyzny w celu badania czynnościowego moczu

Ten protokół opisuje procedurę pomiaru stężenia ATP w świetle pęcherza moczowego u znieczulonego gryzonia.

In vivo (in vivo) Pomiar luminalny wywołanego rozdęciem urotelialnego uwalniania ATP u gryzoni

Ten protokół zawiera przewodnik do impregnacji skóry cyjanoakrylem, aby zapobiec wchłanianiu moczu przez sierść i skórę. Zawiera instrukcję nakładania kleju na skórę, wszczepiania cewnika do pęcherza moczowego oraz elektrody do cystometrii i zapisy elektromiografii zewnętrznego zwieracza cewki moczowej u obudzonych myszy.

Optymalizacja technik urodynamicznych myszy w celu zwiększenia dokładności

Obecny protokół opisuje krok po kroku, powtarzalny model jednostronnej niedrożności moczowodu.

Niedojrzały mysi model odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Naucz się oceny wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację struktur układu moczowego i identyfikację anomalii rozwojowych.

Ocena wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego

Przeglądaj więcej filmów