Ulepszona metoda pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od znieczulonych myszy
19 marca 2018
Ten protokół opisuje ulepszoną technikę obfitego gromadzenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) bez zanieczyszczenia krwią. Dzięki lepszemu pobieraniu i czystości próbek można wykonać więcej analiz przy użyciu płynu mózgowo-rdzeniowego, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób wpływających na mózg i rdzeń kręgowy.
Ogólnym celem tej procedury jest poprawa pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy bez zanieczyszczenia krwią. Metoda ta zapewnia łatwy i niezawodny sposób zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego w celu monitorowania biomarkerów chorób nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dodanie za pomocą mikromanipulatora w celu pomocy w pobieraniu płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy zmniejsza zanieczyszczenie krwi podczas pobierania.
Zacznij od umieszczenia wyciągniętej szklanej kapilary w uchwycie kapilarnym, który jest mocno zamontowany na mikromanipulatorze. Następnie, oglądając przez mikroskop sekcyjny, użyj prostych kleszczy, aby złamać końcówkę zaostrzonej kapilary tak, aby wewnętrzna średnica złamanej końcówki wynosiła około 10 do 20 mikronów. Następnie przymocuj cienką rurkę i strzykawkę do drugiego końca uchwytu kapilary, połącz cienką rurkę i strzykawkę z zaworem trójdrogowym i przesuń zawór trójdrogowy, aby się otworzył.
Następnie zanurz strzykawkę, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i wytworzyć nadciśnienie w rurce kapilarnej. Powtórz to kilka razy, odłączając i ponownie podłączając strzykawkę do zaworu trójdrogowego. Następnie wciągnąć powietrze do 100 do 200 mikrolitrów przed ostatecznym ponownym połączeniem strzykawki z zaworem trójdrogowym.
Przesuń mikromanipulator ze szklaną kapilarą na bok, aby zapobiec uszkodzeniom podczas zabiegu chirurgicznego. Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że mysz została w pełni znieczulona, ściskając wszystkie cztery kończyny i obserwując brak reakcji. Następnie użyj nożyczek preparujących, aby przyciąć i przyciąć włosy z tyłu głowy myszy od oczu, między uszami do dolnej części szyi.
Zabezpiecz główkę myszy za pomocą stereotaktycznego adaptera myszy ramkowej. Upewnij się, że głowica nie może się poruszać i jest mocno zamocowana w adapterze, delikatnie dociskając do główki myszy. Użyj nożyczek i zakrzywionych kleszczy, aby przeciąć skórę myszy z tyłu szyi, a następnie w dół środka czaszki między uszami i oczami myszy.
Rozsuń skórę i tkankę i usuń ją z obszaru nad cisterna magna. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, ostrożnie wypreparuj ostatnie cienkie warstwy mięśni nad podstawą czaszki za pomocą kleszczy i przesuń te warstwy mięśni na bok i poza obszar zainteresowania. Gdy opona twarda nad cisterna magna zostanie odsłonięta, użyj mokrego wacika, aby wytrzeć membranę do czysta, a następnie użyj suchego wacika, aby wysuszyć obszar.
Cisterna magna wydaje się trójkątna z jednym lub dwoma dużymi naczyniami krwionośnymi biegnącymi przez ten obszar. Każda strona lub między naczyniami krwionośnymi jest optymalna do wprowadzenia kapilary i pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Po odsłonięciu cisterna magna użyj mikromanipulatora, aby wyrównać szklaną kapilarnę z tyłem głowy myszy tak, aby zaostrzony punkt znajdował się tuż za membraną pod kątem od 30 do 45 stopni.
Następnie zanurz strzykawkę raz lub kilka razy, a następnie cofnij tłok o 100 do 200 mikrolitrów, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń i że w szklanej kapilarze występuje podciśnienie. Następnie przesuń końcówkę kapilary bliżej membrany, aż będzie widać opór, ale bez przebijania membrany. Dotknij elementów sterujących mikromanipulatora, aby delikatnie postukać rurką kapilarną przez membranę.
Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien być automatycznie wciągany do rurki kapilarnej po przebiciu otworu. Pozostaw kapilę na miejscu, aby powoli zbierać płyn mózgowo-rdzeniowy. Jeśli płyn mózgowo-rdzeniowy przestał płynąć, powoli wciągnij strzykawkę do około 50 mikrolitrów, aby wytworzyć większe podciśnienie w kapilarze.
Dziesięć do 15 mikrolitrów płynu mózgowo-rdzeniowego zbiera się w ciągu 10 do 30 minut. Po zebraniu żądanej objętości płynu mózgowo-rdzeniowego zamknij rurkę, przesuwając zawór trójdrogowy w celu zamknięcia i wyjęcia strzykawki podłączonej do rurki. Otwórz, a następnie zamknij rurkę, aby wytworzyć wyrównane ciśnienie w kapilarze, rurce i obszarze na zewnątrz kapilary.
Następnie ponownie podłącz strzykawkę, a następnie delikatnie wyjmij szklaną kapilarnę z myszy za pomocą mikromanipulatora. Następnie umieść probówkę zawierającą jeden mikrolitr 20-krotnego inhibitora proteazy pod zaostrzonym końcem szklanej kapilary. Otwórz rurkę i delikatnie zanurz strzykawkę.
Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien wypłynąć z kapilary i trafić do probówki zbiorczej. Po pobraniu odwirować impulsowo płyn mózgowo-rdzeniowy, aby wymieszać próbkę z inhibitorem proteazy znajdującym się na dnie probówki zbiorczej. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego można podasumować, a następnie przechowywać do dalszej analizy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany od myszy APP/PS1 wykazał znaczny wzrost poziomu ludzkiego A beta 42 w wieku 12 miesięcy. U myszy typu dzikiego nie wykryto u człowieka A beta 42. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać naczyń krwionośnych podczas wprowadzania naczynia włosowatego i dokonywać tylko niewielkich korekt za pomocą mikromanipulatora podczas pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego, aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje udoskonaloną metodę pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) od myszy z minimalnym zanieczyszczeniem krwią. Wykorzystując mikromanipulator, ta technika poprawia czystość i objętość próbki, umożliwiając lepszą analizę biomarkerów w chorobach układu nerwowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza płynu mózgowo-rdzeniowego
- Badania nad chorobami neurologicznymi
Tło
- PMR jest krytyczny dla zrozumienia chorób mózgu i rdzenia kręgowego.
- Zanieczyszczenie krwią podczas pobierania może kompromitację wyniki badań.
- Ulepszone metody pobierania mogą poprawić integralność próbek do analizy biomarkerów.
- Ta technika ma na celu ułatwienie badań nad stanami neurodegeneracyjnymi.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody pobierania PMR od myszy.
- Minimalizacja zanieczyszczenia krwią podczas procesu pobierania.
- Możliwość bardziej dokładnego monitorowania biomarkerów chorób układu nerwowego.
Stosowane metody
- Metoda wykorzystuje mikromanipulator z kapilarą szklaną do precyzyjnego pobierania PMR z cysterny wielkiej.
- Myszy są odpowiednio znieczulone, a zastosowane są techniki chirurgiczne w celu ekspozycji cysterny wielkiej na włożenie kapilary.
- Nie odnoszą się do żadnych przepływów multiomics; skupia się na pobieranie PMR.
- Procedura może zostać zakończona w około godzinę z praktyką.
- PMR miesza się z inhibitorem proteazy po pobraniu w celu zachowania próbki.
Główne wyniki
- Technika pozwala na pobranie 10 do 15 mikrolitrów PMR w ciągu 10 do 30 minut.
- PMR pobranym od myszy APP/PS1 wykazano znaczny wzrost poziomów ludzkiego A beta 42 po 12 miesiącach.
- Żaden A beta 42 nie został wykryty w próbkach od myszy dzikiego typu.
- Skuteczna metoda procedury i zdolność do uniknięcia zanieczyszczenia krwią zostały pomyślnie wykazane.
Wnioski
- To badanie pokazuje skuteczną metodę pozyskiwania PMR od myszy, minimalizując zanieczyszczenie.
- Poprawiona czystość i objętość zebranego PMR może poprawić analizę biomarkerów w badaniach nad chorobami układu nerwowego.
- Współczynnik ten przyczynia się do lepszego zrozumienia dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego w zaburzeniach neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through biomarker analysis in a disease-relevant system with reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides reproducible access to CSF for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-based go/no-go decisions by improving confidence in target-related molecular changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified CSF samples suitable for quantitative biomarker assays, enhancing screening reliability.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, reducing variability in downstream analytical workflows.
- Scalability: Enables consistent CSF collection across cohorts, supporting assay validation and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment from discovery through preclinical validation using disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of target biomarkers like human A beta 42 in APP/PS1 mice, strengthening predictive confidence.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven progression decisions based on detectable biomarker changes in neural disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through biomarker measurement in CSF.
- Screening: Enables assay-ready sample generation with consistent volume and purity for compound evaluation.
- Analytics: Yields quantitative biomarker readouts (e.g., human A beta 42) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects CSF biomarker dynamics to preclinical disease progression in genetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable capability for CSF collection across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through cleaner, higher-volume biomarker data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of CSF collection across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed experiments due to contaminated or insufficient samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable biomarker fluctuations in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and micromanipulator operation for precise capillary positioning.
- Dependent on dissection microscopy, stereotaxic framing, and fluid handling instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of surgical and collection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation to other models may require anatomical adjustments due to variations in cisterna magna accessibility.
- Practical limitations include dependence on operator skill and potential physiological variability in CSF yield.
