Ulepszona metoda pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od znieczulonych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy bez zanieczyszczenia krwią. Metoda ta zapewnia łatwy i niezawodny sposób zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego w celu monitorowania biomarkerów chorób nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dodanie za pomocą mikromanipulatora w celu pomocy w pobieraniu płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy zmniejsza zanieczyszczenie krwi podczas pobierania.

Zacznij od umieszczenia wyciągniętej szklanej kapilary w uchwycie kapilarnym, który jest mocno zamontowany na mikromanipulatorze. Następnie, oglądając przez mikroskop sekcyjny, użyj prostych kleszczy, aby złamać końcówkę zaostrzonej kapilary tak, aby wewnętrzna średnica złamanej końcówki wynosiła około 10 do 20 mikronów. Następnie przymocuj cienką rurkę i strzykawkę do drugiego końca uchwytu kapilary, połącz cienką rurkę i strzykawkę z zaworem trójdrogowym i przesuń zawór trójdrogowy, aby się otworzył.

Następnie zanurz strzykawkę, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i wytworzyć nadciśnienie w rurce kapilarnej. Powtórz to kilka razy, odłączając i ponownie podłączając strzykawkę do zaworu trójdrogowego. Następnie wciągnąć powietrze do 100 do 200 mikrolitrów przed ostatecznym ponownym połączeniem strzykawki z zaworem trójdrogowym.

Przesuń mikromanipulator ze szklaną kapilarą na bok, aby zapobiec uszkodzeniom podczas zabiegu chirurgicznego. Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że mysz została w pełni znieczulona, ściskając wszystkie cztery kończyny i obserwując brak reakcji. Następnie użyj nożyczek preparujących, aby przyciąć i przyciąć włosy z tyłu głowy myszy od oczu, między uszami do dolnej części szyi.

Zabezpiecz główkę myszy za pomocą stereotaktycznego adaptera myszy ramkowej. Upewnij się, że głowica nie może się poruszać i jest mocno zamocowana w adapterze, delikatnie dociskając do główki myszy. Użyj nożyczek i zakrzywionych kleszczy, aby przeciąć skórę myszy z tyłu szyi, a następnie w dół środka czaszki między uszami i oczami myszy.

Rozsuń skórę i tkankę i usuń ją z obszaru nad cisterna magna. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, ostrożnie wypreparuj ostatnie cienkie warstwy mięśni nad podstawą czaszki za pomocą kleszczy i przesuń te warstwy mięśni na bok i poza obszar zainteresowania. Gdy opona twarda nad cisterna magna zostanie odsłonięta, użyj mokrego wacika, aby wytrzeć membranę do czysta, a następnie użyj suchego wacika, aby wysuszyć obszar.

Cisterna magna wydaje się trójkątna z jednym lub dwoma dużymi naczyniami krwionośnymi biegnącymi przez ten obszar. Każda strona lub między naczyniami krwionośnymi jest optymalna do wprowadzenia kapilary i pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Po odsłonięciu cisterna magna użyj mikromanipulatora, aby wyrównać szklaną kapilarnę z tyłem głowy myszy tak, aby zaostrzony punkt znajdował się tuż za membraną pod kątem od 30 do 45 stopni.

Następnie zanurz strzykawkę raz lub kilka razy, a następnie cofnij tłok o 100 do 200 mikrolitrów, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń i że w szklanej kapilarze występuje podciśnienie. Następnie przesuń końcówkę kapilary bliżej membrany, aż będzie widać opór, ale bez przebijania membrany. Dotknij elementów sterujących mikromanipulatora, aby delikatnie postukać rurką kapilarną przez membranę.

Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien być automatycznie wciągany do rurki kapilarnej po przebiciu otworu. Pozostaw kapilę na miejscu, aby powoli zbierać płyn mózgowo-rdzeniowy. Jeśli płyn mózgowo-rdzeniowy przestał płynąć, powoli wciągnij strzykawkę do około 50 mikrolitrów, aby wytworzyć większe podciśnienie w kapilarze.

Dziesięć do 15 mikrolitrów płynu mózgowo-rdzeniowego zbiera się w ciągu 10 do 30 minut. Po zebraniu żądanej objętości płynu mózgowo-rdzeniowego zamknij rurkę, przesuwając zawór trójdrogowy w celu zamknięcia i wyjęcia strzykawki podłączonej do rurki. Otwórz, a następnie zamknij rurkę, aby wytworzyć wyrównane ciśnienie w kapilarze, rurce i obszarze na zewnątrz kapilary.

Następnie ponownie podłącz strzykawkę, a następnie delikatnie wyjmij szklaną kapilarnę z myszy za pomocą mikromanipulatora. Następnie umieść probówkę zawierającą jeden mikrolitr 20-krotnego inhibitora proteazy pod zaostrzonym końcem szklanej kapilary. Otwórz rurkę i delikatnie zanurz strzykawkę.

Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien wypłynąć z kapilary i trafić do probówki zbiorczej. Po pobraniu odwirować impulsowo płyn mózgowo-rdzeniowy, aby wymieszać próbkę z inhibitorem proteazy znajdującym się na dnie probówki zbiorczej. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego można podasumować, a następnie przechowywać do dalszej analizy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany od myszy APP/PS1 wykazał znaczny wzrost poziomu ludzkiego A beta 42 w wieku 12 miesięcy. U myszy typu dzikiego nie wykryto u człowieka A beta 42. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać naczyń krwionośnych podczas wprowadzania naczynia włosowatego i dokonywać tylko niewielkich korekt za pomocą mikromanipulatora podczas pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego, aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.