System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Protokół ten pomaga nam określić, w jaki sposób zmiany w lokalnej biomechanice, architekturze tkanek, środowiskach parakrynnych i interakcjach przyklatkowych wpływają na fenotyp komórkowy. Technika ta pozwala nam badać klasyczne paradygmaty i embriologię eksperymentalną bez powodowania zniewag tkankowych na dużą skalę, które zwykle pojawiają się w tradycyjnych eksperymentach z wykresami. Aby znaleźć odpowiednie ciśnienie do wstrzykiwania, pomocne jest rozpoczęcie od niższego ciśnienia iniekcji i stopniowe zwiększanie, aż do osiągnięcia stałego przepływu komórek.

Wizualizacja tej techniki pomaga w bezpośrednim zrozumieniu, w jaki sposób należy ustawić sprzęt do wstrzykiwania w stosunku do tkanki docelowej. Procedurę zademonstrują dwaj członkowie mojego laboratorium, Trevor Henley i Kandace Thomas. Na 24 godziny przed implantacją należy naciągnąć szklane naczynia włosowate na ściągacz do mikropipet zgodnie ze standardowymi protokołami i zanurzyć naczynia włosowate w środku silikonowym, aby pokryć zewnętrzne powierzchnie igieł.

Następnie załaduj od 5 do 10 mikrolitrów środka silikonowego do końcówki pipety do mikroiniekcji i umieść końcówkę na szerokim końcu jednej z zewnętrznie powlekanych kapilar ze szkła ciągnionego. Umieść końcówkę pipety jak najbliżej szklanej końcówki igły i wyrzuć środek silikonowyzujący, powoli chowając pipetę ładującą, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza wewnątrz igły. Pozostaw środek silikonowy w szklanej igle na 10 minut przed użyciem nowej pipety ładującej do zasysania roztworu.

Następnie wysusz igły w dygestorium przez noc. W celu przygotowania zarodków gospodarza należy inkubować płodne jaja kurze w orientacji poziomej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza i użyć kleszczy pod kątem, aby wykonać nakłucie o średnicy większej niż jeden milimetr w dolnej części płaskiego końca każdego jaja wzdłuż równika jaja. Włóż igłę o rozmiarze 18 dołączoną do 10-mililitrowej strzykawki do nakłucia, aby usunąć około pięciu mililitrów białka.

I nałóż przezroczystą taśmę na wierzch skorupki jajka. Naciąć przyklejony obszar wzdłuż górnej części jajka za pomocą kątowych kleszczy i użyj zakrzywionych nożyczek do tenotomii, aby wyciąć około 2,5-centymetrowe okno w zaklejonej taśmą części jajka. Zbadaj i ustalij stopień zarodka w oparciu o kryteria ustalone przez Hamburgera i Hamiltona i użyj jednomilimetrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 32, aby wstrzyknąć około 200 mikrolitrów atramentu indyjskiego o rozcieńczeniu od jednego do pięciu w HBSS pod zarodek.

Następnie uszczelnij nakłucie przezroczystą taśmą i dodaj kroplami jeden mililitr HBSS na krążek zarodka, a następnie uszczelnij otoczkę z okienkiem folią parafinową w celu umieszczenia jaja z powrotem w nawilżanym inkubatorze. Kiedy zarodki osiągną stadium 19 Hamburgera i Hamiltona, spłucz szklane naczynia włosowate pokryte silikonem wodą dejonizowaną i pozostaw naczynia włosowate do wyschnięcia przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przenieś zarodek z jednej komórki jajowej na szalkę Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów zawierającą sterylny HBSS o temperaturze pokojowej i umieść szalkę pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki odizoluj całe serce zarodkowe od zarodka i odizoluj przedsionki od serca. Umieść tkankę przedsionkową w sterylnej 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr HBSS na lodzie. Po pobraniu całej tkanki dawcy należy ogranulować tkanki przez odwirowanie w mikrowirówce o stałym kącie.

W celu trawienia tkanek dawcy ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej 05% trypsyny EDTA na 15-minutową inkubację w bloku ciepła wytrząsającym przy 300 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji kilkakrotnie odpipetować roztwór wytrawiający w celu rozdrobnienia pozostałej tkanki i osadzać lizat serca przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu neutralizującego trypsynę do kolejnego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić w 400 mikrolitrach roztworu czerwonego barwnika fluorescencyjnego.

Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza osadzać komórki przez odwirowanie przez jedno do trzech prań w jednym mililitrze HBSS na pranie. Następnie ponownie zawiesić znakowane komórki w stężeniu pięć razy dziesięć do czwartej komórki na mikrolitr w świeżym HBSS. W przypadku iniekcji in vivo komórek dawcy należy załadować zawiesinę komórek do suchej, szklanej pipety kapilarnej nasączonej silikonem, jak pokazano, i zamontować pipetę w ciśnieniowym aparacie do mikroiniekcji.

Przenieść każdy zarodek gospodarza do wstrzyknięcia z nawilżanego inkubatora do uchwytu na jaja pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. I użyj sterylnych cienkich kleszczyków, aby otworzyć membranę witelinową. Wykonać 5-1 milimetrowe nacięcie w osierdziu i ustawić mikrowstrzykiwacz tak, aby końcówka igły do mikroiniekcji penetrowała tkankę docelową.

Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby aplikował pojedyncze impulsy o czasie trwania 5 sekund i ciśnieniu w zakresie od 100 do 400 hektopaskalów. I wstrzyknąć komórki pod ciśnieniem. Bardzo ważne jest, aby zweryfikować pomyślną implantację komórki poprzez obrazowanie sygnału fluorescencyjnego przed ponownym zamknięciem komórki jajowej.

Zarodek można również sfotografować, aby udokumentować tę procedurę. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek należy wycofać aparat do mikrowstrzykiwaczy i wyjąć komórkę jajową z uchwytu. Następnie dodaj kroplami jeden mililitr ciepłego HBSS na zarodek.

Zapieczętuj jajo przezroczystą taśmą pakową i umieść jajo z powrotem w wilgotnym inkubatorze na 24 godziny po implantacji. W tym miejscu pokazano serce i otaczającą tkankę embrionalnego serca gospodarza po implantacji miocytów przedsionkowych dawcy. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki dawcy zostały mikrowstrzyknięte do nadbłonka sierdzia zarodka gospodarza w podobnym stadium

Sekcja optyczna przy użyciu mikroskopu konfokalnego ujawniła, że jedynymi komórkami dodatnimi pod względem markera mięśnia sercowego w obrębie nadsierdzia były wszczepione ogniskowo fluorescencyjne czerwone komórki dodatnie. Należy uważać, aby nie manipulować zarodkiem biorcy, ponieważ pęknięcia serca i miejscowego unaczynienia spowodowane przez igłę do wstrzykiwań mogą skutkować zmniejszeniem żywotności. Po tej procedurze można przeprowadzić różne dalsze testy, w tym immunohistochemię, hybrydyzację in situ i sortowanie komórek.

Środek silikonowy jest skrajnie łatwopalny i bardzo toksyczny. Z urządzeniem należy zawsze obchodzić się ostrożnie i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej wewnątrz dygestoria.