Name: System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji kardiomiocytów zarodkowych do zarodków ptaków w celu badania rozwoju tkanki sercowej. Ta metoda umożliwia analizę lokalnych warunków biomechanicznych i interakcji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R00HL122360 grantowe z National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).

Wszystkie opisane metody są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill.
1. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wyciągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet. W przypadku niektórych iniekcji zaleca się ukosowanie igłą, ponieważ zapewnia ono wyjątkowo ostrą powierzchnię pozbawioną zanieczyszczeń strukturalnych. W tym celu należy wypolerować koniec ciągniętej igły na ściernicy do ukosowania pod kątem 45° przez 15−20 min. 
	UWAGA: Dokładne ustawienia ciągnięcia będą się różnić w zależności od używanego ściągacza. Ostateczna średnica wewnętrzna skosu powinna wynosić od 20 do 40 μm.</li>
	<li>Pokryj wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię szklanej kapilary silikonem. Najpierw zanurz igły w środku silikonowym, aby pokryć zewnętrzną powierzchnię igły, a następnie załaduj roztwór środka silikonowającego z powrotem do każdej mikropipety, aby pokryć wewnętrzną powierzchnię. 
	UWAGA: Powlekanie szklanych naczyń włosowatych powinno być wykonane 24 godziny przed eksperymentem implantacyjnym. Pokrycie szklanych kapilar silikonem zapewnia chemicznie obojętną powierzchnię szkła. Jeśli naczynia włosowate nie zostaną poddane leczeniu, zawiesina komórek wytworzona w późniejszych krokach przylgnie do szkła i zatka igłę. Dlatego powlekanie jest konieczne i niezbędne dla powodzenia metody. 
	UWAGA: Środek silikonowy jest gotową, dostępną na rynku mieszaniną heptanu i 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-oktametylotetrasiloksanu (tabela materiałów). Jest skrajnie łatwopalny i bardzo toksyczny. Zawsze należy obchodzić się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej wewnątrz dygestorium.
	<ol>
		<li>Aby ponownie załadować igłę, załaduj ~5−10 μl środka silikonowającego do końcówki pipety do mikroiniekcji (tabela materiałów). Umieść końcówkę do mikroiniekcji w szerokim końcu ciągniętej szklanej kapilary i umieść końcówkę jak najdalej w dół (blisko szklanej końcówki igły). Wysuń środek silikonowyzujący, powoli wyjmując pipetę ładującą, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza w igle.</li>
		<li>Pozostaw środek silikonowy w szklanej igle na 10 minut, usuń przez zasysanie nową pipetą ładującą i pozostaw igły do wyschnięcia na noc w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rano w dniu eksperymentu przepłukać szklane naczynia włosowate wodą dejonizowaną zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2 i pozostawić do wyschnięcia na 3-4 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 5 ml roztworu neutralizującego trypsynę, uzupełniając 4,2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's i mieszanki składników odżywczych szynki F12 firmy Dulbecco z 750 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 50 μl penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować 5 μM roztworu barwnika do etykietowania, pipetując 5 μl 1 mM podstawowego barwnika do etykietowania (w dimetylosulfotlenku [DMSO], tabela materiałów) do 995 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS). Wirować przez 1 minutę i przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj świeży paraformaldehyd (PFA), łącząc 10 ml 32% roztworu podstawowego PFA z 62 ml wody klasy biologii molekularnej i 8 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Końcowe stężenie to 4% PFA w 1x DPBS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodków gospodarza
<ol>
	<li>Inkubować płodne jaja kurze w orientacji poziomej w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C do Hamburger and Hamilton (HH) Stage 1910. 
	UWAGA: Etap wybrany do manipulacji jest elastyczny i całkowicie zależny od celów każdego indywidualnego eksperymentu.</li>
	<li>Naciąć "płaski" koniec skorupki jajka wzdłuż równika jaja za pomocą kątowych kleszczy, aby wykonać małe nakłucie o średnicy >1 mm. Wprowadzić igłę 18 G z dołączoną strzykawką 10 ml przez nakłucie i usunąć ~5 ml albuminy. 
	UWAGA: To anatomiczne miejsce znajduje się na zewnątrz "komórki powietrznej" wewnątrz komórki jajowej i zapobiega wyciekaniu albuminy po wykonaniu nakłucia. Ten krok jest zalecany, ponieważ "upuszcza" zarodek z dala od skorupki jaja, zapobiegając potencjalnym uszkodzeniom w kolejnych etapach.</li>
	<li>Nałóż przezroczystą taśmę na wierzch skorupki jajka. Naciąć kątowymi kleszczami i wyciąć okienko o długości ~2,5 cm za pomocą zakrzywionych nożyczek do tenotomii.</li>
	<li>Zbadaj i uporządkuj zarodek na podstawie kryteriów ustalonych przez Hamburger i Hamilton10 i zapieczętuj nakłucie z kroku 3.2 przezroczystą taśmą. 
	UWAGA: Tutaj stosuje się zarodki w stadium HH 19, które mają 37-40 somitów rozciągających się do pąka ogonowego. Nakłucie nie powinno być uszczelnione, dopóki okienko nie zostanie otwarte wzdłuż górnej części jaja (krok 3.3).</li>
	<li>Wstrzyknąć ~200 μL mieszaniny India Ink/HBSS (1:5) pod zarodek za pomocą igły 32 G z dołączoną strzykawką 1 ml. 
	UWAGA: Tusz indyjski zapewnia wizualny kontrast między zarodkiem a żółtkiem pod spodem. W celu poprawy kontrastu można stosować alternatywne barwniki, takie jak neutralny czerwony lub dostępne na rynku zestawy filtrów fluorescencyjnych z cyjanem białkiem fluorescencyjnym (CFP) lub niebieskim białkiem fluorescencyjnym (BFP).</li>
	<li>Dodać kroplami 1 ml HBSS na krążek zarodkowy i uszczelnić otoczki z okienkami folią parafinową. Umieścić jaja z powrotem w nawilżonym inkubatorze, aż będą gotowe do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Izolacja tkanki dawcy
<ol>
	<li>Inkubować płodne jaja kurze dawcy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 °C do etapu HH 19 (lub etapu pożądanego).</li>
	<li>Usunąć zarodek z komórki jajowej i umieścić na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierającej sterylny HBSS w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Chirurgicznie mikropreparuj tkankę dawcy przedsionków z każdego zarodka, najpierw izolując całe serce embrionalne od zarodka, a następnie izolując przedsionki od serca za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. Umieścić w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml HBSS na lodzie.</li>
	<li>Po pobraniu całej tkanki dawcy osadzać tkankę przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce o stałym kącie nachylenia.</li>
</ol>
5. Trawienie trypsyny w tkance dawcy
<ol>
	<li>Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w bloku grzewczym z wytrząsaniem przy 300 obr./min. Alternatywnie można użyć łaźni wodnej z okresowym mieszaniem próbki.</li>
	<li>Odpipetować roztwór wytrawiający w górę i w dół, aby rozbić pozostałą tkankę i osad jak w kroku 4.4.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml roztworu neutralizującego trypsynę i odwirować jak w kroku 4.4.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 400 μl roztworu barwnika znakującego czerwoną fluorescencyjność i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w bloku grzewczym. Alternatywnie skorzystaj z kąpieli wodnej.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji znakowania należy otoczkować komórki jak w kroku 4.4 i przemyć 1 ml HBSS (liczba etapów płukania może być zmieniona w zakresie od 1 do 3).</li>
	<li>Ponownie zawiesić znakowane, granulowane komórki w stężeniu ~ 50 000 komórek/μl, co zwykle daje objętość roboczą 5-10 μl w zależności od całkowitej wydajności komórek. 
	UWAGA: Stężenia komórek poniżej ~50 000 komórek/μL mogą skutkować słabą wydajnością wstrzykiwania.</li>
</ol>
6. Iniekcja in vivo
<ol>
	<li>Załadować zawiesinę komórek do szklanej pipety kapilarnej nasączonej silikonem, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1.2. Zamontuj pipetę w aparacie do mikroiniekcji ciśnieniowych.</li>
	<li>Wyjmij zarodki gospodarza z wilgotnego inkubatora i umieść w uchwycie na jaja pod fluorescencyjnym stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym.
	<ol>
		<li>Otwórz błonę witelinową za pomocą sterylnych cienkich kleszczy i wykonaj małe nacięcie (o długości ~0,5−1,0 mm) w osierdziu. Może być konieczna dodatkowa manipulacja/rozwarstwienie w zależności od obszaru docelowego do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić mikrowstrzykiwacz w taki sposób, aby końcówka igły do mikroiniekcji wnikała w tkankę docelową.
	<ol>
		<li>Wstrzyknij ciśnieniowo komórki i użyj etykiety fluorescencyjnej, aby określić, czy wszczepione komórki są obecne w pożądanej tkance. W przypadku typowych wstrzyknięć należy stosować pojedyncze impulsy o czasie trwania krótszym niż 0,5 s w zakresie ciśnienia od 100 do 400 hektopaskalów. 
		UWAGA: Długość impulsu i ciśnienie bezwzględne będą się różnić w zależności od liczby komórek do wstrzyknięcia i mogą być modyfikowane w zależności od indywidualnych potrzeb.</li>
		<li>Wycofać aparat do mikrowstrzykiwaczy i wyjąć jajo z uchwytu po wstrzyknięciu ciśnieniowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać kroplami 1 ml ciepłego HBSS na zarodek, zamknąć jaja przezroczystą taśmą pakową i inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C przez 24 godziny po implantacji.</li>
</ol>
7. Izolacja i analiza
<ol>
	<li>Wyizoluj zarodki gospodarza w RT HBSS za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki, podobnie jak w kroku 4.3, i utrwal w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Myć zarodki 3 x 5 minut w HBSS w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem i przechowywać w HBSS w temperaturze 4 °C do dalszej analizy (mikroskopia, immunohistochemia, hybrydyzacja in situ itp.).</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li>
<li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV%2C+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+embryology%3B+techniques+and+procedures.+3rd+edition%22">Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition</a>. , Burgess Pub. Co. (1962).</li>
<li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlack%2C+JMW+%22Essential+developmental+biology.+3rd+edition%22">Essential developmental biology. 3rd edition</a>. , Wiley. (2013).</li>
<li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+integration%2C+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts%3A+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li>
<li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222(2017).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair%3A+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li>
<li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li>
<li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Możliwość określenia, w jaki sposób warunki mikrośrodowiskowe wpływają na specyfikację losu komórek serca i stabilizację linii, ma fundamentalne znaczenie dla stworzenia kompresyjnego zrozumienia wrodzonych wad serca, a także dla opracowania skutecznych protokołów prawidłowego dojrzewania kardiomiocytów opartych na komórkach macierzystych lub komórkach somatycznych. Opisany powyżej protokół daje badaczom możliwość bezpośredniego oznaczania rozwoju komórek serca w zmienionych warunkach in vivo, co pozwala na oddzielenie autonomicznych procesów dojrzewania komórek od sygnałów parakrynnych/jukstakrynowych i/lub hemodynamicznych. W połączeniu z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, analizą genetyczną i testami fizjologicznymi, technika ta może służyć jako potężne uzupełnienie istniejących modeli transgenicznych.
Z technicznego punktu widzenia, przedstawiony tutaj protokół opiera się na skutecznej izolacji, znakowaniu i precyzyjnym wszczepianiu komórek serca dawcy do tkanek embrionalnych gospodarza. Zastosowanie systemu mikroiniekcji znacznie pomaga w celowaniu w komórki dawcy i pozwala na udaną implantację bez konieczności tworzenia dużego miejsca wszczepienia w tkance gospodarza. Do wykonania tej techniki wymagane są jednak pewne umiejętności operacyjne, ponieważ może dojść do zmniejszonej żywotności, jeśli igła do wstrzykiwań nie zostanie ostrożnie umieszczona w tkance docelowej (powodując pęknięcie serca lub miejscowe unaczynienie). Należy również zwrócić uwagę i przemyśleć etapy izolacji i etykietowania. Nadmierne trawienie tkanki dawcy może prowadzić do słabej wydajności implantacji, a techniki znakowania przejściowego mogą ograniczać okno czasowe, w którym można śledzić komórki dawcy (ponieważ podział komórek może rozcieńczyć etykietę).
Ta technika jest wysoce modyfikowalna i może być dostosowana do różnych celów. Na przykład, komórki dawcy z wielu różnych tkanek i etapów mogą być izolowane (chociaż wymagana jest optymalizacja trawienia enzymatycznego) i mogą być podobnie wstrzykiwane do różnych tkanek gospodarza na różnych etapach rozwoju. Podobnie, podejście do znakowania można zmodyfikować w celu śledzenia komórek w różnych oknach czasowych, w tym poprzez zastosowanie fluorescencyjnych nieorganicznych nanokryształów półprzewodnikowych do dłuższego przejściowego znakowania i implantacji komórek przepiórczych lub komórek z transgenicznych zarodków dawcy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP+)11 w celu znakowania permeanowego.
Chociaż obecnie używamy tej techniki do badań nad implantacją ptaków, uważamy, że może ona być wykorzystana w szerokim zakresie badań chimerycznych w przyszłości. Na przykład genetycznie zmienione komórki serca z organizmów transgenicznych mogą być izolowane i mikrowstrzykiwane do ptasiego serca przy użyciu bardzo podobnego protokołu. Co więcej, komórki zróżnicowane w kardiomiocyty z komórek macierzystych lub za pomocą metod przeprogramowania komórek somatycznych mogą być mikrowstrzykiwane do serca embrionalnego w celu oceny ich integracji z tkanką i/lub dojrzewania w warunkach biomechanicznych in vivo.

Badania nad rozwojem serca ogromnie skorzystały z pojawienia się transgenicznych systemów modelowych linii zarodkowej, które zidentyfikowały wiele sieci regulacyjnych genów, które kształtują różne linie komórkowe i domeny funkcjonalne w sercu. Jednak określenie, w jaki sposób te sieci genów oddziałują i reagują na warunki mikrośrodowiskowe, w tym sygnały parakrynne/jukstakrynowe i dane biofizyczne (rozciąganie, odkształcenie, przepływ hemodynamiczny), może być trudne. W związku z tym nie zawsze łatwo jest określić, czy fenotyp komórkowy powstaje jako bezpośrednia konsekwencja zaburzeń genetycznych, czy jako wtórny wynik adaptacji do zmian w biomechanice serca lub składzie tkanek wyższego rzędu1,2.
Eksperymenty z szczepieniem, które klasycznie były używane do rozwiązywania problemów związanych z określeniem losu, zaangażowaniem, indukcją i kompetencjami3,4, stanowiłyby idealne podejście do obejścia niektórych wyzwań związanych z definiowaniem autonomicznego wpływu komórki na środowisko w sercu. Niestety, skurcze serca utrudniają standardowe metody przeszczepu. Szybki ruch tkanki często uniemożliwia przeszczepionym komórkom przyleganie do serca, a duże nakłucia tkanek (zwykle wymagane do przeszczepu) często prowadzą do niewydolności serca i śmiertelności zarodka5,6,7. W związku z tym opracowaliśmy ciśnieniowy system mikroiniekcji do precyzyjnej implantacji komórkowej do rozwijającego się serca pisklęcia, omijając opisane wcześniej przeszkody techniczne związane z przeszczepem tkanek8,9. Korzystając z tej techniki, pojedyncze lub małe grupy komórek serca wyizolowanych z zarodka dawcy mogą być mikrowstrzykiwane do różnych regionów serca embrionalnego gospodarza, eliminując potrzebę intensywnego przygotowania gospodarza i duże uszkodzenia tkanki, które powstają przy użyciu standardowych technik przeszczepu. Igły do mikroiniekcji używane do tych badań implantacyjnych mają średnicę zewnętrzną ~30−40 μm, co oznacza, że igła może być umieszczona bezpośrednio w tkance docelowej (tj. Może przenikać przez ścianę zarodkową mięśnia sercowego), a komórki mogą być dostarczane ogniskowo przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Protokół może być stosowany do wykonywania różnych manipulacji izotopowych, heterotopowych, izochorycznych i heterochronicznych, zapewniając szybkie, elastyczne i tanie podejście do bezpośredniego badania klasycznych eksperymentalnych paradygmatów embriologicznych w rozwijającym się czterokomorowym sercu.
W protokole opisanym poniżej, oznaczamy komórki dawcy barwnikiem fluorescencyjnym przenikanym przez komórkę, co pozwala na monitorowanie sukcesu eksperymentu z mikroiniekcją w czasie rzeczywistym i dokumentowanie lokalizacji przeszczepionych komórek bez potrzeby dodatkowego barwienia. Należy jednak zauważyć, że takie podejście najlepiej nadaje się do eksperymentów krótkoterminowych (około 48 godzin), ponieważ barwnik fluorescencyjny może zostać utracony w wyniku podziału komórek. W przypadku eksperymentów długoterminowych można zastosować alternatywne podejścia.
Chociaż prezentujemy tę technikę w kontekście rozwoju serca, użyliśmy jej z doskonałym skutkiem do eksperymentów z implantacją komórek do mezodermy, głowy, kończyn i somitów. W związku z tym podstawowe podejście opisane poniżej jest wysoce wykonalne i może być stosowane w różnych układach narządów.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml mikroprobówki, przezroczyste</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Reach Barrier Tip Racked, sterylna</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 mL probówki wirówkowe, stojakowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>1588 Genesis Hova-Bator Inkubator</td><td>GQF</td><td>813927021221</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 igły</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>200ul Końcówka barierowa Niskie wiązanie, zębatka, sterylna</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>32G x 1/2" Igła</td><td>TSK Steriject Air-Tite</td><td>TSK3213</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Alchohol 70%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19015744</td><td></td></tr><tr><td>kątowe Kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11260-20</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania wstecznego</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Black India Ink</td><td>KOH-I-NOOR</td><td>3084-F</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Zielony CMF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7025</td><td>1 mM w DMSO</td></tr><tr><td>CellTracker Czerwony CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>1 mM w wirówce DMSO</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>do taśmy pakowej klasy komercyjnej</td><td>2619001</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki do tenotomii</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14067-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wylęgarnia</td><td></td><td></td> Pielgrzymów</tr> - <tr><td>HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Injectman 4</td><td>Eppendorf</td><td>5192000027D</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>SIGMA</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% w roztworze wodnym, klasa EM</td><td>VWR</td><td>100496-496</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-022</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do pipet</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>HEKA</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>z przezroczystą taśmą szkocką</td><td>487909</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TW100F-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

system mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpretacja względnego wpływu autonomicznego wzorca komórkowego w porównaniu z zewnętrznym wpływem mikrośrodowiska na określenie linii komórkowej stanowi ogólne wyzwanie w badaniach biologii rozwojowej. W sercu embrionalnym może to być szczególnie trudne, ponieważ wiadomo, że regionalne różnice w ekspresji regulatorów transkrypcji, sygnały sygnalizacyjne parakrynne/jukstakrynowe i siła hemodynamiczna wpływają na dojrzewanie kardiomiocytów. Uproszczona metoda zmiany molekularnego i biomechanicznego mikrośrodowiska rozwijającego się kardiomiocytu posłużyłaby zatem jako potężna technika do zbadania, w jaki sposób warunki lokalne wpływają na los i funkcję komórki. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę fizycznego przeszczepiania młodocianych kardiomiocytów do ektopowych lokalizacji w sercu lub otaczającej tkance embrionalnej. Pozwala nam to zbadać, w jaki sposób warunki mikrośrodowiskowe wpływają na przejścia losów kardiomiocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w nienaruszonym zarodku. W tym miejscu opisujemy protokół, w którym miocyty embrionalne mogą być izolowane z różnych poddomen serca, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i mikrowstrzykiwane do zarodków gospodarza z dużą precyzją. Komórki mogą być następnie bezpośrednio analizowane in situ przy użyciu różnych technik obrazowania i histologicznych. Protokół ten jest potężną alternatywą dla tradycyjnych eksperymentów z przeszczepami, które mogą być zbyt trudne w poruszającej się tkance, takiej jak serce. Ogólny zarys tej metody można również dostosować do różnych tkanek dawcy i środowisk gospodarza, a jej łatwość użycia, niski koszt i szybkość sprawiają, że jest to potencjalnie użyteczne zastosowanie w różnych badaniach rozwojowych.

Po 24 h inkubacji wyizolowano serce i otaczające tkanki embrionów gospodarza, wykonano dokumentację fotograficzną (Rycina 1A) i poddano je analizie immunofluorescencyjnej. W tym przykładzie kardiomiocyty przedsionkowe dawcy zostały mikroiniekcyjne do proepikardium embrionu gospodarza o podobnym stadium rozwoju. Następnie embrion gospodarza zabarwiono markerem mięśniowym (MF20 zielony) oraz 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI; niebieski). Wstrzyknięte komórki (czerwone) są wyraźnie widoczne (Rycina 1B). Możliwe korekty do rozważenia w przypadku braku widoczności komórek obejmują: zbyt silne trawienie tkanki dawcy (komórki nie będą w stanie przywrzeć), zbyt rozcieńczony roztwór barwnika znakującego, zbyt intensywne przemywanie komórek lub utratę znacznika w wyniku wielokrotnych podziałów komórkowych.
Aby potwierdzić, że wstrzyknięte w tym przykładzie komórki miały charakter miokardialny, wykonano sekcje optyczne zarodka przy użyciu mikroskopu konfokalnego (Rysunek 1C-E). Jedynymi komórkami dodatnimi pod względem MF20 w obrębie proepikardium (PE) są komórki wykazujące czerwoną fluorescencję, które zostały zaimplantowane ogniskowo.
<img alt="Rozwój serca, mikroskopia fluorescencyjna, barwienie DAPI/CT Red/MF20, obrazowanie tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy embrionów izolowanych 24 godziny po iniekcji. (A) Obraz w jasnym polu przy małym powiększeniu regionu tułowia embrionu kurczaka w stadium E3.5 (stadium HH 19). (B) Obraz złożony przedstawiający wstrzyknięte komórki (czerwone), kardiomiocyty (zielone) oraz DAPI. Komórki zostały wyizolowane z przedsionków i mikroiniekcyjne wprowadzone do proepicardium. (C) Obrazowanie konfokalne przy dużym powiększeniu przedstawiające oznakowane komórki w rdzeniu proepicardium. (D) Obrazowanie konfokalne przy dużym powiększeniu potwierdzające, że komórki oznakowane CT Red są kardiomiocytami. (E) Rekonstrukcja trójwymiarowa (3D) wstrzykniętych komórek z paneli D i E. At, przedsionki; OFT, droga odpływowa; PE, proepicardium; Vt, komora; MF20, miozyna 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Protokół ten pomaga nam określić, w jaki sposób zmiany w lokalnej biomechanice, architekturze tkanek, środowiskach parakrynnych i interakcjach przyklatkowych wpływają na fenotyp komórkowy. Technika ta pozwala nam badać klasyczne paradygmaty i embriologię eksperymentalną bez powodowania zniewag tkankowych na dużą skalę, które zwykle pojawiają się w tradycyjnych eksperymentach z wykresami. Aby znaleźć odpowiednie ciśnienie do wstrzykiwania, pomocne jest rozpoczęcie od niższego ciśnienia iniekcji i stopniowe zwiększanie, aż do osiągnięcia stałego przepływu komórek.Wizualizacja tej techniki pomaga w bezpośrednim zrozumieniu, w jaki sposób należy ustawić sprzęt do wstrzykiwania w stosunku do tkanki docelowej. Procedurę zademonstrują dwaj członkowie mojego laboratorium, Trevor Henley i Kandace Thomas. Na 24 godziny przed implantacją należy naciągnąć szklane naczynia włosowate na ściągacz do mikropipet zgodnie ze standardowymi protokołami i zanurzyć naczynia włosowate w środku silikonowym, aby pokryć zewnętrzne powierzchnie igieł.Następnie załaduj od 5 do 10 mikrolitrów środka silikonowego do końcówki pipety do mikroiniekcji i umieść końcówkę na szerokim końcu jednej z zewnętrznie powlekanych kapilar ze szkła ciągnionego. Umieść końcówkę pipety jak najbliżej szklanej końcówki igły i wyrzuć środek silikonowyzujący, powoli chowając pipetę ładującą, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza wewnątrz igły. Pozostaw środek silikonowy w szklanej igle na 10 minut przed użyciem nowej pipety ładującej do zasysania roztworu.Następnie wysusz igły w dygestorium przez noc. W celu przygotowania zarodków gospodarza należy inkubować płodne jaja kurze w orientacji poziomej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza i użyć kleszczy pod kątem, aby wykonać nakłucie o średnicy większej niż jeden milimetr w dolnej części płaskiego końca każdego jaja wzdłuż równika jaja. Włóż igłę o rozmiarze 18 dołączoną do 10-mililitrowej strzykawki do nakłucia, aby usunąć około pięciu mililitrów białka.I nałóż przezroczystą taśmę na wierzch skorupki jajka. Naciąć przyklejony obszar wzdłuż górnej części jajka za pomocą kątowych kleszczy i użyj zakrzywionych nożyczek do tenotomii, aby wyciąć około 2,5-centymetrowe okno w zaklejonej taśmą części jajka. Zbadaj i ustalij stopień zarodka w oparciu o kryteria ustalone przez Hamburgera i Hamiltona i użyj jednomilimetrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 32, aby wstrzyknąć około 200 mikrolitrów atramentu indyjskiego o rozcieńczeniu od jednego do pięciu w HBSS pod zarodek.Następnie uszczelnij nakłucie przezroczystą taśmą i dodaj kroplami jeden mililitr HBSS na krążek zarodka, a następnie uszczelnij otoczkę z okienkiem folią parafinową w celu umieszczenia jaja z powrotem w nawilżanym inkubatorze. Kiedy zarodki osiągną stadium 19 Hamburgera i Hamiltona, spłucz szklane naczynia włosowate pokryte silikonem wodą dejonizowaną i pozostaw naczynia włosowate do wyschnięcia przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przenieś zarodek z jednej komórki jajowej na szalkę Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów zawierającą sterylny HBSS o temperaturze pokojowej i umieść szalkę pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą kleszczy, nożyczek do tenotomii i mikroszpatułki odizoluj całe serce zarodkowe od zarodka i odizoluj przedsionki od serca. Umieść tkankę przedsionkową w sterylnej 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr HBSS na lodzie. Po pobraniu całej tkanki dawcy należy ogranulować tkanki przez odwirowanie w mikrowirówce o stałym kącie.W celu trawienia tkanek dawcy ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej 05% trypsyny EDTA na 15-minutową inkubację w bloku ciepła wytrząsającym przy 300 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji kilkakrotnie odpipetować roztwór wytrawiający w celu rozdrobnienia pozostałej tkanki i osadzać lizat serca przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu neutralizującego trypsynę do kolejnego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić w 400 mikrolitrach roztworu czerwonego barwnika fluorescencyjnego.Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza osadzać komórki przez odwirowanie przez jedno do trzech prań w jednym mililitrze HBSS na pranie. Następnie ponownie zawiesić znakowane komórki w stężeniu pięć razy dziesięć do czwartej komórki na mikrolitr w świeżym HBSS. W przypadku iniekcji in vivo komórek dawcy należy załadować zawiesinę komórek do suchej, szklanej pipety kapilarnej nasączonej silikonem, jak pokazano, i zamontować pipetę w ciśnieniowym aparacie do mikroiniekcji.Przenieść każdy zarodek gospodarza do wstrzyknięcia z nawilżanego inkubatora do uchwytu na jaja pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. I użyj sterylnych cienkich kleszczyków, aby otworzyć membranę witelinową. Wykonać 5-1 milimetrowe nacięcie w osierdziu i ustawić mikrowstrzykiwacz tak, aby końcówka igły do mikroiniekcji penetrowała tkankę docelową.Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby aplikował pojedyncze impulsy o czasie trwania 5 sekund i ciśnieniu w zakresie od 100 do 400 hektopaskalów. I wstrzyknąć komórki pod ciśnieniem. Bardzo ważne jest, aby zweryfikować pomyślną implantację komórki poprzez obrazowanie sygnału fluorescencyjnego przed ponownym zamknięciem komórki jajowej.Zarodek można również sfotografować, aby udokumentować tę procedurę. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek należy wycofać aparat do mikrowstrzykiwaczy i wyjąć komórkę jajową z uchwytu. Następnie dodaj kroplami jeden mililitr ciepłego HBSS na zarodek.Zapieczętuj jajo przezroczystą taśmą pakową i umieść jajo z powrotem w wilgotnym inkubatorze na 24 godziny po implantacji. W tym miejscu pokazano serce i otaczającą tkankę embrionalnego serca gospodarza po implantacji miocytów przedsionkowych dawcy. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki dawcy zostały mikrowstrzyknięte do nadbłonka sierdzia zarodka gospodarza w podobnym stadium.Sekcja optyczna przy użyciu mikroskopu konfokalnego ujawniła, że jedynymi komórkami dodatnimi pod względem markera mięśnia sercowego w obrębie nadsierdzia były wszczepione ogniskowo fluorescencyjne czerwone komórki dodatnie. Należy uważać, aby nie manipulować zarodkiem biorcy, ponieważ pęknięcia serca i miejscowego unaczynienia spowodowane przez igłę do wstrzykiwań mogą skutkować zmniejszeniem żywotności. Po tej procedurze można przeprowadzić różne dalsze testy, w tym immunohistochemię, hybrydyzację in situ i sortowanie komórek.Środek silikonowy jest skrajnie łatwopalny i bardzo toksyczny. Z urządzeniem należy zawsze obchodzić się ostrożnie i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej wewnątrz dygestoria.

microinjection-based-system-for-vivo-implantation-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualny do wykonania modelu podwiązania lewego przedsionka (LAL) w zarodku ptaka. Model LAL zmienia przepływ wewnątrzsercowy, który zmienia obciążenie naprężeniem ścinającym ścianę, naśladując zespół niedorozwoju lewego serca. Przedstawiono podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z tym trudnym modelem mikrochirurgii.

Podwiązanie lewego przedsionka w zarodku ptaka jako model zmienionego obciążenia hemodynamicznego we wczesnym rozwoju naczyniowym

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Poznaj technikę mikroiniekcji kardiomiocytów zarodkowych do zarodków ptaków w celu badania rozwoju tkanki sercowej. Ta metoda umożliwia analizę lokalnych warunków biomechanicznych i interakcji komórkowych.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Przeglądaj więcej filmów