Wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro

Radioterapia jest najczęściej wykonywana przy użyciu akceleratorów liniowych. Protokół ten pozwala naukowcom ocenić biologiczny wpływ promieniowania na komórki za pomocą akceleratora liniowego. Zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu akceleratora liniowego naukowcy mogą badać szeroki zakres klinicznie istotnych dawek i szybkości dawkowania.

Co więcej, protokół ten może być stosowany do wszystkich typów komórek nowotworowych. Ta metoda może być wykonana przy użyciu podobnego sprzętu do pokazanego tutaj. Na przykład akceleratory liniowe produkowane przez innych dostawców.

Osoby, które nie mają doświadczenia w wykonywaniu obliczeń dozymetrycznych przy użyciu akceleratora liniowego, mogą mieć trudności z obliczeniem prawidłowej liczby jednostek monitorujących wymaganych do dostarczenia żądanej dawki do próbki. Skorzystaliby, zasięgnąwszy porady doświadczonego fizyka medycznego lub dozymetry. Dokładne dostarczenie dawki do próbki za pomocą akceleratora liniowego wymaga starannego rozmieszczenia.

Dwa dni przed planowanym napromienianiem, pracując w kapturze hodowlanym, użyj sterylnej pięciomililitrowej pipety, aby pobrać komórki macierzyste glejaka z płytki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj komórki w temperaturze 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy z jednym mililitrem trypsyny-EDTA.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby strawić osad i przygotować zawiesinę jednokomórkową w trypsyno-EDTA. Co dwie minuty podczas trawienia delikatnie potrząsaj dnem probówki wirówkowej, aby upewnić się, że komórki są dokładnie strawione. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki do hodowli komórek macierzystych, aby ugasić trypsynę, delikatnie wymieszaj i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Płytka z pięcioma milionami komórek podzielona na dwie 10-centymetrowe płytki zawierające 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Tuż przed planowanym napromienianiem należy zebrać komórki i odwirować tak jak poprzednio.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z pięcioma mililitrami pożywki do hodowli komórkowych. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej na 35-milimetrową płytkę zawierającą dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych, upewniając się, że pożywka osiąga wysokość jednego centymetra. Przenieść posiane komórki do pojemnika wtórnego, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, a następnie przewieźć komórki w pojemniku na wózku użytkowym do zakładu napromieniania w celu napromienienia komórek.

Na dzień przed napromienianiem, pracując w kapturze do hodowli komórkowych, użyj pipety Pasteura podłączonej do próżni, aby usunąć pożywkę DMEM z płytki do hodowli komórkowej do dołączonej linii komórkowej. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS, aby spłukać resztki pożywki. Dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego i delikatnie przechyl płytkę hodowlaną, aby upewnić się, że całe naczynie jest przykryte.

Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, wygasić reakcję trypsyna-EDTA trzema mililitrami pożywki DMEM. Użyj pięciomililitrowej pipety, aby zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, odwirować, a następnie wyhodować komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby napromieniować te wcześniej przygotowane komórki za pomocą oprogramowania konsoli LINAC, należy ustawić suwnicę akceleratora i kolimator na zero stopni, otworzyć szczęki x i y do symetrycznego rozmiaru pola o wymiarach pięć na pięć centymetrów kwadratowych i schować kolimatory wielolistkowe.

Dodać co najmniej pięć centymetrów materiału równoważnego wodzie na leżankę zabiegową i umieścić na niej naczynie z komórkami, które mają być napromieniowane, w środku celownika LINAC. Umieść komórki na głębokości maksymalnej dawki w wiązce promieniowania rentgenowskiego o napięciu sześciu megawoltów na około 1,5 centymetra i dodaj dodatkowy centymetr materiału równoważnego wodzie na wierzch naczynia. Przymocuj przednią wskazówkę do główki LINAC i wysuń ją tak, aż dotknie powierzchni nagromadzonego materiału.

Dostosuj wysokość stołu, aż odległość od źródła do powierzchni narostu wyniesie 100 centymetrów. Opuść skarbiec leczenia, upewniając się, że wszystkie inne osoby opuściły go. Sprawdź, czy w pomieszczeniu nie ma innych komórek, a następnie zamknij drzwi skarbca.

Potwierdź rozmiar pola, jednostki monitorowania i jednostki monitorowania na minutę na konsoli, a następnie włącz wiązkę dla komórki promieniowania. Trzy próbki komórek macierzystych podobnych do glejaka przygotowano przy użyciu tego protokołu i pobrano 24 godziny po napromienianiu. Tam obliczono profile cykli komórkowych i pokazano je z procentową zawartością komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Zatrzymanie cyklu komórkowego G2 obserwowano po napromienianiu komórek macierzystych glejaka standardową dawką lub bardzo wysoką dawką, w porównaniu z nienapromieniowanymi komórkami kontrolnymi. Aby uzyskać odpowiednią dawkę, najważniejsze jest zmierzenie wysokości pożywki w naczyniu hodowlanym, aby upewnić się, że osiąga ona jeden centymetr. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy biologiczne, takie jak barwienie immunologiczne, western blot i analiza cyklu komórkowego.

Ponieważ procedura ta zapewnia naukowcom klinicznie istotne ustawienia dawki i szybkości dawki, może być wykorzystana do oceny wpływu promieniowania na wiele modeli opartych na hodowlach komórkowych.