Name: Wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny biologicznych skutków promieniowania na komórkach nowotworowych przy użyciu akceleratora liniowego. Protokół umożliwia badanie komórek macierzystych i przylegających kultur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Klinice w Cleveland za korzystanie z akceleratorów liniowych. Dziękujemy dr Jeremy'emu Richowi za jego hojny dar w postaci komórek macierzystych glejaka. Badania te były wspierane przez Cleveland Clinic.

1. Przygotowanie komórek do hodowli w zawiesinie
<ol>
	<li>Hodować komórki macierzystopodobne glejaka w pożywce do hodowli komórek macierzystych przy zagęszczeniu około 5 x 106 komórki/płytki 10 cm w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO22, 95% wilgotności względnej przy 37 °C. 
	UWAGA: Warunki hodowli komórkowej są identyczne we wszystkich procedurach. Pożywki użyte w protokole są pożywkami kompletnymi.</li>
	<li>Na dwa dni przed planowanym napromieniowaniem, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zebrać komórki glejaka o charakterze macierzystym z płytki hodowlanej za pomocą sterylnej pipety 5 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwiruj zebrane komórki z prędkością 200 x g przez 3 min w wirówce laboratoryjnej.</li>
	<li>Odlej nadsącz i poddaj osad komórkowy (około 1 x 107 komórki) 1 ml trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek w trypsynie-EDTA. Podczas trawienia należy delikatnie potrząsać dnem probówki wirówkowej co 2 minuty, aby upewnić się, że komórki zostały całkowicie strawione.</li>
	<li>Dodaj 3 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych (patrz w sekcji Tabela materiałów) w celu zneutralizowania trypsyny. Zebrane komórki odwiruj przy 200 x g przez 3 min w wirówce laboratoryjnej. Odrzucić nadsącz i zachować osad komórkowy.</li>
	<li>Resuspendować komórki w 5 ml pożywki hodowlanej i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Płytka 5 x 106 komórki w dwóch płytkach 10 cm zawierających 10 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed zaplanowanym naświetlaniem należy zebrać komórki i odpiłować nadsącz po wirowaniu, zgodnie z opisem w kroku 1.3. Osad komórkowy zawiesić ponownie w 5 ml pożywki do hodowli komórkowej. 1 ml zawiesiny komórkowej przenieść do płytki 35 mm zawierającej 2 ml pożywki do hodowli komórkowej. 
	UWAGA: Całkowita objętość pożywki w płytce 35 mm wynosi 3 ml, aby wysokość cieczy w płytce wynosiła 1 cm.  </li>
	<li>Przenieść wysiane komórki w pojemniku wtórnym, takim jak pudełko plastikowe lub piankowe, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, a następnie przetransportować komórki w pojemniku do pracowni naświetlań za pomocą wózka transportowego.</li>
	<li>Naświetl komórki zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do hodowli przylegającej
<ol>
	<li>Na dzień przed naświetlaniem, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, usunąć pożywkę DMEM z płytki z hodowlą przylegających komórek, np. komórek HEK-293. Pożywkę można odessać za pomocą pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.</li>
	<li>Przemyć komórki, wlewając do naczynia hodowlanego 5 mL sterylnego PBS, aby usunąć pozostałości pożywki.</li>
	<li>Nalać 1 mL trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego i delikatnie przechylić płytkę, aby upewnić się, że całe dno jest pokryte trypsyną-EDTA.</li>
	<li>Inkubować komórki z trypsyną w temperaturze pokojowej przez 5 min. Przerwać reakcję trypsyny-EDTA, dodając 3 mL pożywki DMEM, a następnie zebrać komórki za pomocą pipety 5 mL do probówki wirówkowej 15 mL w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Odwirować zebrane komórki z prędkością 200 x g przez 3 min w wirówce laboratoryjnej. Odlać nadsącz i zachować osad komórkowy.</li>
	<li>Resuspendować komórki w 5 mL pożywki DMEM i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wysiać 2 x 105 komórek na płytkę 35 mm, używając 3 mL pożywki do hodowli komórkowych, aby uzyskać wysokość słupa cieczy równą 1 cm.</li>
	<li>Po 24 h hodowli w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przenieść wysiane komórki w pojemniku wtórnym (np. izolacyjnym pudełku styropianowym) do pracowni naświetlań za pomocą wózka transportowego.</li>
	<li>Naświetlić komórki zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do immunobarwienia po napromieniowaniu
<ol>
	<li>Rozmrozić komercyjną macierz białkową zewnątrzkomórkową na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Wcześniej schłodzić końcówki do pipety 200 µL oraz probówki wirówkowe 1,5 mL w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Rozdzielić macierz białkową zewnątrzkomórkową za pomocą schłodzonych końcówek do pipety i probówek wirówkowych 1,5 mL, dozując 200 µL do każdej probówki.</li>
	<li>Rozcieńczyć 200 µL macierzy białkowej zewnątrzkomórkowej w uprzednio schłodzonych 20 mL pożywki do hodowli komórkowej, aby przygotować 1% pożywkę z macierzą białkową zewnątrzkomórkową.</li>
	<li>Umieścić wysterylizowane szkiełko nakrywkowe (22 mm x 22 mm) w płytce 35 mm. Nanieść 400 µL 1% pożywki z macierzą białkową zewnątrzkomórkową na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Umieścić płytkę 35 mm w inkubatorze do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C na 1 h, aby umożliwić polimeryzację macierzy białkowej zewnątrzkomórkowej na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>W przypadku stosowania hodowli komórek w zawiesinie, przygotować zawiesinę pojedynczych komórek zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.5.</li>
	<li>Wysiać 5 x 104 komórek na pokryte macierzą białkową zewnątrzkomórkową szkiełko nakrywkowe umieszczone w płytce 35 mm. Przenieść wysiane komórki do inkubatora do hodowli komórkowej na noc, aby zapewnić ich podparcie przez macierz białkową. Całkowita objętość pożywki w płytce powinna wynosić 3 mL, aby wysokość pożywki w naczyniu hodowlanym osiągnęła 1 cm.</li>
	<li>Obserwować komórki pod mikroskopem w świetle przechodzącym z obiektywem o powiększeniu 10x. Komórki powinny rozprzestrzenić się na szkiełku nakrywkowym zamiast unosić się w zawiesinie. Przenieść naczynie hodowlane z wysianymi komórkami w pojemniku wtórnym, np. w pudełku styropianowym, do urządzenia do napromieniowania za pomocą wózka transportowego i napromieniować komórki zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>W przypadku stosowania przylepnych hodowli komórkowych (na przykład komórek HEK-293), przeprowadzić trawienie komórek zgodnie z opisem w krokach od 2.1 do 2.6. Umieścić 5 x 104 komórek na sterylnym szkiełku nakrywkowym w płytce 35 mm na jeden dzień przed napromieniowaniem, aby upewnić się, że komórki są całkowicie przytwierdzone do powierzchni szkiełka, obserwując je pod mikroskopem zgodnie z krokiem 3.9. Użyć 3 mL pożywki DMEM, aby wysokość cieczy w płytce wynosiła 1 cm.</li>
	<li>Po hodowaniu komórek na szkiełkach nakrywkowych przez noc lub do jednego dnia, przenieść naczynie hodowlane z wysianymi komórkami w pojemniku wtórnym do urządzenia do napromieniowania. Można użyć wózka transportowego, aby zmniejszyć ryzyko rozlania. Napromieniować komórki zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
</ol>
4. Naświetlanie za pomocą akceleratora liniowego (LINAC)
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania konsoli LINAC ustaw gantry akceleratora i kolimator na 0°, otwórz szczeliny X i Y do symetrycznego rozmiaru pola 20 x 20 cm2 i cofnij wielolistne kolimatory (MLCs), jeśli są dostępne. 
	UWAGA: LINAC-i mogą posiadać tryb bez filtra spłaszczającego (FFF), umożliwiający uzyskanie bardzo wysokich mocy dawki. Jak sugeruje nazwa, promieniowanie to nie jest jednorodne (płaskie), a wysoką moc dawki osiąga się jedynie w centrum wiązki. W takim przypadku stosuje się pole 7 x 7 cm2.</li>
	<li>Umieść na stole zabiegowym co najmniej 5 cm materiału o równoważności wodnej. Płytkę z komórkami przeznaczoną do napromieniania z mocą dawki 400 MU/min (standardowa moc dawki) ustaw na materiale o równoważności wodnej i wycentruj ją w przecięciu linii celowniczych LINAC.</li>
	<li>Umieść komórki do napromieniania na głębokości dawki maksymalnej dla wiązki promieni rentgenowskich 6 MV, czyli około 1,5 cm. Na wierzchu płytki umieść dodatkowe 1 cm materiału o równoważności wodnej. W połączeniu z 1 cm medium, w którym zawieszone są komórki, zapewnia to średnią głębokość 1,5 cm dla komórek.</li>
	<li>Zamocuj wskaźnik przedni do głowicy LINAC. Wysuń wskaźnik przedni, aż dotknie powierzchni materiału budującego (buildup), i zanotuj odległość. Dostosuj wysokość stołu, aż odległość od źródła do powierzchni materiału budującego wyniesie 100 cm. 
	UWAGA: Odległość można potwierdzić za pomocą optycznego wskaźnika odległości. Alternatywnie, optyczny wskaźnik odległości może być użyty zamiast wskaźnika przedniego do ustawienia odległości od źródła do powierzchni materiału budującego na 100 cm.</li>
	<li>Oblicz odpowiednią liczbę jednostek monitora (MU), aby dostarczyć pożądaną dawkę promieniowania do komórek, i zaprogramuj akcelerator na dostarczenie 400 MU/min. 
	UWAGA: Dla konfiguracji odległości od źródła do powierzchni (SSD) na LINAC skalibrowanym do dostarczania 1 cGy/MU na głębokości dawki maksymalnej, wymaganą liczbę jednostek monitora oblicza się wzorem MU = Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20), gdzie OF oznacza współczynnik wyjściowy (output factor). Obliczenia te będą wymagały modyfikacji w przypadku LINAC-ów korzystających z innych konfiguracji kalibracyjnych.</li>
	<li>Opuść bunkier terapeutyczny i upewnij się, że wszystkie inne osoby również z niego wyszły. Sprawdź, czy w pomieszczeniu nie znajdują się inne komórki, w przeciwnym razie otrzymają one niskie dawki promieniowania. Zamknij drzwi bunkra.</li>
	<li>Potwierdź rozmiar pola, MU oraz MU/min na konsoli, a następnie włącz wiązkę.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.8 dla komórek, które mają być napromieniane z wyższą lub niższą mocą dawki.
	<ol>
		<li>Aby osiągnąć wyższe moce dawki (np. 2100 MU/min lub więcej) za pomocą akceleratora, zmniejsz SSD, aby zwiększyć efektywną moc dawki dostarczaną do komórek zgodnie z prawem odwrotnych kwadratów: DoseRateEffective = Doserate * (100 cm / SSD_New)2.</li>
		<li>W przypadku niskich mocy dawki (np. 20 MU/min), zwiększ odległość od źródła do powierzchni (SSD_New), aby zmniejszyć moc dawki. Na przykład płytkę z kulturą komórek można położyć na podłodze pomieszczenia zabiegowego.</li>
		<li>Jeśli taka konfiguracja jest konieczna, ponownie oblicz ustawienie jednostek monitora na akceleratorze, korzystając ze wzoru MU = Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD_New)2. Dodatkowe informacje na temat obliczeń MU znajdują się w publikacji McDermott i Orton18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz moc dawki w Gy/minutę zgodnie ze wzorem DoseRate(Gy/Min) = Dose(Gy)*(MU/min)/MU. np. dawka 4 Gy dostarczona przy 400 MU/min wymaga 380 MU, zatem 4*400/380 = 4,2 Gy/min. Patrz Tabela 1.</li>
</ol>
<img alt="Układ do radioterapii z akceleratorem liniowym, sprzętem do pomiarów dosymetrycznych i precyzyjną siatką wyrównawczą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59514/59514fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ustawienie naczynia z hodowlą komórkową na akceleratorze liniowym. (A) Przedstawiono kliniczny akcelerator liniowy. (B) Na stole zabiegowym umieszczono materiał o równoważności wodnej 5 cm. (C) Na powierzchni materiału umieszczono naczynie z hodowlą komórkową. (D) Naczynie wycentrowano za pomocą celownika akceleratora w polu zabiegowym, wyznaczonym przez kwadratowe pole świetlne. (E) Na wierzchu naczynia z hodowlą komórkową umieszczono materiał o równoważności wodnej 1 cm. Odległość od źródła do powierzchni (SSD) sprawdzono za pomocą optycznego wskaźnika odległości (F, G) lub wskaźnika czołowego (H, I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59514/59514fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Analizy biologiczne po napromieniowaniu
<ol>
	<li>Po napromieniowaniu należy przenieść komórki do inkubatora do hodowli komórkowych w ten sam sposób, który opisano powyżej (krok 1.9, 2.8 i 3.10).</li>
	<li>W zależności od potrzeb należy dostosować odpowiednie analizy biologiczne do celów projektu badawczego. 
	UWAGA: W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywną analizę cyklu komórkowego16 jako przykład analizy biologicznej przeprowadzonej po napromieniowaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+radiotherapy+with+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+versus+radiotherapy+alone+on+survival+in+glioblastoma+in+a+randomised+phase+III+study%3A+5-year+analysis+of+the+EORTC-NCIC+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial.</a> The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).</li>
<li>Tao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+imaging+in+upper+gastrointestinal+tumors+and+application+to+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).</li>
<li>Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+immunotherapy+and+radiation+therapy+strategies+for+pancreatic+cancer-targeting+multiple+steps+in+the+cancer+immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).</li>
<li>Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-Linear+accelerator+raiotherapy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oncology+Journal+%7C+The+Royal+College+of+Radiologists%22%5BJournal%5D)">MRI-Linear accelerator raiotherapy systems.</a> Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).</li>
<li>Hall, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate%3A+a+factor+of+importance+in+radiobiology+and+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy.</a> The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).</li>
<li>Steel, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dose-rate+effect+in+human+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The dose-rate effect in human tumour cells.</a> Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).</li>
<li>Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-rate+effects+in+external+beam+radiotherapy+redux%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux.</a> Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).</li>
<li>Castro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amotosalen%2FUVA+treatment+inactivates+T+cells+more+effectively+than+the+recommended+gammadose+for+prevention+of+transfusion-associated+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).</li>
<li>Gaddini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+primary+rat+retina+cell+cultures+to+%CE%B3-rays%3A+An+in+vitro+model+for+evaluating+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses.</a> Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).</li>
<li>Simara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+reprogramming+and+long-term+in+vitro+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73(2017).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+biological+effects+of+125I+seeds+continuous+low-dose-rate+radiation+and+60Co+high-dose-rate+gamma+radiation+on+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0133728(2015).</li>
<li>Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+varying+dose-per-pulse+and+average+dose+rate+in+X-ray+beam+irradiation+on+cultured+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).</li>
<li>Karan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+effects+of+altering+dose+rate+in+filter-free+photon+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+high+dose+rate+%2810X+FFF%2F2400+MU%2Fmin%2F10+MV+X-rays%29+and+total+low+dose+%280.5+Gy%29+induces+a+higher+rate+of+apoptosis+in+melanoma+cells+in+vitro+and+superior+preservation+of+normal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes.</a> Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+extra+high+on+glioma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of extra high on glioma stem-like cells.</a> PLoS One. 13 (8), 0202533(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+G2%2FM+arrest+rarely+occurred+in+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).</li>
<li>Mcdermott, P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcdermott%2C+P+%22The+Physics+and+Technology+of+Radiation+Therapy%22">The Physics and Technology of Radiation Therapy</a>. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).</li>
<li>Lohse, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high+dose+per+pulse+flattening+filter-free+beams+on+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival.</a> Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Radioterapia jest integralną częścią leczenia raka. Nieustanne wysiłki mają na celu poprawę skuteczności i efektywności radioterapii. Postęp w technologii akceleratorów liniowych umożliwił leczenie pacjentów z niespotykaną dotąd dokładnością i bezpieczeństwem. Ponieważ większość pacjentów jest leczona wysokoenergetycznym promieniowaniem rentgenowskim z akceleratorów liniowych, badania badające skutki biologiczne szerokiego zakresu dawek wykonywanych na akceleratorach liniowych mogą być łatwo stosowane u pacjentów. Pojawi...

Radioterapia jest skuteczną metodą leczenia wielu rodzajów raka1,2,3,4. Napromienianie o bardzo wysokiej dawce jest stosunkowo nowe w radioterapii i jest możliwe dzięki najnowszym postępom technologicznym w akceleratorach liniowych5. Kliniczne zalety napromieniania o bardzo wysokiej dawce w porównaniu ze standardową szybkością napromieniania obejmują skrócony czas leczenia i lepsze doświadczenia pacjenta. Akceleratory liniowe stanowią również warunki kliniczne dla badań biologii radiacyjnej opartych na hodowlach komórkowych. Biologiczne i terapeutyczne implikacje dawki promieniowania i jej dawek są przedmiotem zainteresowania onkologów i biologów zajmujących się radioterapią od dziesięcioleci6,7,8. Jednak radiobiologia napromieniowania o bardzo wysokiej dawce i napromieniowania błyskawicznego - ekstremalnie wysokiej dawki promieniowania - nie została jeszcze dokładnie zbadana.
Promieniowanie gamma jest szeroko stosowane w biologii radiacyjnej opartej na hodowlach komórkowych9,10,11. Promieniowanie jest osiągane przez promieniowanie gamma emitowane przez rozpadające się źródła radioaktywnych izotopów, zwykle cezu-137. Wykorzystanie źródeł promieniotwórczych jest ściśle regulowane i często ograniczane. W przypadku napromieniania opartego na źródle trudno jest testować szeroki zakres dawek, co ogranicza jego użyteczność w analizie skutków biologicznych klinicznie osiągalnych dawek12.
Przeprowadzono kilka badań, które ilustrują zarówno efekty dawki, jak i dawki dawki12,13,14,15,16,17. W badaniach tych wykorzystano zarówno promieniowanie gamma generowane przez izotopy promieniotwórcze, jak i promieniowanie rentgenowskie generowane przez akceleratory liniowe. Wykorzystano różne linie komórkowe reprezentujące raka płuc, raka szyjki macicy, glejaka i czerniaka. Wpływ promieniowania na przeżycie komórek, zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę i uszkodzenia DNA oceniono jako odczyty12,13,14,15,16,17. W tym miejscu opisujemy metodę definiowania biologicznych skutków klinicznie istotnych dawek promieniowania i dawek poprzez dostarczanie promieniowania rentgenowskiego za pomocą akceleratora liniowego. Badania te powinny być prowadzone przy ścisłej współpracy między biologiem, onkologiem radioterapeutą i fizykiem medycznym.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glejak komórka macierzysta 387</td><td></td><td></td><td>prezent od dr Jeremy'ego Richa</td></tr><tr><td>293 komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do hodowli neuronów komórek macierzystych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>NeurobasalTM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF podstawowy</td><td>R& D Systems</td><td>4114-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>B-27&handel; Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian Sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030164</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>zewnątrzkomórkowa matryca protenowa</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>MatrigelTM</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher chemiczny</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Denville</td><td>T1110</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>CC7682-3340</td><td></td></tr><tr><td>22x22mm szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>mikroskopia elektronowa sciences</td><td>72210-10</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M36</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-233</td><td></td></tr><tr><td>pomoc do pipetowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-06</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Akcelerator liniowy</td><td>Varian</td><td>brak materiału</td><td></td></tr><tr><td>równoważnego wodzie</td><td>Sun Nuclear corporation</td><td>557</td><td>Woda stałaTM</td></tr><tr><td>Przygotowanie odczynnika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM pożywka</td><td>10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 jednostek/ml penicyliny G, 100 i mikro; g/ml streptomycyny w 500 ml pożywki DMEM pożywki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do hodowli komórek macierzystych</td><td>10 ml suplementu B27, 20 i mikro; g hFGF, 20 i mikro; g hEGF, 2 mM L-glutamina, 100 jednostek/ml penicylina G, 100 &mikro; g/ml streptomycyny w 500 ml pożywki</td><td></td><td></td> neuropodstawowej</tr></tbody></table>

wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro

Use of a Linear Accelerator for Conducting In Vitro Radiobiology Experiments

Radioterapia pozostaje jednym z fundamentów leczenia raka. W przypadku większości nowotworów jest to najskuteczniejsza, niechirurgiczna terapia mająca na celu zmniejszenie masy guzów. W tym miejscu opisujemy metodę napromieniania komórek nowotworowych za pomocą akceleratora liniowego. Postęp w technologii akceleratorów liniowych poprawił precyzję i skuteczność radioterapii. Skutki biologiczne szerokiego zakresu dawek promieniowania i dawek są nadal intensywnym obszarem badań. Zastosowanie akceleratorów liniowych może ułatwić te badania z wykorzystaniem klinicznie istotnych dawek i szybkości dawkowania.

Aby zbadać wpływ standardnej oraz bardzo wysokiej mocy dawki promieniowania z akceleratora liniowego na cykl komórkowy, zgodnie z niniejszym protokołem przygotowano trzy próbki komórek macierzystych glejaka, które pobrano 24 h po napromieniowaniu17: jedną próbkę kontrolną, która nie była napromieniowana (Rycina 2A), jedną próbkę napromieniowaną z mocą 400 MU/min (jednostka monitorująca, standardowa moc dawki 4,2 Gy/min, Rycina 2</...

Kliniczne akceleratory liniowe mogą być używane do określania efektów biologicznych szerokiego zakresu dawek na komórki rakowe. Omówiliśmy, jak skonfigurować akcelerator liniowy do testów komórkowych i testów dla nowotworowych komórek macierzystych hodowanych jako guzy w zawiesinie i linii komórkowych hodowanych jako kultury adherentne.

Wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro

Radiation therapy remains one of the cornerstones of cancer management. For most cancers, it is the most effective, nonsurgical therapy to debulk tumors. ...

Radioterapia jest najczęściej wykonywana przy użyciu akceleratorów liniowych. Protokół ten pozwala naukowcom ocenić biologiczny wpływ promieniowania na komórki za pomocą akceleratora liniowego. Zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu akceleratora liniowego naukowcy mogą badać szeroki zakres klinicznie istotnych dawek i szybkości dawkowania.Co więcej, protokół ten może być stosowany do wszystkich typów komórek nowotworowych. Ta metoda może być wykonana przy użyciu podobnego sprzętu do pokazanego tutaj. Na przykład akceleratory liniowe produkowane przez innych dostawców.Osoby, które nie mają doświadczenia w wykonywaniu obliczeń dozymetrycznych przy użyciu akceleratora liniowego, mogą mieć trudności z obliczeniem prawidłowej liczby jednostek monitorujących wymaganych do dostarczenia żądanej dawki do próbki. Skorzystaliby, zasięgnąwszy porady doświadczonego fizyka medycznego lub dozymetry. Dokładne dostarczenie dawki do próbki za pomocą akceleratora liniowego wymaga starannego rozmieszczenia.Dwa dni przed planowanym napromienianiem, pracując w kapturze hodowlanym, użyj sterylnej pięciomililitrowej pipety, aby pobrać komórki macierzyste glejaka z płytki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj komórki w temperaturze 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy z jednym mililitrem trypsyny-EDTA.Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby strawić osad i przygotować zawiesinę jednokomórkową w trypsyno-EDTA. Co dwie minuty podczas trawienia delikatnie potrząsaj dnem probówki wirówkowej, aby upewnić się, że komórki są dokładnie strawione. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki do hodowli komórek macierzystych, aby ugasić trypsynę, delikatnie wymieszaj i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Płytka z pięcioma milionami komórek podzielona na dwie 10-centymetrowe płytki zawierające 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Tuż przed planowanym napromienianiem należy zebrać komórki i odwirować tak jak poprzednio.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z pięcioma mililitrami pożywki do hodowli komórkowych. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej na 35-milimetrową płytkę zawierającą dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych, upewniając się, że pożywka osiąga wysokość jednego centymetra. Przenieść posiane komórki do pojemnika wtórnego, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, a następnie przewieźć komórki w pojemniku na wózku użytkowym do zakładu napromieniania w celu napromienienia komórek.Na dzień przed napromienianiem, pracując w kapturze do hodowli komórkowych, użyj pipety Pasteura podłączonej do próżni, aby usunąć pożywkę DMEM z płytki do hodowli komórkowej do dołączonej linii komórkowej. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS, aby spłukać resztki pożywki. Dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego i delikatnie przechyl płytkę hodowlaną, aby upewnić się, że całe naczynie jest przykryte.Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, wygasić reakcję trypsyna-EDTA trzema mililitrami pożywki DMEM. Użyj pięciomililitrowej pipety, aby zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, odwirować, a następnie wyhodować komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby napromieniować te wcześniej przygotowane komórki za pomocą oprogramowania konsoli LINAC, należy ustawić suwnicę akceleratora i kolimator na zero stopni, otworzyć szczęki x i y do symetrycznego rozmiaru pola o wymiarach pięć na pięć centymetrów kwadratowych i schować kolimatory wielolistkowe.Dodać co najmniej pięć centymetrów materiału równoważnego wodzie na leżankę zabiegową i umieścić na niej naczynie z komórkami, które mają być napromieniowane, w środku celownika LINAC. Umieść komórki na głębokości maksymalnej dawki w wiązce promieniowania rentgenowskiego o napięciu sześciu megawoltów na około 1,5 centymetra i dodaj dodatkowy centymetr materiału równoważnego wodzie na wierzch naczynia. Przymocuj przednią wskazówkę do główki LINAC i wysuń ją tak, aż dotknie powierzchni nagromadzonego materiału.Dostosuj wysokość stołu, aż odległość od źródła do powierzchni narostu wyniesie 100 centymetrów. Opuść skarbiec leczenia, upewniając się, że wszystkie inne osoby opuściły go. Sprawdź, czy w pomieszczeniu nie ma innych komórek, a następnie zamknij drzwi skarbca.Potwierdź rozmiar pola, jednostki monitorowania i jednostki monitorowania na minutę na konsoli, a następnie włącz wiązkę dla komórki promieniowania. Trzy próbki komórek macierzystych podobnych do glejaka przygotowano przy użyciu tego protokołu i pobrano 24 godziny po napromienianiu. Tam obliczono profile cykli komórkowych i pokazano je z procentową zawartością komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.Zatrzymanie cyklu komórkowego G2 obserwowano po napromienianiu komórek macierzystych glejaka standardową dawką lub bardzo wysoką dawką, w porównaniu z nienapromieniowanymi komórkami kontrolnymi. Aby uzyskać odpowiednią dawkę, najważniejsze jest zmierzenie wysokości pożywki w naczyniu hodowlanym, aby upewnić się, że osiąga ona jeden centymetr. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy biologiczne, takie jak barwienie immunologiczne, western blot i analiza cyklu komórkowego.Ponieważ procedura ta zapewnia naukowcom klinicznie istotne ustawienia dawki i szybkości dawki, może być wykorzystana do oceny wpływu promieniowania na wiele modeli opartych na hodowlach komórkowych.

use-linear-accelerator-for-conducting-vitro-radiobiology

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pacjenci z guzami mózgu rutynowo poddawani są radioterapii czaszki, a choć metoda ta jest korzystna, często prowadzi do wyniszczających zaburzeń poznawczych. Ten poważny, nierozwiązany problem nie ma obecnie żadnego klinicznego lekarstwa, co skłoniło nas do podjęcia wysiłków w celu opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez promieniowanie.

Strategie transplantacji komórek macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez radioterapię czaszki

Funkcja neuronów u dorosłych ssaków pozostaje aktywnym obszarem badań. Promieniowanie jonizujące hamuje powstawanie nowych neuronów. Korzystając z napromieniania ogniskowego pod kontrolą tomografii komputerowej (CFIR), trójwymiarowe anatomiczne celowanie w określone populacje progenitorów nerwowych może być teraz wykorzystane do oceny funkcjonalnej roli neurogenezy dorosłych.

Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym

Rosnąca liczba urządzeń do radioterapii oferuje tę zaletę, że dostarcza dawkę przez bardzo małe wiązki do guza, co pozwala na większą zgodność i wyższe dawki na frakcję. Do dozymetrii tych małych pól można użyć wielu różnych detektorów. W niniejszym badaniu badany jest wpływ rekombinacji jonów w komorze jonizacyjnej z cieczą przy użyciu systemu radioterapii stereotaktycznej.

Charakterystyka efektów rekombinacji w ciekłej komorze jonizacyjnej wykorzystywanej do dozymetrii akceleratora radiochirurgicznego

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

W przeszłości, napromienianie małych zwierząt było zazwyczaj wykonywane bez możliwości celowania w dobrze zdefiniowaną objętość guza. Celem było naśladowanie leczenia glejaka u ludzi u szczurów. Korzystając z platformy do napromieniania małych zwierząt, przeprowadziliśmy konforemne napromienianie 3D pod kontrolą MRI ze zwiększeniem podobjętości na podstawie PET w warunkach przedklinicznych.

Napromienianie pod kontrolą PET i MRI szczurzego modelu glejaka przy użyciu mikropromiennika

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Ten dokument opisuje nowy protokół dozymetryczny dla napromieniania komórek za pomocą niskoenergetycznego sprzętu rentgenowskiego. Pomiary wykonywane są w warunkach w miarę możliwości symulujących rzeczywiste warunki napromieniowania komórek.

Dozymetria do napromieniania komórek przy użyciu aparatury rentgenowskiej o ortonapięciu (40-300 kV)

Dozymetria promieniowania dostarcza techniki zwiększającej dokładność eksperymentów przedklinicznych i zapewniającej, że dostarczane dawki promieniowania są ściśle związane z parametrami klinicznymi. Protokół ten opisuje kroki, które należy podjąć w każdej fazie podczas przedklinicznych eksperymentów radiacyjnych, aby zapewnić prawidłowy projekt eksperymentu.

Uruchomienie promiennika i dozymetria do oceny parametrów α i β LQ, schematu dawkowania promieniowania oraz depozycji dawki in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia przedklinicznej radioterapii opartej na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu glejaka szczurzego przy użyciu opracowanych przez nas algorytmów w celu optymalizacji dokładności i wydajności.

Radioterapia oparta na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu szczura glejaka przy użyciu platformy badawczej promieniowania małych zwierząt

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to potężne narzędzie do badania roli białka translokatora 18 kDa lub ekspresji receptora serotoniny5HT 2A w chorobie Alzheimera w skali komórkowej. Protokół ten opisuje zastosowanie ex-vivo FACS-RTT w modelu szczura TgF344-AD.

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Tutaj szczegółowo opisujemy proste podejście do obrazowania na żywo do ilościowego określenia wrażliwości organoidów nowotworowych pochodzących od pacjentów na promieniowanie jonizujące.

Obrazowanie na żywo w celu ilościowego określenia wrażliwości komórkowej na promieniowanie w organoidach nowotworowych pochodzących od pacjenta

Poznaj metodę oceny biologicznych skutków promieniowania na komórkach nowotworowych przy użyciu akceleratora liniowego. Protokół umożliwia badanie komórek macierzystych i przylegających kultur komórkowych.

Wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro

Przeglądaj więcej filmów