Wykorzystanie akceleratora liniowego do przeprowadzania eksperymentów radiobiologicznych in vitro
May 26th, 2019
Kliniczne akceleratory liniowe mogą być używane do określania efektów biologicznych szerokiego zakresu dawek na komórki rakowe. Omówiliśmy, jak skonfigurować akcelerator liniowy do testów komórkowych i testów dla nowotworowych komórek macierzystych hodowanych jako guzy w zawiesinie i linii komórkowych hodowanych jako kultury adherentne.
Radioterapia jest najczęściej wykonywana przy użyciu akceleratorów liniowych. Protokół ten pozwala naukowcom ocenić biologiczny wpływ promieniowania na komórki za pomocą akceleratora liniowego. Zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu akceleratora liniowego naukowcy mogą badać szeroki zakres klinicznie istotnych dawek i szybkości dawkowania.
Co więcej, protokół ten może być stosowany do wszystkich typów komórek nowotworowych. Ta metoda może być wykonana przy użyciu podobnego sprzętu do pokazanego tutaj. Na przykład akceleratory liniowe produkowane przez innych dostawców.
Osoby, które nie mają doświadczenia w wykonywaniu obliczeń dozymetrycznych przy użyciu akceleratora liniowego, mogą mieć trudności z obliczeniem prawidłowej liczby jednostek monitorujących wymaganych do dostarczenia żądanej dawki do próbki. Skorzystaliby, zasięgnąwszy porady doświadczonego fizyka medycznego lub dozymetry. Dokładne dostarczenie dawki do próbki za pomocą akceleratora liniowego wymaga starannego rozmieszczenia.
Dwa dni przed planowanym napromienianiem, pracując w kapturze hodowlanym, użyj sterylnej pięciomililitrowej pipety, aby pobrać komórki macierzyste glejaka z płytki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj komórki w temperaturze 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy z jednym mililitrem trypsyny-EDTA.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby strawić osad i przygotować zawiesinę jednokomórkową w trypsyno-EDTA. Co dwie minuty podczas trawienia delikatnie potrząsaj dnem probówki wirówkowej, aby upewnić się, że komórki są dokładnie strawione. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki do hodowli komórek macierzystych, aby ugasić trypsynę, delikatnie wymieszaj i odwiruj 200 razy g przez trzy minuty w wirówce nablatowej.
Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Płytka z pięcioma milionami komórek podzielona na dwie 10-centymetrowe płytki zawierające 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Tuż przed planowanym napromienianiem należy zebrać komórki i odwirować tak jak poprzednio.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z pięcioma mililitrami pożywki do hodowli komórkowych. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej na 35-milimetrową płytkę zawierającą dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych, upewniając się, że pożywka osiąga wysokość jednego centymetra. Przenieść posiane komórki do pojemnika wtórnego, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, a następnie przewieźć komórki w pojemniku na wózku użytkowym do zakładu napromieniania w celu napromienienia komórek.
Na dzień przed napromienianiem, pracując w kapturze do hodowli komórkowych, użyj pipety Pasteura podłączonej do próżni, aby usunąć pożywkę DMEM z płytki do hodowli komórkowej do dołączonej linii komórkowej. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS, aby spłukać resztki pożywki. Dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego i delikatnie przechyl płytkę hodowlaną, aby upewnić się, że całe naczynie jest przykryte.
Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, wygasić reakcję trypsyna-EDTA trzema mililitrami pożywki DMEM. Użyj pięciomililitrowej pipety, aby zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, odwirować, a następnie wyhodować komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby napromieniować te wcześniej przygotowane komórki za pomocą oprogramowania konsoli LINAC, należy ustawić suwnicę akceleratora i kolimator na zero stopni, otworzyć szczęki x i y do symetrycznego rozmiaru pola o wymiarach pięć na pięć centymetrów kwadratowych i schować kolimatory wielolistkowe.
Dodać co najmniej pięć centymetrów materiału równoważnego wodzie na leżankę zabiegową i umieścić na niej naczynie z komórkami, które mają być napromieniowane, w środku celownika LINAC. Umieść komórki na głębokości maksymalnej dawki w wiązce promieniowania rentgenowskiego o napięciu sześciu megawoltów na około 1,5 centymetra i dodaj dodatkowy centymetr materiału równoważnego wodzie na wierzch naczynia. Przymocuj przednią wskazówkę do główki LINAC i wysuń ją tak, aż dotknie powierzchni nagromadzonego materiału.
Dostosuj wysokość stołu, aż odległość od źródła do powierzchni narostu wyniesie 100 centymetrów. Opuść skarbiec leczenia, upewniając się, że wszystkie inne osoby opuściły go. Sprawdź, czy w pomieszczeniu nie ma innych komórek, a następnie zamknij drzwi skarbca.
Potwierdź rozmiar pola, jednostki monitorowania i jednostki monitorowania na minutę na konsoli, a następnie włącz wiązkę dla komórki promieniowania. Trzy próbki komórek macierzystych podobnych do glejaka przygotowano przy użyciu tego protokołu i pobrano 24 godziny po napromienianiu. Tam obliczono profile cykli komórkowych i pokazano je z procentową zawartością komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.
Zatrzymanie cyklu komórkowego G2 obserwowano po napromienianiu komórek macierzystych glejaka standardową dawką lub bardzo wysoką dawką, w porównaniu z nienapromieniowanymi komórkami kontrolnymi. Aby uzyskać odpowiednią dawkę, najważniejsze jest zmierzenie wysokości pożywki w naczyniu hodowlanym, aby upewnić się, że osiąga ona jeden centymetr. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy biologiczne, takie jak barwienie immunologiczne, western blot i analiza cyklu komórkowego.
Ponieważ procedura ta zapewnia naukowcom klinicznie istotne ustawienia dawki i szybkości dawki, może być wykorzystana do oceny wpływu promieniowania na wiele modeli opartych na hodowlach komórkowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł dotyczy stosowania klinicznych akceleratorów liniowych do oceny biologicznych efektów promieniowania na komórki nowotworowe. Przedstawia ustawienia do badań komórkowych, w tym komórek nowotworowych przypominających komórki macierzyste w tumorsferach i kulturach komórek adhezywnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Radioterapia
- Biologia nowotworów
- Badania oparte na komórkach
Tło
- Akceleratory liniowe są powszechnie stosowane w radioterapii.
- Ten protokół umożliwia ocenę różnych dawek promieniowania.
- Jest stosowany do wszystkich rodzajów komórek nowotworowych.
- Podobne urządzenia mogą być wykorzystywane przez różnych dostawców.
Cel badania
- Ocenienie biologicznych efektów promieniowania na komórki nowotworowe.
- Dostarczenie protokołu do stosowania akceleratorów liniowych w badaniach.
- Ułatwienie badań nad komórkami nowotworowymi przypominającymi komórki macierzyste.
Zastosowane metody
- Ustawienie akceleratora liniowego do badań opartych na komórkach.
- Badania dla komórek nowotworowych przypominających komórki macierzyste hodowane w zawiesinie.
- Badania dla kultur komórek adhezywnych.
- Ocena zakresu klinicznie istotnych dawek i szybkości dawkowania.
Główne wyniki
- Wykazane wszechstronność akceleratorów liniowych w badaniach nad rakiem.
- Wykazane zdolności do efektywnego badania różnych szybkości dawkowania.
- Dostarczenie informacji na temat biologicznych efektów promieniowania na różne typy komórek nowotworowych.
- Walidacji użycia podobnego sprzętu od różnych producentów.
Wnioski
- Akceleratory liniowe są skuteczną narzędziem do badań nad rakiem.
- Protokół może poprawić zrozumienie efektów promieniowania na komórki nowotworowe.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii do dalszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to evaluate radiation-induced biological effects using clinically relevant doses and dose rates, supporting mechanistic de-risking in oncology target validation. By leveraging linear accelerator technology, teams can generate reproducible, quantitative data to inform go/no-go decisions in preclinical development pipelines. The approach enhances predictive confidence when assessing therapeutic candidates across diverse cancer cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation response pathways to clarify mechanistic hypotheses in target validation.
- Operational Value: Supports functional target de-risking by quantifying cell cycle arrest and DNA damage endpoints.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized irradiation conditions for reproducible compound screening in radio-sensitizer or radio-protector studies.
- Operational Value: Facilitates assay scalability across cell types using vendor-agnostic linear accelerator platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables dose-response modeling that aligns with clinical radiation regimens for improved translational relevance.
- Operational Value: Supports continuity from in vitro mechanistic studies to in vivo validation through standardized dosimetry.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative radiation response data that informs target prioritization and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of radiation-induced phenotypes to de-risk targets early in the discovery cascade.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (e.g., cell cycle arrest) to support high-fidelity compound evaluation.
- Analytics: Generates dosimetry-linked readouts (dose, dose rate, monitor units) enabling cross-condition comparison and statistical rigor.
- Translational Research: Connects in vitro findings to clinical dosing parameters, supporting biomarker-aligned preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable irradiation capability applicable across oncology projects and vendor platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in radiation biology studies through precise dose and dose rate control.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via traceable dosimetry and vendor-flexible implementation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage radiation combination screening, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of radiation-modulating agents based on quantitative preclinical profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiobiology and dosimetry for accurate monitor unit calculation and sample positioning.
- Depends on access to a linear accelerator and water-equivalent bolus materials for dose depth calibration.
- Necessitates cross-team standardization between cell culture and radiation physics teams for protocol adherence.
- Involves adaptation considerations for varying cell culture formats (e.g., dish size, media height) to ensure dose accuracy.
- Limited by the need for specialized safety training and vault access protocols at irradiation facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Cell Preparation for Suspension Cell Culture
2:53
Cell Preparation for Attached Cell Culture
3:40
Irradiation with a Linear Accelerator (LINAC)
4:52
Results: Cell Cycle Effect of Standard Dose Rate and Extra High Dose Rate Irradiation by a Linear Accelerator
5:23
Conclusion
