Mysi model niekompletnie wyciętego mięsaka tkanek miękkich do testowania terapii (neo)adjuwantowych

Protokół ten ma na celu naśladowanie klinicznego otoczenia choroby resztkowej po operacji odciążenia guza, a tym samym pozwala nam testować nowe terapie przeciwnowotworowe w kontekście gojenia się ran pooperacyjnych. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala na standaryzację ilości zadanej rany i ilości guza, który pozostał. Technika ta jest szczególnie ważna dla badań przedklinicznych, ponieważ identyfikuje nowe metody leczenia nowotworów, że nawroty występują miejscowo, czego przykładem jest mięsak tkanek miękkich.

Ta wizualna demonstracja ma kluczowe znaczenie dla zademonstrowania techniki inwersji, która pozwala nam odsłonić guz przyczepiony do strony skóry. Rozpocznij tę procedurę od podskórnej inokulacji przygotowanych komórek rakowych u myszy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W 12 dniu, po inokulacji, gdy guzy osiągnęły rozmiar około 50 milimetrów kwadratowych, podaj myszom 100 mikrolitrów buprenorfiny podskórnie w kark szyi, 30 minut przed operacją.

Ustaw obszar operacyjny z poduszką grzewczą pokrytą płaszczem stołowym i ustaw stożek nosowy do znieczulenia. Ułóż czysty sprzęt chirurgiczny tak, aby był w zasięgu ręki, w tym chlorheksadynę, wacik, gazę, żel do oczu, dwa zakrzywione kleszcze, nożyczki, aplikator do klipsów, narzędzie do usuwania klipsów i wkłady do klipsów. Podgrzej komorę grzewczą do 37 stopni Celsjusza i ustaw kolejną poduszkę grzewczą w celu odzysku.

Należy pamiętać, że ta procedura wymaga dwóch osób. Asystent musi uważnie monitorować oddech myszy podczas zabiegu. Po znieczuleniu myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym wykonaj test szczypania i test odruchu rogówkowego, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem operacji.

Zakryj oczy myszy niewielką ilością żelu okulistycznego, aby uniknąć wysuszenia oczu. Rozpocznij tę operację od pobrania wymazu z obszaru operacyjnego chlorheksadyną. Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj jednocentymetrowe proste nacięcie wzdłuż strony grzbietowej, trzy milimetry od guza.

Nie przecinaj skóry bezpośrednio zakrywającej guz, ponieważ nie zagoi się on dobrze. Unikaj używania skalpela do przecinania guza i używaj pęsety do nabierania kawałków. Za pomocą pęsety odciągnij powięź i podskórną tkankę tłuszczową między guzem a otrzewną.

Guz podskórny jest zwykle przyczepiony do strony skóry. Otwórz ranę, delikatnie przytrzymując skórę po stronie guza za pomocą pęsety i odwróć guz tak, aby był widoczny na zewnątrz. Za pomocą nożyczek odetnij torebkę guza od połowy, którą chcesz usunąć, zaczynając od podstawy guza znajdującej się najbliżej otworu.

W przypadku 50% operacji debulk przeciąć w poprzek środka guza. Za pomocą zakrzywionych kleszczy zgarnij część guza, która ma zostać usunięta. Zbierz wszelkie pozostałości z obszaru debulacji.

Aby uzyskać 75% objętości, zacznij od wykonania 50% debulk guza, a następnie odetnij o połowę pozostałe 50% guza. Zgarnij 25% guza za pomocą zakrzywionych kleszczy. Aby zamknąć pole operacyjne, umieść pozostały guz z powrotem pod skórą i za pomocą kleszczy ściągnij płaty skóry do siebie i wyrównaj skórę wzdłuż rany.

Przytrzymaj skórę razem pięć milimetrów od krawędzi rany i użyj klipsów chirurgicznych, aby zamknąć ranę, zaczynając od boku, najbliżej kleszczy. Zastosuj tyle klipsów, ile potrzeba, aby upewnić się, że żadna tkanka pod spodem nie jest odsłonięta. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się od trzech do czterech klipów z dwumilimetrowymi odstępami między klipami.

Pozwól myszom dojść do siebie, umieszczając je w ciepłej komorze grzewczej. Umieść klatkę myszy na poduszce grzewczej. Monitoruj myszy w komorze grzewczej, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.

Następnie włóż myszy z powrotem do klatki, pozostaw klatkę na poduszce grzewczej na kolejne 10 minut, aż myszy staną się bardziej aktywne. Podawaj myszom mokre i miękkie jedzenie. Monitoruj myszy godzinę po zabiegu w celu powrotu do zdrowia.

Ponownie monitoruj myszy pod koniec dnia i następnego ranka i upewnij się, że klipsy pozostają na swoim miejscu. Myszy należy leczyć okołooperacyjnie terapią adwentową lub neoadjuwantową w dowolnym momencie, w zależności od interesującego Cię leczenia. Na przykład myszom należy podać jedną dawkę 100 mikrogramów anty-CTLA-4 dootrzewnowo w 15 dniu po inokulacji.

Alternatywnie, potraktuj myszy trzema dawkami po 200 mikrogramów anty-PD-1 dootrzewnowo w dniach 15, 17 i 19 po inokulacji. Niepełna resekcja chirurgiczna guzów o powierzchni 50 milimetrów kwadratowych, oznaczona tutaj linią przerywaną, powoduje 100% powtarzalny odrost guzów przy braku immunoterapii uzupełniającej. Dlatego wzrost guza do wielkości 50 milimetrów kwadratowych jest idealnym rozmiarem do częściowego zmniejszenia objętości.

Model ten został następnie wykorzystany do przetestowania immunoterapii adjuwantowych z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko modułom punktów kontrolnych, cytotoksycznemu białku czterem związanym z limfocytami T i receptorowi programowanej śmierci jeden. Leczenie myszy anty-CTLA-4 spowodowało wyleczenie na poziomie 80%Podczas gdy leczenie myszy anty-PD-1 spowodowało wyleczenie na poziomie 25%Odpowiedź na anty-PD-1 daje możliwość przetestowania go w nowych kombinacjach, aby jeszcze bardziej poprawić wskaźnik odpowiedzi. Ważne jest, aby pozostały guz pozostał przyczepiony do skóry, w przeciwnym razie dopływ krwi zostanie odcięty, a guz stanie się martwiczy.

Po tej procedurze guzy można analizować różnymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, w celu oceny, jak operacja wpływa na komórki naciekające nowotwór. Ten mysi model pozwolił nam zbadać, w jaki sposób gojenie się ran wpływa na immunoterapię nowotworów.