Przedkliniczny, kontrolowany model oddziaływania kory mózgowej w przypadku krwotoku pourazowego, stłuczenia i zapalenia nerwów

Krwotok śródmiąższowy i zapalenie nerwów, któremu towarzyszy stłuczenie mózgu, mogą spowodować poważne wtórne uszkodzenie mózgu. Protokół ten szczegółowo opisuje model kontrolowanego wpływu kory mózgowej (CCI) na myszy, umożliwiając naukowcom badanie kontuzji krwotoku i pourazowych odpowiedzi immunologicznych oraz badanie potencjalnych terapii.

Model ten można wykorzystać do badania patologii związanych ze stłuczeniem mózgu, w tym krwotoku śródczaszkowego, toksyczności żelaza, śmierci neuronów, uszkodzenia aksonów, deficytu neurologicznego i zapalenia neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że stopień uszkodzenia mózgu można łatwo kontrolować, manipulując parametrami biochemicznymi, takimi jak prędkość i śmierć uderzenia w urządzenie CCI. Ogniskowe uszkodzenie kory mózgowej wywołane przez CCI jest wysoce powtarzalne.

Właściwa technika stereotaktyczna i zabieg kraniotomii są głównymi czynnikami decydującymi o wytworzeniu stabilnego i powtarzalnego uszkodzenia mózgu wywołanego przez CCI. Ogólnie rzecz biorąc, badacz nowy w procedurze będzie miał trudności ze stabilizacją myszy na ramie sterioteksji i wykonaniem odpowiedniej kraniotomii. Procedurę zademonstruje pani Jhih Shuan Lin, technik laboratoryjny z mojego laboratorium.

Zacznij od potwierdzenia braku odruchu szczypania palców u zwierzęcia, aby upewnić się, że jest ono odpowiednio znieczulone. Ogol głowę myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia w kierunku ogonowym do rostralnego. Ale nie przycinaj wąsów.

Umieść mysz na ramie stereotaktycznej i ostrożnie włóż nauszniki do kanałów słuchowych, upewniając się, że główka myszy jest stabilizowana równomiernie przez oba paski douszne. Utrzymuj znieczulenie na poziomie od jednego do 2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż wazelinę na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.

Następnie za pomocą sterylnych wacików bawełnianych zdezynfekuj ogoloną głowę betadyną, a następnie 70% etanolem. Podawać 100 mikrolitrów 0,25% bupiwakainy podskórnie za pomocą igły insuliny o rozmiarze 31 i delikatnie masować miejsce wstrzyknięcia, aby uzyskać lepsze wchłanianie. Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż linii środkowej na skórze głowy za pomocą skalpela lub nożyczek.

Następnie użyj hemostatu, aby ściągnąć skórę na prawą stronę. Pozostaw odsłoniętą czaszkę do wyschnięcia na jedną minutę. Następnie oczyść resztki krwi i tkanki na czaszce sterylnym wacikiem.

Sprawdź, czy głowa zwierzęcia znajduje się poziomo w płaszczyźnie poziomej i zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne, Bregma i Lambda, zaznaczając oba miejsca ołówkiem. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest wypoziomowana w kierunku rostralno-ogonowym, mierząc współrzędne Z zarówno Bregma, jak i Lambda. Użyj tej samej procedury, aby ustawić głowę w poziomie.

Użyj igły do insuliny o rozmiarze 31, aby zidentyfikować miejsce kraniektomii. Ustaw początek układu współrzędnych XY na Bregma i przesuń igłę w bok o trzy milimetry w prawo. Zaznacz to miejsce jako miejsce kraniektomii i narysuj ołówkiem okrąg o średnicy czterech milimetrów na czaszce.

Wytnij wzdłuż okręgu obrysowanego ołówkiem za pomocą szybkoobrotowego mikrowiertła z trepanacją, aby utworzyć otwarty otwór o średnicy czterech milimetrów. Usuń płat kostny za pomocą pęsety i przechowuj go w lodowatym, normalnym roztworze soli fizjologicznej. Delikatnie przepłucz otwór solą fizjologiczną przed wywieraniem nacisku na powierzchnię mózgu, aby zatrzymać krwawienie.

W urządzeniu CCI ustaw zaokrągloną końcówkę udaru o średnicy 2,5 milimetra pod kątem 22,5 stopnia. Wyzeruj końcówkę udarową do powierzchni opony twardej i ustaw parametry uderzenia na skrzynce sterowniczej na prędkość czterech metrów na sekundę i głębokość odkształcenia dwie milimetry. Cofnij metalową końcówkę.

Wypuścić tłok, aby wytworzyć zakleszczenie w mózgu. Następnie umieść sterylny bawełniany wacik na zranionym obszarze, aby zatrzymać krwawienie. Wymień płat kostny i zabezpiecz go cementem dentystycznym.

Zamknij skórę głowy klejem tkankowym. Umieść mysz pod lampą grzewczą w czystej klatce regeneracyjnej z pościelą do czasu pełnego wyzdrowienia. Właściwa technika stereotaktyczna i zabieg kraniektomii są głównymi czynnikami decydującymi o wytworzeniu stabilnego i powtarzalnego uszkodzenia mózgu wywołanego przez CCI.

Idealny zabieg kraniektomii spowodowałby minimalne uszkodzenie histologiczne w pozorowanym operowanym mózgu. Zmiany w uszkodzeniu mózgu i utracie ciała modzelowatego obserwowano w dniach 1, 3, 7 i 28 po CCI. Ponadto jednostronny zanik mózgu po stronie stłuczenia zaobserwowano w 28 dniu po CCI.

Zapalenie nerwów objawiło się przez aktywowany mikroglej i akumulację makrofagów Iba1-dodatnich wokół granicy obszaru stłuczenia. Krwotok śródmiąższowy był również wykrywalny przez barwienie Ly76-dodatnie od pierwszego do siódmego dnia po CCI. Mieszaninę czerwonych krwinek z pękniętą i nienaruszoną morfologią komórek zaobserwowano w siódmym dniu po CCI, co sugeruje, że erytrocyty były lizowane na tym etapie.

Zjawisko to było zgodne z obserwacją, że osadzanie się żelaza było wykrywalne w obszarze stłuczenia od siódmego do 28 dnia po CCI. Aktywowany mikroglej i makrofagi obserwowano w prążkowiu daleko od miejsca stłuczenia od trzeciego do 28 dnia po CCI, co wskazuje na uszkodzenia ciała modzelowatego i prążkowia. Technika ta toruje badaczom drogę do dalszego badania interakcji neurozapalnej wywołanej krwotokiem do mózgu poprzez zrozumienie odpowiedzi komórek odpornościowych, takich jak mikroglej, po stłuczeniu krwotoku.