Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania
January 20th, 2023
Tutaj pokazano, jak model urazu głowy w stanie czuwania może być wykorzystany do zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model replikuje ważne cechy r-mTBI u pacjentów i jest stosowany w połączeniu z elektrofizjologią in vitro.
Protokół ten zapewnia jednoznaczną metodę produkcji wysokiej jakości poprzecznych wycinków hipokampa od zwierząt podawanych przez r-mTBI z modelem ACHI. Model ACHI powoduje łagodne urazy. Nie wiąże się ze złamaniami lub krwawieniami czaszki, kraniotomią ani stosowaniem środków znieczulających.
Dodatkowo pozwala na stabilne zapisy elektrofizjologiczne. Techniki te pozwalają na badanie zmian plastyczności synaptycznej po powtarzającym się MTBI, dla których etiologia jest w znacznym stopniu nieznana, z potencjałem informowania o ścieżkach terapeutycznych. Procedurę zademonstrują Allyson Gross, studentka studiów magisterskich w moim laboratorium, oraz dr Eric Eyolfson, doktor habilitowany.
Zacznij od umieszczenia szczura w stożku krępującym, upewniając się, że pysk i nozdrza znajdują się blisko małego otworu stożków, aby umożliwić odpowiednią wentylację. Zapobiegaj ruchom szczura, przytrzymując stożek zamknięty na końcu ogonowym plastikową spinką do włosów. Ręcznie umieść kask nad linią środkową unieruchomionego szczura z dyskiem celowniczym nad lewym płatem ciemieniowym.
Następnie umieść szczura na podkładce piankowej przed ręcznym ustawieniem impaktora w pozycji wyprostującej. Ręcznie opuść końcówkę udaru, aby zetknąć się z tarczą docelową na hełmie. Następnie ustaw impaktor w pozycji chowania, aby impaktor wycofał się 10 milimetrów nad kaskiem.
Używając pokrętła na ramieniu stereotaktycznym, opuść końcówkę udarową o 10 milimetrów, aby ponownie dotknąć tarczy celowniczej na kasku. Następnie przestaw przełącznik udarowy tak, aby głowa zwierzęcia była gwałtownie przyspieszana z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 10 milimetrów. Po aktywacji urządzenia należy natychmiast wyjąć zwierzę ze stożka przytrzymującego, aby przeprowadzić natychmiastowy protokół oceny neurologicznej lub NAP.
Po eutanazji myszy przeprowadź sekcję mózgu i umieść go na zwilżonej bibule filtracyjnej na odwróconej szalce Petriego. Za pomocą ostrego skalpela usuń móżdżek i korę przedczołową, aby osuszyć mózg. Oddziel dwie półkule, przecinając linię środkową mózgu.
Aby utworzyć poprzeczne plastry hipokampa, umieść jedną półkulę na powierzchni przyśrodkowej, przechyl skalpel pod kątem około 30 stopni do wewnątrz i usuń cienki plasterek z grzbietowej powierzchni mózgu, aby zapewnić płaską powierzchnię do zamontowania na tłoku. Odwróć mózg na powierzchnię grzbietową i delikatnie przetrzyj tkankę mózgową na suchej bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar ACSF. Następnie przymocuj grzbietową powierzchnię mózgu do tłoka za pomocą kleju cyjanoakrylowego, pozostawiając powierzchnię brzuszną w pozycji pionowej.
Rozciągnij zewnętrzną rurkę tłoka nad mózgiem i wlej płynną agarozę do rurki, aż mózg zostanie całkowicie pokryty. Szybko zestal agarozę, zaciskając blok chłodzący na rurze tłoka. Umieść tłok w komorze krajalnicy i zabezpiecz komorę śrubą.
Po zabezpieczeniu ostrza dodaj lodowaty natleniony ACSF do komory krajalnicy. Na krajalnicy ustaw prędkość cięcia na cztery, oscylację na sześć i przełącz przełącznik ciągłego pojedynczego krojenia na ciągłe. Następnie naciśnij Start, aby rozpocząć cięcie mózgu na 400 mikrometrów.
Gdy krajalnica tnie mózg, użyj pipety Pasteura o dużej średnicy, aby przenieść każdy plasterek do kąpieli regeneracyjnej natlenionego ACSF. Pozwól plasterkom zregenerować się w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie pozostaw je do odzyskania na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz te kroki, aby utworzyć plasterki z drugiej półkuli.
Za pomocą dostępnego w handlu ściągacza do mikropipet wyciągnij elektrody rejestrujące o średnicy od jednego do dwóch megaomów z 10-centymetrowych kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra i średnicy wewnętrznej 1,1 milimetra. Za pomocą pipety Pasteura przenieś wycinek hipokampa z kąpieli regeneracyjnej do komory, w której jest perfuzjowany karbogenicznym ACSF i utrzymywany w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ustaw wycinek mózgu tak, aby zakręt zębaty i warstwa komórek ziarnistości były widoczne w polu widzenia.
Użyj mikroskopu pionowego, aby uwidocznić zakręt zębaty z ukośną optyką. Umieść koncentryczną bipolarną elektrodę stymulującą, aby aktywować przyśrodkową ścieżkę perforacyjną lub włókna MPP w środkowej jednej trzeciej warstwy molekularnej. Następnie umieść szklaną mikropipetę wypełnioną ACSF w MPP.
Zacznij od bardziej oddalonych od siebie elektrod, ponieważ dotknięcie tkanki spowoduje uszkodzenie włókien. Po ustawieniu elektrod stymulujących i rejestrujących wizualizuj wywołane reakcje pola za pomocą wzmacniacza, digitizera i oprogramowania do nagrywania. Znajdź odpowiedni potencjał postsynaptyczny pobudzający pole lub pole EPSP, stymulując tkankę impulsami prądu i zapewniając minimalną amplitudę 0,7 miliwolta z przezroczystym włóknem mniejszym niż pole EPSP.
Zwiększ i ustaw intensywność symulacji, aż pole EPSP osiągnie 70% maksymalnej amplitudy. Następnie ustal stabilną linię bazową kondycjonowania wstępnego przez 20 minut z impulsami 0,12 milisekundy dostarczanymi z częstotliwością 0,067 Hz. Aby uzyskać stabilny przekrój, początkowe nachylenie fEPSP powinno być mniejsze niż 10% zmienności, a nachylenie linii najlepszego dopasowania przez nachylenia EPSP wykreślonego pola powinno być mniejsze niż 0,5.
Określ zmiany w podstawowych właściwościach synaptycznych za pomocą sparowanych bodźców impulsowych i konstruuj krzywe bodźca/odpowiedzi wejścia/wyjścia. Do testu parowanych impulsów zastosuj serię sparowanych impulsów z interwałem międzyimpulsowym wynoszącym 50 milisekund przy 0,033 herca. Dla krzywych wejścia/wyjścia zastosuj serię rosnących intensywności bodźca od 0,0 do 0,24 milisekundy przy 0,033 Hz, aby wykreślić zmianę rozmiaru odpowiedzi pola EPSP.
Aby zbadać długotrwałą depresję zależną głównie od aktywacji receptora CB1, należy zastosować 6 000 impulsów w częstotliwości 10 herców. W przypadku nagrań po kondycjonowaniu wznów na dodatkowe 60 minut, stosując stymulację pojedynczym impulsem trwającą 0,12 milisekundy z częstotliwością 0,067 Hz. Po nagraniu po kondycjonowaniu podawaj bodźce impulsowe ze sparowanymi impulsami, a następnie krzywą wejścia/wyjścia.
Porównaj je z zapisami wyjściowymi z obserwowanymi zmianami we właściwościach uwalniania presynaptycznego i oceń stan wycinka dla zapisów długoterminowych. Podczas analizy należy przestrzegać kryteriów wykluczenia w celu określenia retencji danych z poszczególnych wycinków w zestawie danych plastyczności presynaptycznej. Wyklucz wycinki, w których występuje duże nachylenie w linii najlepszego dopasowania nachyleń EPSP pola podczas linii bazowej kondycjonowania wstępnego, niestabilność linii bazowej kondycjonowania wstępnego i niestabilność w okresie kondycjonowania wstępnego.
Na początku badania protokół oceny neurologicznej lub wyniki NAP nie wykazały różnicy między szczurami z pozorowanym a powtarzanym mTBI. Po wszystkich sesjach urazów głowy w stanie czuwania, powtarzające się szczury mTBI wykazywały znaczne upośledzenie w zadaniach NAP w porównaniu z pozorami, co wskazuje, że wytworzyły się subtelne, ale znaczące deficyty behawioralne. Podano serię sparowanych impulsów i obliczono stosunek wielkości EPSP drugiego pola do EPSP pierwszego pola.
Współczynniki sparowanych impulsów nie różniły się między szczurami pozorowanymi i powtarzającymi się mTBI, ujawniając, że powtarzające się szczury mTBI nie zmieniały podstawowej fizjologii synaptycznej w wejściu MPP do zakrętu zębatego. Kiedy zastosowano protokół 10 Hz w celu wywołania długotrwałej depresji, nastąpił tymczasowy, ale znaczący spadek zdolności wejścia MPP do zakrętu zębatego do utrzymania długotrwałej depresji w pierwszym dniu po urazie. Jednak w siódmym dniu po urazie plastry od pozorowanych i powtarzających się zwierząt z mTBI wykazywały równoważną długotrwałą depresję, chociaż istniały oznaki niewielkiej tendencji u zwierząt z powtarzającymi się mTBI, aby wykazywać wzrost długotrwałej depresji.
Planowanie procesu preparacji i cięcia z wyprzedzeniem ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego stworzenia żywotnych wycinków hipokampa i uzyskania stabilnych zapisów elektrofizjologicznych. Procedura ta tworzy stabilną platformę eksperymentalną, którą można wykorzystać do zbadania patofizjologii TBI i opracowania nowych ścieżek terapeutycznych. Ruch od usunięcia mózgu do ustawienia go w celu przecięcia w skompresowanej folii w przypadku poprzecznych wycinków hipokampa jest ważny, podobnie jak dokładne umieszczenie elektrod w zakręcie zębatym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje czuwały model zamkniętego urazu głowy w celu zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model dokładnie odwzorowuje ważne cechy r-mTBI obserwowane u pacjentów i integruje in vitro elektrofizjologię, aby zbadać zmiany synaptyczne.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Plastyczność synaptyczna
- Uraz mózgu
Tło
- Zrozumienie wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Model ACHI wywołuje łagodne urazy bez złamań czaszki lub środków znieczulających, co jest korzystne dla ocen elektrofizjologicznych.
- Badanie plastyczności synaptycznej dostarcza wglądu w podstawowe mechanizmy r-mTBI.
- Wyzwania pozostają w zrozumieniu etiologii zmian synaptycznych po powtarzających się urazach.
Cel badania
- Zbadanie wpływu r-mTBI na plastyczność synaptyczną w hipokampie.
- Opracowanie solidnej metodologii do badania tych zmian za pomocą modelu zamkniętego urazu głowy u czujnych zwierząt.
- Potencjalne informowanie ścieżek terapeutycznych na podstawie zaobserwowanych zmian synaptycznych.
Stosowane metody
- Badanie wykorzystuje wysokiej jakości przekrojowe plamy hipokampa od zwierząt, którym podano r-mTBI.
- Zastosowany jest model ACHI, w którym głowa jest narażona na kontrolowane uderzenia w celu wywołania łagodnych urazów.
- Rejestracje elektrofizjologiczne są przeprowadzane w celu oceny zmian właściwości synaptycznych po urazie.
- Kroki metodologiczne obejmują staranne przygotowanie anatomiczne i precyzyjne umieszczenie elektrod stymulujących i rejestrujących do zbierania danych.
- Rejestracje po kondycjonowaniu oceniają długoterminowe właściwości synaptyczne przez dłuższe okresy.
Główne wyniki
- Metodologia dostarcza szczegółowych informacji na temat wpływu r-mTBI na efektywność synaptyczną.
- Oceny elektrofizjologiczne podkreślają istotne zmiany w pobudzeniowych potencjałach postsynaptycznych po urazie.
- Wyniki sugerują zmiany właściwości uwalniania presynaptycznego i dynamiki reakcji synaptycznych w różnych próbach eksperymentalnych.
- Ogólnie, badanie wyjaśnia kluczowe aspekty funkcji synaptycznych w modelu urazu mózgu.
Wnioski
- To badanie ustanawia niezawodny model do badania zmian synaptycznych po r-mTBI.
- Dogłębna analiza danych elektrofizjologicznych dostarcza wglądu w mechanizmy neuronowe i zmiany plastyczności.
- Wyniki podkreślają znaczenie wykorzystywania tego modelu do poszerzania rozumienia urazów mózgu i interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Translationally relevant preclinical models are essential for de-risking CNS drug discovery targeting synaptic plasticity after mild traumatic brain injury (mTBI). The awake closed-head injury (ACHI) model enables robust, artifact-free assessment of synaptic function in juvenile brain tissue, supporting predictive confidence for early-stage neurotherapeutic portfolios. This approach strengthens the bridge between mechanistic discovery and preclinical validation in neurotrauma research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of synaptic plasticity mechanisms following repetitive mTBI in a clinically relevant context.
- Supports biological de-risking by isolating injury-induced changes in hippocampal circuitry.
- Facilitates functional target validation for neuroprotective and synaptic repair strategies.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers validated hippocampal slice preparations for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes paired-pulse and input/output protocols for reproducible synaptic measurements.
- Enables quantitative assessment of long-term depression and synaptic response dynamics.
- Prepares a scalable platform for compound screening targeting synaptic modulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical injury models with human-relevant mTBI phenotypes for translational continuity.
- Supports biomarker discovery by linking electrophysiological readouts to behavioral deficits.
- Enables risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on mechanistic endpoints.
- Provides a foundation for evaluating disease-relevant interventions in juvenile populations.
Pipeline & Workflow Integration
The ACHI model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling mechanistic studies, assay development, and translational validation for CNS drug programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on synaptic plasticity alterations post-mTBI.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers paired-pulse ratios, input/output curves, and long-term depression metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges preclinical findings to clinical mTBI phenotypes and behavioral outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurotrauma and synaptic function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and electrophysiological protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation for neurotherapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting synaptic repair and neuroprotection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, brain dissection, and electrophysiological recording.
- Demands access to controlled cortical impactors, tissue slicers, and advanced recording systems.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of exclusion criteria and data retention thresholds.
- Adaptable to various rodent ages and injury paradigms with protocol modifications.
- Potential variability in injury response across subjects must be managed for reproducibility.
