Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania

Protokół ten zapewnia jednoznaczną metodę produkcji wysokiej jakości poprzecznych wycinków hipokampa od zwierząt podawanych przez r-mTBI z modelem ACHI. Model ACHI powoduje łagodne urazy. Nie wiąże się ze złamaniami lub krwawieniami czaszki, kraniotomią ani stosowaniem środków znieczulających.

Dodatkowo pozwala na stabilne zapisy elektrofizjologiczne. Techniki te pozwalają na badanie zmian plastyczności synaptycznej po powtarzającym się MTBI, dla których etiologia jest w znacznym stopniu nieznana, z potencjałem informowania o ścieżkach terapeutycznych. Procedurę zademonstrują Allyson Gross, studentka studiów magisterskich w moim laboratorium, oraz dr Eric Eyolfson, doktor habilitowany.

Zacznij od umieszczenia szczura w stożku krępującym, upewniając się, że pysk i nozdrza znajdują się blisko małego otworu stożków, aby umożliwić odpowiednią wentylację. Zapobiegaj ruchom szczura, przytrzymując stożek zamknięty na końcu ogonowym plastikową spinką do włosów. Ręcznie umieść kask nad linią środkową unieruchomionego szczura z dyskiem celowniczym nad lewym płatem ciemieniowym.

Następnie umieść szczura na podkładce piankowej przed ręcznym ustawieniem impaktora w pozycji wyprostującej. Ręcznie opuść końcówkę udaru, aby zetknąć się z tarczą docelową na hełmie. Następnie ustaw impaktor w pozycji chowania, aby impaktor wycofał się 10 milimetrów nad kaskiem.

Używając pokrętła na ramieniu stereotaktycznym, opuść końcówkę udarową o 10 milimetrów, aby ponownie dotknąć tarczy celowniczej na kasku. Następnie przestaw przełącznik udarowy tak, aby głowa zwierzęcia była gwałtownie przyspieszana z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 10 milimetrów. Po aktywacji urządzenia należy natychmiast wyjąć zwierzę ze stożka przytrzymującego, aby przeprowadzić natychmiastowy protokół oceny neurologicznej lub NAP.

Po eutanazji myszy przeprowadź sekcję mózgu i umieść go na zwilżonej bibule filtracyjnej na odwróconej szalce Petriego. Za pomocą ostrego skalpela usuń móżdżek i korę przedczołową, aby osuszyć mózg. Oddziel dwie półkule, przecinając linię środkową mózgu.

Aby utworzyć poprzeczne plastry hipokampa, umieść jedną półkulę na powierzchni przyśrodkowej, przechyl skalpel pod kątem około 30 stopni do wewnątrz i usuń cienki plasterek z grzbietowej powierzchni mózgu, aby zapewnić płaską powierzchnię do zamontowania na tłoku. Odwróć mózg na powierzchnię grzbietową i delikatnie przetrzyj tkankę mózgową na suchej bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar ACSF. Następnie przymocuj grzbietową powierzchnię mózgu do tłoka za pomocą kleju cyjanoakrylowego, pozostawiając powierzchnię brzuszną w pozycji pionowej.

Rozciągnij zewnętrzną rurkę tłoka nad mózgiem i wlej płynną agarozę do rurki, aż mózg zostanie całkowicie pokryty. Szybko zestal agarozę, zaciskając blok chłodzący na rurze tłoka. Umieść tłok w komorze krajalnicy i zabezpiecz komorę śrubą.

Po zabezpieczeniu ostrza dodaj lodowaty natleniony ACSF do komory krajalnicy. Na krajalnicy ustaw prędkość cięcia na cztery, oscylację na sześć i przełącz przełącznik ciągłego pojedynczego krojenia na ciągłe. Następnie naciśnij Start, aby rozpocząć cięcie mózgu na 400 mikrometrów.

Gdy krajalnica tnie mózg, użyj pipety Pasteura o dużej średnicy, aby przenieść każdy plasterek do kąpieli regeneracyjnej natlenionego ACSF. Pozwól plasterkom zregenerować się w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie pozostaw je do odzyskania na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz te kroki, aby utworzyć plasterki z drugiej półkuli.

Za pomocą dostępnego w handlu ściągacza do mikropipet wyciągnij elektrody rejestrujące o średnicy od jednego do dwóch megaomów z 10-centymetrowych kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra i średnicy wewnętrznej 1,1 milimetra. Za pomocą pipety Pasteura przenieś wycinek hipokampa z kąpieli regeneracyjnej do komory, w której jest perfuzjowany karbogenicznym ACSF i utrzymywany w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ustaw wycinek mózgu tak, aby zakręt zębaty i warstwa komórek ziarnistości były widoczne w polu widzenia.

Użyj mikroskopu pionowego, aby uwidocznić zakręt zębaty z ukośną optyką. Umieść koncentryczną bipolarną elektrodę stymulującą, aby aktywować przyśrodkową ścieżkę perforacyjną lub włókna MPP w środkowej jednej trzeciej warstwy molekularnej. Następnie umieść szklaną mikropipetę wypełnioną ACSF w MPP.

Zacznij od bardziej oddalonych od siebie elektrod, ponieważ dotknięcie tkanki spowoduje uszkodzenie włókien. Po ustawieniu elektrod stymulujących i rejestrujących wizualizuj wywołane reakcje pola za pomocą wzmacniacza, digitizera i oprogramowania do nagrywania. Znajdź odpowiedni potencjał postsynaptyczny pobudzający pole lub pole EPSP, stymulując tkankę impulsami prądu i zapewniając minimalną amplitudę 0,7 miliwolta z przezroczystym włóknem mniejszym niż pole EPSP.

Zwiększ i ustaw intensywność symulacji, aż pole EPSP osiągnie 70% maksymalnej amplitudy. Następnie ustal stabilną linię bazową kondycjonowania wstępnego przez 20 minut z impulsami 0,12 milisekundy dostarczanymi z częstotliwością 0,067 Hz. Aby uzyskać stabilny przekrój, początkowe nachylenie fEPSP powinno być mniejsze niż 10% zmienności, a nachylenie linii najlepszego dopasowania przez nachylenia EPSP wykreślonego pola powinno być mniejsze niż 0,5.

Określ zmiany w podstawowych właściwościach synaptycznych za pomocą sparowanych bodźców impulsowych i konstruuj krzywe bodźca/odpowiedzi wejścia/wyjścia. Do testu parowanych impulsów zastosuj serię sparowanych impulsów z interwałem międzyimpulsowym wynoszącym 50 milisekund przy 0,033 herca. Dla krzywych wejścia/wyjścia zastosuj serię rosnących intensywności bodźca od 0,0 do 0,24 milisekundy przy 0,033 Hz, aby wykreślić zmianę rozmiaru odpowiedzi pola EPSP.

Aby zbadać długotrwałą depresję zależną głównie od aktywacji receptora CB1, należy zastosować 6 000 impulsów w częstotliwości 10 herców. W przypadku nagrań po kondycjonowaniu wznów na dodatkowe 60 minut, stosując stymulację pojedynczym impulsem trwającą 0,12 milisekundy z częstotliwością 0,067 Hz. Po nagraniu po kondycjonowaniu podawaj bodźce impulsowe ze sparowanymi impulsami, a następnie krzywą wejścia/wyjścia.

Porównaj je z zapisami wyjściowymi z obserwowanymi zmianami we właściwościach uwalniania presynaptycznego i oceń stan wycinka dla zapisów długoterminowych. Podczas analizy należy przestrzegać kryteriów wykluczenia w celu określenia retencji danych z poszczególnych wycinków w zestawie danych plastyczności presynaptycznej. Wyklucz wycinki, w których występuje duże nachylenie w linii najlepszego dopasowania nachyleń EPSP pola podczas linii bazowej kondycjonowania wstępnego, niestabilność linii bazowej kondycjonowania wstępnego i niestabilność w okresie kondycjonowania wstępnego.

Na początku badania protokół oceny neurologicznej lub wyniki NAP nie wykazały różnicy między szczurami z pozorowanym a powtarzanym mTBI. Po wszystkich sesjach urazów głowy w stanie czuwania, powtarzające się szczury mTBI wykazywały znaczne upośledzenie w zadaniach NAP w porównaniu z pozorami, co wskazuje, że wytworzyły się subtelne, ale znaczące deficyty behawioralne. Podano serię sparowanych impulsów i obliczono stosunek wielkości EPSP drugiego pola do EPSP pierwszego pola.

Współczynniki sparowanych impulsów nie różniły się między szczurami pozorowanymi i powtarzającymi się mTBI, ujawniając, że powtarzające się szczury mTBI nie zmieniały podstawowej fizjologii synaptycznej w wejściu MPP do zakrętu zębatego. Kiedy zastosowano protokół 10 Hz w celu wywołania długotrwałej depresji, nastąpił tymczasowy, ale znaczący spadek zdolności wejścia MPP do zakrętu zębatego do utrzymania długotrwałej depresji w pierwszym dniu po urazie. Jednak w siódmym dniu po urazie plastry od pozorowanych i powtarzających się zwierząt z mTBI wykazywały równoważną długotrwałą depresję, chociaż istniały oznaki niewielkiej tendencji u zwierząt z powtarzającymi się mTBI, aby wykazywać wzrost długotrwałej depresji.

Planowanie procesu preparacji i cięcia z wyprzedzeniem ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego stworzenia żywotnych wycinków hipokampa i uzyskania stabilnych zapisów elektrofizjologicznych. Procedura ta tworzy stabilną platformę eksperymentalną, którą można wykorzystać do zbadania patofizjologii TBI i opracowania nowych ścieżek terapeutycznych. Ruch od usunięcia mózgu do ustawienia go w celu przecięcia w skompresowanej folii w przypadku poprzecznych wycinków hipokampa jest ważny, podobnie jak dokładne umieszczenie elektrod w zakręcie zębatym.