Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie
1 września 2020
Ten protokół przedstawia przepływ pracy dla sub-mm wizualizacji 2D wielu labilnych nieorganicznych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) w połączeniu z obrazowaniem spektrometrii mas. Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i analiza chemiczna o wysokiej rozdzielczości są szczegółowo opisane w celu ilościowego mapowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych.
Obieg biologiczno-chemiczny pierwiastków w glebie odgrywa kluczową rolę w systemach środowiskowych. Dzięki temu protokołowi rozkład frakcji pierwiastków dostępnych w roślinie można obrazować w 2D za pomocą obrazowania spektrometrii mas DGT. Metoda ta jest wyjątkowa ze względu na zdolność do wizualizacji i ilościowego określania ultraśladowych poziomów wielu nieorganicznych gatunków substancji rozpuszczonych na granicy faz substancji rozpuszczonej, znacznie przekraczając rozdzielczość przestrzenną metod alternatywnych.
Oprócz badania przepływów pracy i substancji rozpuszczonych w glebach i osadach, metoda ta może być stosowana do zbadania, w jaki sposób korzenie roślin pobierają składniki odżywcze i zanieczyszczenia. W przypadku wytwarzania żelu DGT, najpierw pokryj cienką warstwę mieszaniny anionów i zawiesiny żelu wiążącego kationy na bazie poliuretanu na szklanej płytce, a następnie umieść płytkę w piecu, aby zainicjować tworzenie się żelu przez odparowanie rozpuszczalnika. Po powtórzeniu aplikacji i trzykrotnym odparowaniu, uwodnić powstałą potrójnie powlekaną płytkę szklaną w łaźni wodnej, aby uzyskać cienki, odporny na rozdarcie, mieszany żel wiążący aniony i kationy o grubości 0,1 milimetra.
Aby zmontować ryzotron, użyj dwóch zacisków, aby przymocować jedno małe akrylowe ostrze na dole wzniesienia ryzotronu z naciskiem zacisków skierowanym na ramę ryzotronu, tak aby płyta nie wygięła się do wewnątrz. Nachyl lekko ryzotron w kierunku małej plastikowej płytki i wypełnij ryzotron wstępnie zwilżoną glebą do przybliżonej wysokości czterech centymetrów. Lekko zamieszaj ryzotron, aby równomiernie rozprowadzić glebę i użyj narzędzia do zagęszczania, aby delikatnie ścisnąć glebę o kilka milimetrów.
Powtarzaj napełnianie i ściskanie, aż ryzotron zostanie wypełniony glebą, pozostawiając trzycentymetrową szczelinę u góry. Użyj taśmy, aby ostrożnie przymocować kawałek folii PTFE o wymiarach 13 na 22 centymetry do ramy ryzotronowej po jednym rogu na raz, napinając, aby zapewnić płaską powierzchnię folii. Gdy folia PTFE jest płaska i przylega do powierzchni gleby, przymocuj drugi kawałek folii na dolnym końcu ryzotronu, zachodząc na górny kawałek folii PTFE o jeden centymetr w ten sam sposób.
Po zabezpieczeniu drugiego elementu nałóż ochronną osłonę z folii plastikowej. Umieść przednią płytkę na wypełnionym ziemią i pokrytym folią ryzotronie i umieść po jednej szynie z każdej strony ryzotronu. Następnie dokręć ręcznie, aby przymocować szyny w płycie przedniej do ryzotronu tak, aby były skierowane w stronę zamkniętej strony ryzotronu.
Aby podlać glebę, wepchnij końcówki pipet do otworów do podlewania i pozwól, aby woda spływała do gleby grawitacyjnie. Aby wyhodować rośliny, posadź do dwóch sadzonek w ryzotronie i dodaj pięć mililitrów wody bezpośrednio do sadzonek, aby wspomóc ich wzrost. Przykryj górny otwór ryzotronu przez pierwsze dwa dni po posadzeniu przezroczystą folią zatrzymującą wilgoć i zawiń ryzotron w folię aluminiową, aby zapobiec rozwojowi mikrofitów.
Następnie umieść posadzony ryzotron w pomieszczeniu do wzrostu z warunkami środowiskowymi dostosowanymi do konkretnych wymagań rośliny i nachyl ryzotron o 25 do 35 stopni, aby zapewnić rozwój korzeni wzdłuż przedniej płyty poprzez grawitropizm. Aby nałożyć sfabrykowany żel DGT, przytnij membranę poliwęglanową o grubości 10 mikronów z porami o wielkości 0,2 mikrona na szerokość i długość co najmniej jednego centymetra z każdej strony żelu i umieść membranę na żelu. Nałóż wodę, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze stosu i użyj winylowej taśmy elektrycznej, aby przymocować membranę do płytki wzdłuż wszystkich czterech krawędzi żelu.
Po zdjęciu płyty czołowej i folii ochronnych należy ustawić wizjer lustrzanki cyfrowej jednoobiektywowej wyposażonej w obiektyw makro do środka obszaru zainteresowania w żelu i uwzględniając podziałkę na obrazie, uzyskać ortogonalne zdjęcie obszaru zainteresowania. Następnie wyrównaj jedną krawędź płytki wyposażonej w stos membrany żelowej z krawędzią otwartego ryzotronu. Delikatnie zegnij płytkę w kierunku gleby i użyj szyn i, aby przymocować płytkę do ryzotronu.
Po okresie pobierania próbek w samotności przenieś płytkę czołową z ryzotronu do okapu z przepływem laminarnym stroną z membraną żelową skierowaną do góry i ostrożnie usuń taśmę i membranę poliwęglanową pokrywającą żel. Nałóż wodę, aby żel mógł swobodnie unosić się na cienkiej warstwie wody na płytce stroną stykającą się z glebą skierowaną do góry, a następnie przenieś żel na membranę polieterosulfonową o wielkości porów 0,45 mikrona i podparciu bibuły. Po pokryciu stosu żelu folią ochronną, umieść stos w suszarce próżniowej do żelu.
Gdy żel całkowicie wyschnie, użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby przymocować suchy żel wraz z innymi próbkami żelu na szklanej płytce. Aby przeprowadzić analizę liniową spektrometrii mas z indukcyjnie sprzężoną plazmą z ablacją laserową suchych żeli DGT, najpierw przymocuj półfabrykaty próbek i wzorce na stoliku próbki ablacji laserowej i zablokuj stolik laserowy w komórce ablacyjnej systemu ablacji laserowej. W oprogramowaniu do ablacji laserowej przesuń obszar zainteresowania na powierzchni żelu i narysuj pojedynczą linię o długości około jednego mililitra w poprzek powierzchni wzorca żelu.
Kliknij prawym przyciskiem myszy linię w oknie wzorców skanowania, aby sprawdzić, czy parametry ablacji laserowej zostały ustawione i przyjęte, a następnie użyj narzędzia do zduplikowania skanów, aby zduplikować tę linię cztery razy z odległością międzyliniową większą niż średnica plamki. Po powtórzeniu tej linii dla każdej ślepej próby kalibracji wzorca żelu i ślepej próby metody, narysuj pojedynczą linię wzdłuż górnej krawędzi prostokątnego obszaru próbki żelu, która ma być poddana analizie, i zduplikuj linię, aby utworzyć równoległe linie dla całej powierzchni próbki, jak pokazano, stosując odległość międzyliniową od 300 do 400 mikrometrów. Sprawdź, czy każdy punkt początkowy i końcowy każdej linii jest prawidłowo skoncentrowany na powierzchni żelu i kliknij przycisk analizuj partię, aby zainicjować sekwencję próbki na spektrometrze masowym z plazmą sprzężoną indukcyjnie.
Kliknij emisję w oknie energii lasera, aby naładować głowicę lasera. Kliknij przycisk Uruchom, aby otworzyć okno uruchamiania eksperymentu i wybrać tylko wybrane wzorce. Ustaw opóźnienie wymywania na 20 do 30 sekund.
Wybierz pole włączonego lasera podczas skanowania i ustaw czas nagrzewania lasera na 10 sekund. Następnie kliknij uruchom i ok, aby rozpocząć analizę skanowania linii i monitorować intensywność surowego sygnału w liczbach na sekundę dla każdego izotopu na spektrometrze masowym z plazmą sprzężoną indukcyjnie w czasie rzeczywistym. Każda linia powinna zaczynać się i kończyć ślepym półfabrykatem gazu.
Po analizie zaimportuj plik z nieprzetworzonymi danymi dla każdej ablowanej linii do arkusza kalkulacyjnego. Tabela danych surowych przedstawia odczyty spektrometrii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie dla każdego izotopu w liczbach na sekundę oraz odpowiadające im punkty czasowe w sekundach. Wymień wszystkie wiersze obok siebie w różnych kolumnach.
Obliczyć średnią ślepą próbę gazową dla każdego izotopu ze wszystkich wartości ślepej próby gazowej zarejestrowanych przed ablacjami liniowymi i odjąć średnią ślepą próbę gazową od odpowiednich intensywności surowej dla każdego izotopu, aby skorygować sygnał tła. Aby zastosować normalizację wewnętrzną, należy podzielić intensywność sygnału każdego izotopu skorygowanej o ślepą próbę przez skorygowaną intensywność sygnału wzorca wewnętrznego węgla 13 dla każdego punktu danych, aby skorygować zmiany w ilości materiału poddanego ablacji i dryfcie instrumentalnym. Przyciąć dane przed rozpoczęciem i po zakończeniu każdej linii poddanej ablacji, aby usunąć sygnał tła ślepej próby gazowej i przetransponować tabelę danych w celu uzyskania macierzy siatki, w której każdy wiersz odpowiada linii ablowanej, a każda kolumna odpowiada znormalizowanej wartości intensywności izotopów.
Następnie zastosuj funkcję kalibracji uzyskaną z analizy wzorców żelowych i zapisz skalibrowaną matrycę danych jako plik tekstowy. Aby wygenerować obraz, zaimportuj skalibrowaną matrycę danych próbki do oprogramowania do analizy obrazu jako obraz tekstowy i zastosuj współczynnik korekcji proporcji oraz tabelę przeglądową, aby zobrazować gradienty chemiczne na obrazie substancji rozpuszczonej. Dostosuj balans kolorów obrazu, aby kontrolować dolną i górną granicę zakresu wyświetlania, dodaj pasek kalibracji i zapisz obraz substancji rozpuszczonej jako plik TIF.
Użyj polecenia kopiowania do systemu, aby skopiować obraz bryły i wkleić go do oprogramowania do składu komputerowego. Następnie przeskaluj, wyrównaj i skomponuj jednolity obraz ze zdjęciem obszaru zainteresowania i innymi obrazami substancji rozpuszczonej. Wyrównanie obrazów substancji rozpuszczonej z obrazem fotograficznym obszaru zainteresowania ujawnia, że submilimetrowy rozkład strumienia stałego 2D różnych pierwiastków jest bardzo zmienny w zależności od struktury gleby i morfologii korzeni.
Na przykład w tej analizie młodego korzenia gryki uprawianego w glebie bezwęglanowej, nawożonego azotanem amonu, submilimetrowy rozkład substancji rozpuszczonej wykazał strefy zmniejszonego strumienia glinu, fosforu i żelaza wzdłuż starszych odcinków korzeni z powodu pobierania przez korzenie oraz znacznie zwiększone strumienie magnezu, aluminium, fosforu, manganu i żelaza na wierzchołku korzenia spowodowane miejscowymi procesami mobilizacji składników odżywczych. W tej analizie można zaobserwować wyraźny ubytek, kadmu i ołowiu w bezpośrednim miejscu korzeniowym, co ilustruje, że korzenie tolerancyjnego na metale gatunku wierzby Salix smithiana działają jak miejscowy zlew dla labilnych metali śladowych w zanieczyszczonej glebie. W tej analizie rozkład labilnych metali śladowych wzdłuż korzeni Salix smithiana był współzlokalizowany z rozkładem pH, przy użyciu połączonego jednowarstwowego płaskiego żelu wiążącego kationy optodowo-DGT.
Ta kombinacja metod ujawniła, że zwiększone strumienie substancji rozpuszczonych manganu, żelaza, kobaltu, niklu, miedzi i ołowiu wiązały się ze spadkiem pH o około jedną jednostkę, co sugeruje rozpuszczalność metali wywołaną pH. Bardzo ważne jest zapewnienie bliskiego i stabilnego kontaktu między narzędziem DGT a powierzchnią bryły, aby uniknąć artefaktów analitycznych. W razie wątpliwości powtórz procedurę aplikacji żelu.
Metodę tę można łączyć z innymi technikami obrazowania ciał stałych opartymi na dyfuzji, takimi jak optody planarne, w celu jednoczesnej oceny szeregu parametrów związanych z wchłanianiem pierwiastków roślinnych.
Overview
Ten protokół przedstawia schemat postępowania dla podmilimetrowej (sub-mm) 2D wizualizacji wielu laboratorylnych gatunków jonów nieorganicznych i zanieczyszczeń chemicznych, wykorzystując dyfuzyjne gradienty w cienkich warstwach (DGT) połączone z obrazowaniem spektrometrycznym mas. Ta metoda umożliwia ilościowe mapowanie rozpuszczalników w rhizosferze roślin lądowych.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Nauka o Środowisku
- Chemia Gleby
- Fizjologia Roślin
Wprowadzenie
- Biochemiczny cykl krążenia pierwiastków w glebie ma zasadnicze znaczenie dla systemów środowiskowych.
- Zrozumienie dystrybucji frakcji pierwiastków dostępnych dla roślin jest ważne dla zarządzania składnikami odżywczymi.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać rozdzielczości przestrzennej potrzebnej do szczegółowej analizy.
- Ten protokół wykorzystuje obrazowanie spektrometryczne mas DGT w celu zwiększenia wizualizacji.
Cel Badania
- Wizualizacja i kwantyfikacja ultraśladowych poziomów wielu gatunków jonów nieorganicznych na granicy rozpuszczalników.
- Badanie przepływów pracowników i rozpuszczalników w glebach i osadach.
- Badanie, jak korzenie roślin pobierają pierwiastki odżywcze i zanieczyszczenia.
Wykorzystane Metody
- Produkcja żelu DGT z wykorzystaniem żelu łączącego aniony i kationy opartego na poliuretanie.
- Montaż rhizotronu do wzrostu gleby i roślin.
- Nakładanie żelu DGT do pobierania rozpuszczalników.
- Spektrometria mas plazmy indukowanej laserowo do analizy żeli DGT.
Główne Wyniki
- Pomyślne obrazowanie gatunków jonów odżywczych i zanieczyszczeń w 2D.
- Osiągnięto ilościowe mapowanie rozpuszczalników w rhizosferze.
- Zwiększona rozdzielczość przestrzenna w porównaniu z alternatywnymi metodami.
- Wgląd w mechanizmy pobierania składników odżywczych przez korzenie roślin.
Wnioski
- Metoda obrazowania spektrometrycznego mas DGT jest skuteczna w badaniu interakcji gleba-roślina.
- Ten protokół można zastosować do różnych badań środowiskowych.
- Przyszłe badania mogą bazować na tej metodzie dla szerszego zastosowania w chemii gleby.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This method enables sub-millimeter 2D visualization and quantification of labile inorganic nutrients and contaminants in the rhizosphere, providing high-resolution spatial data on solute fluxes at the soil-plant interface. It supports mechanistic de-risking in early discovery by revealing localized nutrient mobilization and trace metal uptake patterns, which can inform target validation for agrochemical or phytoremediation strategies. The quantitative, multi-element imaging capability enhances predictive confidence in modeling plant-environment interactions for translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping labile nutrient and contaminant fluxes in plant-root systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of solute distribution changes associated with root morphology and soil chemistry.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying localized zones of elemental depletion or accumulation linked to plant physiological processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (rhizotrons with DGT gels) for downstream compound screening by establishing baseline solute flux profiles.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal normalization using 13C and external calibration with matrix-matched gel standards.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation through quantitative 2D imaging of multi-element solute fluxes at sub-millimeter resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase rhizosphere imaging to preclinical validation by co-localizing solute fluxes with physiological markers such as pH.
- Mechanistic De-risking: Reveals pH-induced metal solubilization patterns, reducing ambiguity in trace metal uptake mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking root-mediated solute fluxes to environmental contamination or nutrient mobilization phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in soil-plant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing spatial relationships between root morphology and solute fluxes of nutrients and contaminants.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible DGT gel deployment and LA-ICP-MS line-scan imaging for quantitative solute mapping.
- Analytics: Provides normalized, calibrated isotope intensity data enabling cross-condition comparison of labile solute species.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating solute fluxes with environmental parameters like pH, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-element rhizosphere imaging across diverse plant species and soil conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nutrient and contaminant uptake pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sub-millimeter 2D solute flux measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in agrochemical or phytoremediation development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved solute flux data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DGT gel fabrication, rhizotron assembly, and LA-ICP-MS operation.
- Depends on access to laser ablation systems, mass spectrometers, and clean lab environments for gel preparation and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, deployment, and imaging protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations across plant species, soil types, and contaminant profiles to maintain solute flux accuracy.
- Practical limitations include the need for close and stable DGT gel-soil contact to avoid analytical artifacts, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) Gel Fabrication and Rhizotron Preparation
3:06
Plant Cultivation
3:47
Solute Distribution Sampling
4:48
Gel Retrieval and Chemical Analysis Preparation
5:38
Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Line Scan Analysis
7:39
Data Processing and Calibration
9:03
Image Generation
9:48
Results: Representative Sub-mm 2D Solute Flux Distribution of Multiple Nutrients and Contaminants Across Different Soil-Root Interfaces
11:24
Conclusion
