Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Nasz protokół ułatwia formułowanie hydrożeli polimerowo-nanocząsteczkowych do stosowania jako biomateriały. Mamy nadzieję, że naukowcy opracują ten materiał do zastosowań translacyjnych i zgłębienia podstawowych zagadnień biologicznych. Hydrożele PNP są łatwo wstrzykiwane przez igły i cewniki o małej średnicy, ale szybko samoleczą się po wstrzyknięciu.

Pozwala to na nieinwazyjne, kontrolowane dostarczanie leków i komórek przez długi czas. Technologia ta przesuwa granice terapii miejscowej i przedłużonego uwalniania leków, co ma implikacje dla szerokich schorzeń, od raka, przez regenerację tkanek, po bierną immunizację. Aby zsyntetyzować nanocząstki przez nanostrącanie, dodaj 50 miligramów polimeru PEG-PLA do ośmiomililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej i dodaj jeden mililitr acetonitrylu do fiolki.

Wir do całkowitego rozpuszczenia. Następnie dodaj 10 mililitrów ultra czystej wody do 20-mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej z małym mieszadłem i umieść fiolkę na płytce mieszającej ustawionej na 600 obrotów na minutę. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać kroplami jeden mililitr roztworu rozpuszczalnika polimerowego do fiolki z wodą.

Nanocząstki typu rdzeń-powłoka powstaną, gdy roztwór rozpuszczalnika polimerowego zostanie szybko zdyspersjonowany w wodzie. Sprawdź wielkość cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przenieś roztwór nanocząstek do odśrodkowej jednostki filtrującej, aby stężyć roztwór do mniej niż 250 mikrolitrów i ponownie zawiesić nanocząstki w odpowiednim buforze.

Aby przygotować hydrożel, dodaj 333 miligramy 6% roztworu podstawowego HPMC-C12 do jednomililitrowej strzykawki Luer lock i dodaj 500 mikrolitrów 20% roztworu podstawowego nanocząstek i 167 mikrolitrów PBS do ośmiomililitrowej fiolki. Po wymieszaniu za pomocą igły napełnić kolejną mililitrową strzykawkę Luer lock rozcieńczonym roztworem nanocząsteczek i podłączyć obie strzykawki do miksera łokciowego. Mieszać oba roztwory przez około 60 cykli, aż utworzy się jednorodny, nieprzezroczysty biały materiał hydrożelowy.

Aby zmierzyć właściwości reologiczne sformułowanego hydrożelu, należy wstrzyknąć odpowiednią objętość hydrożelu zgodnie z wybraną szczeliną geometryczną do środka ząbkowanej płytki reometru i zastosować testy oscylacyjne i przepływowe w celu zmierzenia właściwości mechanicznych próbki. Aby scharakteryzować uwalnianie leku z hydrożelu, najpierw przygotuj szklane kapilary, używając żywicy epoksydowej do uszczelnienia jednego końca każdej tubki. Gdy żywica epoksydowa stwardnieje, użyj czterocalowej igły podskórnej o rozmiarze 22, aby wstrzyknąć od 100 do 200 mikrolitrów hydrożelu do co najmniej trzech probówek na próbkę i ostrożnie dodaj od 200 do 300 mikrolitrów PBS na każdą objętość hydrożelu.

W odpowiednich punktach czasowych, zgodnie z przewidywaną skalą czasową uwalniania leku, za pomocą igły ostrożnie usuń PBS z każdej kapilary bez naruszania powierzchni hydrożelu i dodaj nową objętość PBS. Po zakończeniu badania należy przeanalizować zebrane podwielokrotności PBS za pomocą odpowiedniej metody, aby określić ilościowo ilość leku uwalnianego w każdym punkcie czasowym. Aby scharakteryzować stabilność termiczną insuliny w kapsułkach żelowych, należy załadować zarówno insulinę, jak i tioflawinę T do hydrożelu, jak pokazano, i użyć igły o rozmiarze 21 do wstrzyknięcia 200 mikrolitrów ładunku i sondy załadowanej hydrożelem do co najmniej trzech dołków czarnej 96-dołkowej płytki na próbkę.

Następnie uszczelnij płytkę optycznie przezroczystą uszczelką samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu i włóż płytkę do czytnika płytek wyposażonego w kontrolę temperatury, potrząsanie i programowanie odczytu kinetycznego. Aby ocenić żywotność komórek w kapsułkach z hydrożelem, użyj igły o rozmiarze 21 do wstrzyknięcia 150 mikrolitrów hydrożelu zawierającego odpowiednie stężenie komórek do każdej z trzech studzienek na próbkę na przezroczystej płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem i dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki komórkowej do każdej objętości hydrożelu. W pierwszym dniu hodowli zastąpić supernatant na każdym hydrożelu w odpowiednim punkcie czasowym dla każdej grupy próbek 50 mikrolitrami dwumilimolowego roztworu kalceiny AM.

Po 30 minutach inkubacji zobrazuj środek każdej studzienki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby ocenić zdolność zamkniętych komórek do osadzania się w strzykawce przed wstrzyknięciem, należy rozcieńczyć interesujące komórki do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr w stężeniu PBS i wybarwić komórki 50 mikrolitrami dwumilimolowej kalceiny AM przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wymieszać komórki z 500 do 700 mikrolitrami hydrożelu, jak pokazano, i użyć igły o rozmiarze 21, aby wstrzyknąć od 100 do 200 mikrolitrów komórki zawierającej hydrożel na dno co najmniej jednej kuwety na próbkę.

Następnie zobrazuj kuwety leżące płasko na boku na stoliku mikroskopu konfokalnego natychmiast po wstrzyknięciu oraz po jednej i czterech godzinach po wysianiu, aby zaobserwować, czy komórki osiadły w hydrożelu, czy też pozostały zawieszone. Zdolność żelu do rozrzedzania i samonaprawy przy ścinaniu można zaobserwować odpowiednio za pomocą protokołów zamiatania przepływu i ścinania krokowego. Charakterystyka modułów magazynowania i strat za pomocą eksperymentu oscylacyjnego przemiatania częstotliwości ścinania w liniowym reżimie lepkosprężystym w zakresach częstotliwości od 0,1 do 100 radianów na sekundę ujawnia właściwości podobne do ciała stałego.

Zazwyczaj nie powinno dochodzić do krzyżowania modułów magazynowania i strat ścinania obserwowanych przy niskich częstotliwościach w przypadku sztywniejszych preparatów, podczas gdy w przypadku słabszych preparatów hydrożelowych można spodziewać się zdarzeń krzyżowania. Zróżnicowanie zawartości polimerów w hydrożelach PNP może mieć bezpośredni wpływ na dyfuzję ładunku przez sieć polimerową i szybkość uwalniania z materiałów. Hydrożele PNP mogą również stabilizować ładunek, który jest podatny na niestabilność termiczną, znacznie wydłużając okres przydatności do spożycia i zmniejszając zależność od przechowywania i dystrybucji w łańcuchu chłodniczym.

Włączenie motywów integrynowych może być przydatne w adaptacji hydrożeli PNP do terapii komórkowych. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być znakowane fluorescencyjnie, aby ułatwić ich wizualizację i kwantyfikację. Na przykład preparaty pozbawione miejsc adhezji będą miały niską żywotność komórek, ponieważ komórki otorbione nie proliferują w porównaniu z komórkami zamkniętymi w kapsułkach i preparatami z motywami adhezyjnymi, takimi jak RGD.

Wciąż badamy, w jaki sposób zmiany w recepturze wpływają na charakterystykę reologiczną i siatkę dynamiczną matrycy polimerowej. Używamy również FRAP do badania dyfuzji cząsteczek w hydrożelu. Materiały te mogą być wykorzystane do zadawania nowych biologicznych pytań o to, jak długotrwałe dostarczanie może wpływać na dostarczanie leków, opracowywanie szczepionek lub immunoterapię nowotworów.