Name: Formulacja dwublokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metodę nanoprecypitacji do syntezy dwublokowych nanocząstek polimerowych PLGA-PEG. Technika ta umożliwia enkapsulację leków przeciwnowotworowych o słabej rozpuszczalności, poprawiając ich biodostępność w terapii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Golfers Against Cancer, grant pilotażowy Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University Cancer Research Fund oraz National Health Institute K-12 Career Development Award.

1. Synteza polimeru PLGA-b-PEG
<ol>
 <li>Kopolimer poli(D,L-laktydu-ko-glikolidu) (PLGA) z końcowymi grupami karboksylowymi (PLGA-karboksylan) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku do PLGA (wymienionym w sekcji materiałów) do stężenia 5mM. PLGA można rozpuścić przy tym stężeniu poprzez delikatne mieszanie.</li>
 <li>Zarówno NHS (masa cząsteczkowa 115,09), jak i EDC (masa cząsteczkowa 191,7) rozpuszcza się w roztworze PLGA do stężenia 25mM. (Zarówno EDC, jak i NHS są dodawane w nadmiarze stechiometrycznym 5-krotnym w stosunku do PLGA). PLGA-karboksylan przekształca się w PLGA-NHS poprzez dodanie EDC i NHS do roztworu PLGA-karboksylanu i delikatne mieszanie przez około 1 godzinę.</li>
 <li>Produkt reakcji PLGA-NHS wytrąca się poprzez dodanie metanolu jako roztworu piorącego. Do roztworu dodaje się około 10-krotną nadwyżkę objętościową metanolu. Roztwór wiruje się przy 2000 x g, aby wytrącić PLGA-NHS, a następnie odrzuca nadsącz (usuwa to śladowe ilości EDC i NHS). Procedurę płukania metanolem powtarza się co najmniej trzy razy.</li>
 <li>Osad PLGA-NHS suszy się w próżni przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu piorącego.</li>
 <li>Osad PLGA-NHS rozpuszcza się ponownie w tym samym rozpuszczalniku i w tym samym stężeniu, które zostało użyte początkowo do rozpuszczenia PLGA. Następnie do roztworu PLGA dodaje się heterobifunkcyjny PEG (amina-PEG-karboksylan) w stężeniu 5mM (stosunek stechiometryczny 1:1). Mieszaninę inkubuje się przez 24 godziny przy ciągłym mieszaniu.</li>
 <li>Po 24 godzinach produkt reakcji, kopolimer blokowy PLGA-b-PEG, wytrąca się poprzez dodanie nadmiaru metanolu jako roztworu piorącego. Proces płukania i wirowania powtarza się trzy razy, zgodnie z opisem powyżej. Usunie to cały nadmiar nieprzereagowanego PEG.</li>
 <li>Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG suszy się w próżni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie nanocząsteczek PLGA-b-PEG
Nanocząstki z rdzeniem z PLGA pokrytym PEG na powierzchni mogą zostać przygotowane przy użyciu tych kopolimerów diblokowych. W takich nanocząstkach można enkapsulować różnorodne leki hydrofobowe. Związki fluorescencyjne mogą być enkapsulowane w nanocząstkach lub konjugowane z PLGA, dzięki czemu nanocząstki te mogą być wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego.
Metoda nanowytrącania jest stosowana do wytwarzania nanocząstek, szczególnie w przypadkach, gdy substancja przeznaczona do enkapsulacji ma charakter silnie hydrofobowy.
<ol>
 <li>Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG oraz lek/ładunek (do enkapsulacji) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku rozpuszczającym PLGA. PLGA można rozpuścić w wielu powszechnie stosowanych rozpuszczalnikach, w tym w acetonitrylu, DCM, tetrahydrofuranie, acetonie lub octanie etylu. Wybór rozpuszczalnika jest krytyczny, ponieważ wpływa on na właściwości nanocząsteczek. W związku z tym na tym etapie należy zastosować odpowiedni rozpuszczalnik.</li>
 <li>Mieszaninę polimeru i leku dodaje się następnie kroplami do 3-5 objętości mieszanej wody, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru wynoszące około 3 mg/mL. (Ryc. 2)</li>
 <li>Mieszanie kontynuuje się przez 2 godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić formowanie się nanocząsteczek poprzez samoorganizację i usunąć ślady rozpuszczalnika organicznego.</li>
 <li>Zbiór i oczyszczanie: Nanocząsteczki są następnie zagęszczane poprzez wirowanie przy 2,700xg przez 10 min przy użyciu filtra Amicon (MWCO 20KDa), przemywane i zawieszane ponownie w PBS. Pozwala to na usunięcie całego nieuwięzionego leku/ładunku. W celu lepszego zrozumienia właściwości nanocząsteczek można przeprowadzić podstawowe charakterystyki biofizyczne, takie jak pomiar wielkości, ładunku powierzchniowego i wydajności ładowania leku.</li>
</ol>
3. Przechowywanie
Liofilizacja jest powszechnie stosowaną metodą przechowywania nanocząsteczek11. Liofilizacja pozwala zachować właściwości fizyczne i chemiczne nanocząsteczek, zapewniając ich długoterminową stabilność12. Proces liofilizacji może wywoływać stres w cząstkach i destabilizować formulację, dlatego powszechnie stosuje się krioprotektanty (ochrona przed stresem mrozowym) oraz lio protegeranty (ochrona przed stresem suszenia). Wybór tych substancji ochronnych jest determinowany przez pożądany czas przechowywania13.
<ol>
 <li>W procesie liofilizacji następuje całkowite zestalenie próbki poprzez zamrożenie jej poniżej temperatury Tg.</li>
 <li>W etapie suszenia lód jest usuwany poprzez sublimację. Temperaturę i ciśnienie należy zoptymalizować, aby zapewnić efektywny przebieg procesu liofilizacji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Charakterystyka diblokowego kopolimeru PLGA-b-PEG
Do potwierdzenia pomyślnej koniugacji polimerów można wykorzystać różne techniki. Skład PLGA-b-PEG można scharakteryzować za pomocą 400 MHz 1H magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Masę cząsteczkową otrzymanego produktu (PLGA-b-PEG) można zweryfikować za pomocą chromatografii żelowej (GPC). Krzywa rozkładu masy cząsteczkowej oraz czas elucji dla PLGA-b-PEG powinny różnić się od wartości dla samego PLGA i PEG. Wspólnie techniki te powinny pozwolić na charakterystykę otrzymanego produktu i określenie, czy reakcja koniugacji przebiegła pomyślnie.
Charakterystyka nanocząsteczek PLGA-b-PEG
Wielkość cząstek oraz rozkład wielkości można zmierzyć za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Różne parametry procesu nanoprecypitacji wpływają na wielkość cząstek. Masa cząsteczkowa polimerów użytych na początku (zarówno PLGA, jak i PEG) również wpływa na rozkład wielkości cząstek. Do potwierdzenia rozkładu wielkości i struktury nanocząstek, jak pokazano na rysunku 3, można zastosować transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Zakres wielkości cząstek mieści się zazwyczaj w skali nm. Duża wielkość cząstek przy nierównomiernym rozkładzie może wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na konieczność optymalizacji metody nanoprecypitacji. Dodatkowo, potencjał zeta powierzchni można zmierzyć urządzeniem ZetaPALS. 
Wydajność załadunku leku/ładunku można określić za pomocą standardowej metody HPLC.
Cząstki rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, a następnie można przeprowadzić analizę HPLC w celu pomiaru absorbancji leku/ładunku (Ryc. 4). Można przeprowadzić badanie kinetyki uwalniania leku, w którym znane, stałe ilości nanocząstek poddaje się dializie w jednostkach dializacyjnych 30 Slide-A-Lyzer MINI. W ustalonych odstępach czasu pobiera się zawartość jednostki dializacyjnej i dodaje równą objętość rozpuszczalnika organicznego, aby rozpuścić nanocząstki. Próbki te poddaje się analizie HPLC w celu określenia ilości zawartości leku/ładunku.
<img alt="Schemat reakcji chemicznej, tworzenie wiązania amidowego EDC/NHS, mechanizm sprzęgania peptydów, proces syntezy." src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Chemia EDC/NHS
<img alt="Schemat nanoprecypitacji; mieszanie fazy organicznej z fazą wodną w procesie enkapsulacji." src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Metoda nanoprecypitacji do otrzymywania polimerowych nanocząsteczek. Organiczny roztwór rozpuszczalnika (acetonitrylu lub DCM) zawierający diblok PEG-PLGA oraz lek lub ładunek do wprowadzenia do cząsteczki jest dodawany kroplowo do 3-5 mL mieszanej H2O.
<img alt="Rozkład nanocząstek, obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego, analiza strukturalna, badanie z zakresu nauki o materiałach." src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nanocząstek. Obraz TEM nanocząstek PEG-PLGA zawierających wortaminę. Jako czynnik kontrastowy zastosowano kwas fosfotungstowy.
<img alt="Wykres kinetyki uwalniania paklitakselu; porównanie nanocząsteczek, analiza danych, badania nad dostarczaniem leków." src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Kontrolowane uwalnianie leku z nanocząsteczki. Uwalnianie Paclitaxel z nanocząsteczek po dializie w PBS. W określonych punktach czasowych cząsteczki usuwano z kaset dializacyjnych i rozpuszczano w acetonitrylu. Roztwór analizowano metodą HPLC. Porównano dwie oddzielne serie nanocząsteczek.

<ol><li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li>
<li>Bulte, J. W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBulte%2C+JWM+%22Nanoparticles+in+Biomedical+Imaging%22">Nanoparticles in Biomedical Imaging</a>. 3, (2008).</li>
<li>Omid, C., Farokhzad, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Nanotechnology+on+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+NANO%22%5BJournal%5D)">Impact of Nanotechnology on Drug Delivery.</a> ACS NANO. 3, 16-20 (2009).</li>
<li>Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+PLGA+nanoparticles+as+protein+carriers%3A+synthesis%2C+preparation+and+biodistribution+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats.</a> Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+techniques%22">Bioconjugate techniques</a>. , 2nd Edition, (2008).</li>
<li>Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+block+copolymers+as+injectable+drug-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems.</a> Nature. 388, 860-862 (1997).</li>
<li>Yoo, H. S., Park, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+targeted+biodegradable+polymeric+doxorubicin+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles.</a> Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).</li>
<li>Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+Functionalized+PLGA-PEG+Nanoparticles+for+In+Vivo+Targeted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery.</a> Biomaterials. 28, 869-876 (2007).</li>
<li>Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+engineering+of+targeted+nanoparticles+by+using+self-assembled+biointegrated+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).</li>
<li>Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Biocompatible+Nanoparticles+for+the+Delivery+of+%28-%29-Epigallocatechin+3-Gallate+to+Prostate+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells.</a> J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).</li>
<li>Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-drying+of+nanoparticles%3A+Formulation%2C+process+and+storage+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).</li>
<li>Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterisation+of+PLGA+nanoparticles+after+freeze-drying+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).</li>
<li>Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectants+for+Freeze+Drying+of+Drug+Nano-Suspensions%3A+Effect+of+Freezing+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).</li>
<li>Wang, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+targeted+nanoparticles+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications.</a> Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).</li>
<li>Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+release+from+biodegradable+injectable+thermosensitive+hydrogel+of+PEG-PLGA-PEG+triblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers.</a> J. Control Release. 63, 155-163 (2000).</li>
<li>Gref, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+long-circulating+polymeric+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres.</a> Science. 263, 1600-1603 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda nanoprecypitacji z użyciem kopolimerów diblokowych stanowi prosty i szybki sposób inżynierii polimerowych nanocząsteczek. Powstałe nanocząsteczki składają się z hydrofobowego rdzenia, który może być wykorzystany do dostarczania związków słabo rozpuszczalnych. Powierzchniowa warstwa hydrofilowa zapewnia doskonałą rozpuszczalność w wodzie, stanowiąc jednocześnie miejsce do potencjalnej dalszej koniugacji z ligandem celującym.
Istnieje wiele platform nanocząsteczkowych, w tym liposomy, nan...

<table><tbody><tr><td>EDC</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td>Odczynnik do sprzęgania</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td>Odczynnik do sprzęgania</td></tr><tr><td>amine-PEG-carboxylate</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>Nh2-PEG-CM-5000</td><td>Polimer (Można użyć dowolnej masy cząsteczkowej PEG, tutaj wymieniono 5000)</td></tr><tr><td>PLGA-carbxylate</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6013-2</td><td>Polimer</td></tr><tr><td>Dichloromethane (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Acetonitrile &amp;gt;99% purity</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Methanol &amp;gt;99% purity</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Roztwór do płukania</td></tr></tbody></table>

formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnologia jest stosunkowo nową gałęzią nauki, która polega na wykorzystaniu unikalnych właściwości cząstek o rozmiarach nanometrycznych (nanocząstek). Nanocząstki mogą być projektowane w precyzyjny sposób, tak aby ich rozmiar, skład i chemia powierzchni były starannie kontrolowane. Umożliwia to niespotykaną dotąd swobodę w modyfikowaniu niektórych podstawowych właściwości ich ładunku, takich jak rozpuszczalność, dyfuzyjność, biodystrybucja, charakterystyka uwalniania oraz immunogenność. Od momentu ich powstania nanocząstki są wykorzystywane w wielu obszarach nauki i medycyny, w tym w dostarczaniu leków, obrazowaniu i biologii komórki1-4. Jednak ze względu na postrzegane bariery techniczne nie zostały one w pełni wykorzystane poza „laboratoriami nanotechnologicznymi”. W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę syntezy platformy nanocząstek opartych na polimerach, która znajduje szerokie spektrum potencjalnych zastosowań.
Pierwszym krokiem jest synteza kopolimeru diblokowego posiadającego zarówno domenę hydrofobową, jak i domenę hydrofilową. Wykorzystując PLGA i PEG jako polimery modelowe, opisaliśmy reakcję sprzęgania z zastosowaniem chemii EDC/NHS5 (Rys. 1). Omówiono również proces oczyszczania polimeru. Zsyntetyzowany kopolimer diblokowy może samoorganizować się w nanocząstki w procesie nanoprecypitacji poprzez oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe.
Opisane nanocząsteczki polimerowe są bardzo wszechstronne. Hydrofobowy rdzeń nanocząsteczki może być wykorzystywany do przenoszenia słabo rozpuszczalnych leków w eksperymentach z dostarczania leków6. Ponadto nanocząsteczki mogą rozwiązać problem toksycznych rozpuszczalników w przypadku słabo rozpuszczalnych odczynników biologii molekularnej, takich jak wortmannina, która wymaga rozpuszczalnika w postaci DMSO. Jednak DMSO może być toksyczny dla komórek i zakłócać przebieg eksperymentu. Te słabo rozpuszczalne leki i odczynniki mogą być skutecznie dostarczane za pomocą nanocząsteczek polimerowych przy minimalnej toksyczności. Nanocząsteczki polimerowe mogą być również ładowane barwnikami fluorescencyjnymi i wykorzystywane do badań nad transportem wewnątrzkomórkowym. Wreszcie nanocząsteczki polimerowe te mogą być koniugowane z ligandami celującymi poprzez powierzchniowy PEG. Takie nanocząsteczki celowane mogą być wykorzystywane do znakowania specyficznych epitopów na powierzchni lub wewnątrz komórek7-10.

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Nanotechnologia jest stosunkowo nową dziedziną nauki, która polega na wykorzystywaniu unikalnych właściwości cząsteczek o skali nanometrycznej ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza polimerycznych nanocząstek przy użyciu metody nanoprecypitacji. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności reakcji E-D-C-N-H-S w celu otrzymania kopolimeru A-P-L-G-A PEG. Następnie kopolimer PLGA PEG jest wykorzystywany do wytworzenia nanocząstek, w których za pomocą nanoprecypitacji zostaje zamknięty odpowiedni lek lub ładunek.Na tym etapie można przeprowadzić podstawową charakterystykę biofizyczną, obejmującą rozmiar, ładunek powierzchniowy oraz wydajność ładowania leku, wykorzystując dynamiczne rozpraszanie światła, transmisyjną mikroskopię elektronową lub HPLC. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię nowotworów, ponieważ nanocząsteczki mogą dostarczać słabo rozpuszczalne leki przeciwnowotworowe, co może okazać się bardziej skuteczne niż obecne metody leczenia. Metoda ta może zatem dostarczyć cennych informacji w zakresie leczenia raka.Może być również wykorzystywany do badania innych układów, takich jak transport wewnątrzkomórkowy. Nanocząstki mogą zostać sprzężone z ligandem celującym i zwizualizowane in vivo lub in vitro przy użyciu czynnika obrazującego, co demonstruje tę technikę. Dzisiaj w badaniu wezmą udział dwaj technicy z naszego laboratorium, Rohit Sukumar i Natalie Cummings. Aby rozpocząć syntezę kopolimeru PLGA PEG, należy rozpuścić karboksylowany PLGA w acetonitrylu w stężeniu 5 mM przy łagodnym mieszaniu.Następnie dodaj odpowiednią ilość NHS i EDC, aby uzyskać stężenia 25 millimolar, zapewniając pięciokrotną nadwyżkę stechiometryczną w stosunku do PLGA; delikatnie mieszaj roztwór przez około jedną godzinę, aby umożliwić konwersję grupy karboksylowej PLGA do PGA NHS. Po godzinie wytrąc produkt reakcji PGA NHS, dodając roztwór płuczący – metanol w objętości około 10 razy większej niż objętość roztworu; odwiruj roztwór przy 2000 ×g, aby uzyskać osad P-L-G-A-N-H-S. Po wirowaniu odlej nadsącz, aby usunąć ślady EDC i NHS. Tę procedurę płukania metanolem powtórz co najmniej trzy razy.Po zakończeniu płukania wysuszyć P-L-G-A-N-H-S w próżni przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu płuczącego. Następnie ponownie rozpuścić pellet P-L-G-A-N-H-S w aceto NI trial w tym samym stężeniu, którego początkowo użyto do rozpuszczenia PLGA.Po rozpuszczeniu dodać heterobifunkcyjny PEG do roztworu PLGA. Zastosować stężenie 5 mM.Inkubować roztwór mieszaniny przez 24 godziny przy stałym mieszaniu. Wytrącić produkt reakcji blokowego kopolimeru PLGA PEG poprzez dodanie nadmiaru metanolu. Przeprowadzić proces płukania i wirowania dodatkowo trzy razy, aby usunąć cały nadmiar nieprzereagowanego peg.W ostatnim etapie syntezy należy wysuszyć kopolimer blokowy PLGA PEG pod próżnią. Wytrącanie nanocząstek rozpoczyna się od rozpuszczenia kopolimeru blokowego PLGA PEG oraz leku przeznaczonego do enkapsulacji w rozpuszczalniku A-P-L-G-A. Wybór rozpuszczalnika jest krytyczny, ponieważ wpływa on na właściwości nanocząstki. Następnie mieszaninę polimeru z lekiem dodaje się kroplami do trzech do 10 objętości mieszanej wody, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru na poziomie około 3 mg/mL. Kroplami.Dodanie roztworu organicznego do fazy wodnej ma kluczowe znaczenie dla uformowania nanocząsteczek o odpowiednim rozmiarze. Kontynuuj mieszanie przez dwie godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić formowanie nanocząsteczek poprzez samozgromadzenie i usunąć ślady rozpuszczalnika organicznego. Po dwóch godzinach mieszania.Skoncentrować nanocząstki poprzez wirowanie przy 2 700 ×g przez 10 minut, używając filtra Amon. Następnie przemyć nanocząstki buforem PBS, aby usunąć lek, który nie został zamknięty w cząstkach, a następnie ponownie poddać je wirowaniu. Na koniec resuspendować nanocząstki w buforze PBS.W celu lepszego zrozumienia właściwości nanocząsteczek można przeprowadzić podstawową charakterystykę biofizyczną, obejmującą pomiar wielkości, ładunku powierzchniowego oraz wydajności załadunku leku. Nanocząsteczki można przechowywać zgodnie z opisem w protokole pisemnym; aby scharakteryzować nanocząsteczki PLGA PEG, w celu potwierdzenia ich wielkości, rozkładu i struktury zastosowano transmisyjną mikroskopię elektronową. Wielkość cząstek mieści się zazwyczaj w zakresie nanometrów.Duże rozmiary cząstek przy nierównomiernym rozkładzie wielkości mogą wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na konieczność optymalizacji metody nanoprecypitacji. Przedstawiono tutaj badanie kinetyki uwalniania leku, w którym wydajność załadunku oraz uwalnianie paklitakselu ilościowo określono za pomocą standardowej metody HPLC. Znane, stałe ilości nanocząsteczek poddawano dializie w stałych odstępach czasu.Zawartość jednostki dializacyjnej została zebrana, a następnie dodano równą objętość rozpuszczalnika organicznego w celu rozpuszczenia nanocząsteczek. Następnie w tych próbkach przeprowadzono analizę HPLC. Aby określić zawartość Paclitaxelu, po opanowaniu tej techniki nanowytrącania, można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu trzech godzin.Pamiętaj, aby podczas wykonywania tej techniki zawsze powoli dodawać fazę organiczną do fazy wodnej, co zapobiegnie powstawaniu dużych cząstek po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę badaczom nowotworów w dziedzinie nanomedycyny do zbadania możliwości zastosowania leków słabo rozpuszczalnych, które wcześniej uznawano za zbyt toksyczne dla pacjentów onkologicznych po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na pytania, takie jak to, czy leki słabo rozpuszczalne są skuteczne, gdy toksyczność systemowa nie stanowi już problemu, lub czy ligandy kierujące właściwie dostarczają nanocząsteczki do miejsca docelowego, można przeprowadzić inne metody, takie jak badania skuteczności in vivo lub badania obrazowe.

formulation-diblock-polymeric-nanoparticles-through-nanoprecipitation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Formularyzowanie nanocząstek polimerowych diblockowych za pomocą techniki nanokrystalizacji

Ten artykuł opisuje przygotowanie dobrze uporządkowanych nanopianek niklowych poprzez bezprądowe osadzanie metalu na nanoporowatych szablonach uzyskanych z samodzielnie składających się supramolekuł na bazie kopolimeru diblokowego.

Żyroidalne nanostruktury niklowe z supramolekuł kopolimeru dibloku

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Ten artykuł opisuje proces wytwarzania polimerowych, samoorganizujących się nanocząstek za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego. Wykorzystanie niskoenergetycznego światła widzialnego do kontrolowania polimeryzacji pozwala na powtarzalne tworzenie samoorganizujących się miceli przypominających robaki przy wysokiej zawartości części stałych.

Łatwa synteza robakopodobnych miceli za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego przy użyciu katalizatora fotoredoks

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Samoorganizacja sterowana krystalizacją (CDSA) wykazuje unikalną zdolność do wytwarzania cylindrycznych nanostruktur o wąskich rozkładach długości. Wykazano organokatalizowaną polimeryzację ε-kaprolaktonu z otwarciem pierścienia oraz późniejsze wydłużenia łańcuchów metakrylanu metylu i N,N-dimetyloakrylamidu. Przedstawiono żywy protokół CDSA, który wytwarza cylindry monodyspersyjne o długości do 500 nm.

Synteza monodyspersyjnych cylindrycznych nanocząstek poprzez samoorganizację biodegradowalnych kopolimerów blokowych sterowaną krystalizacją

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Dwa sąsiadujące ze sobą płyny przechodzące przez rowkowany kanał mikroprzepływowy mogą być skierowane tak, aby tworzyły osłonę wokół rdzenia prepolimerowego; określając w ten sposób zarówno kształt, jak i przekrój. Polimeryzacja inicjowana foto, taka jak chemia tiolowa, doskonale nadaje się do szybkiego zestalania płynu rdzeniowego w mikrofibrę o określonym rozmiarze i kształcie.

Mikroprzepływowa produkcja włókien polimerowych i biohybrydowych o wstępnie zaprojektowanym rozmiarze i kształcie

Poznaj metodę nanoprecypitacji do syntezy dwublokowych nanocząstek polimerowych PLGA-PEG. Technika ta umożliwia enkapsulację leków przeciwnowotworowych o słabej rozpuszczalności, poprawiając ich biodostępność w terapii nowotworowej.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Przeglądaj więcej filmów