Formulacja dwublokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Ogólnym celem tej procedury jest synteza nanocząstek polimerowych przy użyciu metody nanostrącania. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie najpierw reakcji E-D-C-N-H-S w celu wytworzenia kopolimeru A-P-L-G-A PEG. Kopolimer PLGA PEG jest następnie wykorzystywany do generowania nanocząstek, otaczających lek lub ładunek będący przedmiotem zainteresowania poprzez nanowytrącanie.

W tym momencie podstawowa charakterystyka biofizyczna, w tym rozmiar, ładunek powierzchniowy i wydajność ładowania leku, może być przeprowadzona za pomocą dynamicznej mikroskopii elektronowej z transmisyjnym rozpraszaniem światła lub HPLC. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nowotworów, ponieważ nanocząstki mogą dostarczać słabo rozpuszczalne terapie przeciwnowotworowe, które mogą być bardziej skuteczne niż obecne metody leczenia. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w leczenie raka.

Może być również używany do badania innych systemów, takich jak handel komórkowy. Nanocząstki mogą być sprzężone z ligandem celującym i wizualizowane in vivo lub in vi in vitro za pomocą środka do obrazowania demonstrującego tę technikę. Dzisiaj będzie dwóch techników z naszego laboratorium, Rohit Sukumar i Natalie Cummings, Aby rozpocząć syntezę kopolimeru PLGA PEG, rozpuść PLGA, karboksylan w acetonitrylu w stężeniu pięciu milimolowców z delikatnym mieszaniem.

Następnie dodaj wystarczającą ilość NHS i EDC, aby uzyskać stężenie 25 milimolowe, zapewniając pięciokrotny nadmiar metryczny storia w porównaniu z PLGA, delikatnie mieszaj roztwór przez około godzinę, aby umożliwić przekształcenie karboksylanu PLGA w PGA NHS. Po jednej godzinie wytrącić produkt reakcji PGA NHS, dodając roztwór myjący metanol o objętości około 10 razy objętościowej, nadmiar metanolu do roztworu odwirować roztwór o stężeniu 2000 razy G do osadu, P-L-G-A-N-H-S po odwirowaniu wyrzucić natynkę SUP w celu usunięcia śladów EDC i NHS. Ta procedura mycia metanolem jest powtarzana co najmniej trzy razy.

Po zakończeniu prania. Wysuszyć P-L-G-A-N-H-S pod odkurzaczem przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu myjącego. Teraz na czerwono rozpuść pastylkę P-L-G-A-N-H-S w próbie aceto NI w tym samym stężeniu, które zostało pierwotnie użyte do rozpuszczenia PLGA.

Po rozpuszczeniu. Dodaj hetero bifunkcyjny PEG do rozwiązania PLGA. Dodać stężenie pięciu milimolów.

Inkubować roztwór mieszaniny przez 24 godziny, ciągle mieszając po 24 godzinach. Wytrącić produkt reakcji kopolimeru blokowego PLGA PEG, dodając w nadmiarze metanol. Wykonaj proces mycia i wirowania oraz dodatkowe trzy razy, aby usunąć nadmiar niereaktywnego kołka.

Ostatnim etapem syntezy jest suszenie kopolimeru blokowego PLGA PEG w próżni w postaci nanocząstek, wytrącanie rozpoczyna się od rozpuszczenia kopolimeru blokowego PLGA PEG i leku, który ma być kapsułkowany w rozpuszczalniku A-P-L-G-A. Wybór rozpuszczalnika ma kluczowe znaczenie, ponieważ wpływa na właściwości nanocząstki. Następnie dodaj mieszaninę leków polimerowych, kroplami do trzech do 10 objętości mieszającej wody, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru około trzech miligramów na mililitr. Kroplowo.

Dodanie roztworu organicznego do fazy wodnej ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia nanocząstek o odpowiedniej wielkości. Kontynuuj mieszanie przez dwie godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić utworzenie się nanocząstek w wyniku samoorganizacji i usunąć ślady rozpuszczalnika organicznego. Po dwóch godzinach mieszania.

Zagęścić nanocząstki przez odwirowanie w temperaturze 2 700 razy G przez 10 minut przy użyciu filtra Amon. Następnie przemyj nanocząstki PBS, aby usunąć wszelkie nieuwięzione narkotyki, a następnie odwiruj. Na koniec rozpuść nanocząstki w PBS W tym momencie.

Podstawowa charakterystyka biofizyczna, w tym rozmiar, ładunek powierzchniowy i wydajność ładowania leku, może być przeprowadzona w celu lepszego zrozumienia właściwości nanocząstek. Nanocząstki mogą być przechowywane zgodnie z opisem w pisemnym protokole w celu scharakteryzowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej nanocząstek PLGA PEG w celu potwierdzenia rozmiaru, rozmieszczenia i struktury nanocząstek. Wielkość cząstek mieści się na ogół w zakresie nanometrów.

Duże rozmiary cząstek o nierównomiernym rozkładzie wielkości mogą wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na to, że metoda nanostrącania wymaga optymalizacji. Pokazano tutaj badanie kinetyczne uwalniania leku, w którym wydajność ładowania i uwalniania paklitakselu określono ilościowo za pomocą standardowej HPLC. Znane stałe ilości nanocząstek były dializowane w ustalonych odstępach czasu.

Pobrano zawartość w jednostce dializy i dodano równą objętość rozpuszczalnika organicznego w celu rozpuszczenia nanocząstek. Następnie przeprowadzono HPLC na tych próbkach. Aby określić ilościowo zawartość paklitakselu, po opanowaniu, tę technikę nano wytrącania można prawidłowo wykonać w ciągu trzech godzin.

Pamiętaj, wykonując tę technikę, aby zawsze powoli dodawać fazę organiczną do fazy wodnej, aby zapobiec powstawaniu dużych cząstek po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nowotworami w dziedzinie nanomedycyny do zbadania możliwości stosowania słabo rozpuszczalnych leków, które kiedyś uważano za zbyt toksyczne u pacjentów z rakiem po tej procedurze. Inne metody, takie jak badania skuteczności in vivo lub badania obrazowe, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na pytania, takie jak to, czy słabo rozpuszczalne leki są skuteczne, gdy toksyczność ogólnoustrojowa nie stanowi już problemu, lub czy celowanie w ligandy jest prawidłowo ukierunkowane na nanocząstki do ich miejsca przeznaczenia.