Rejestracja szybkości wypalania węzłów zatokowo-przedsionkowych za pomocą matrycy mikroelektrod w celu identyfikacji wewnętrznych wad rozrusznika serca u myszy
July 5th, 2021
Ten protokół ma na celu opisanie nowej metodologii pomiaru wewnętrznej szybkości wypalania serca za pomocą rejestracji matrycy mikroelektrod całej tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego w celu identyfikacji wad rozrusznika serca u myszy. W tej metodzie można również wprowadzić środki farmakologiczne, aby zbadać ich wpływ na wewnętrzne rozruszniki serca.
Pomiar wewnętrznego tętna jest ważnym wskaźnikiem zdrowia serca. Ta technika dokładnie mierzy ten wskaźnik, wykluczając większość zakłócających wpływów na węzeł zatokowo-przedsionkowy. Zapis MEA wewnętrznego tętna rejestruje dokładne dane dotyczące szybkości wypalania, podobnie jak zapisy jednokomórkowe bez intensywnego szkolenia elektrofizjologicznego.
Osoby korzystające z tej techniki mogą mieć trudności z uzyskaniem zdrowych preparatów tkankowych we wczesnych eksperymentach, więc przećwicz sekcję i zoptymalizuj i ustawienia zbierania danych przed rozpoczęciem właściwego zbierania danych. Procedurę zademonstrują doktorzy Man Si i Praveen Kumar, doktoranci z moim laboratorium. Zacznij od przytrzymania skóry myszy poddanej eutanazji hemostatem i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poprzeczne nacięcie w skórze tuż pod dnem klatki piersiowej od lewego łuku żebrowego do prawego łuku żebrowego.
Użyj nożyczek chirurgicznych, aby rozciąć otrzewną i ostrożnie oddziel wątrobę od przepony bez nacinania wątroby, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu. Naciąć przeponę wzdłuż klatki piersiowej, aby odsłonić jamę piersiową. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć boczne ściany klatki piersiowej od krawędzi łuków żebrowych aż do obojczyków, aby odsłonić serce, a następnie użyj igły strzykawkowej o rozmiarze 23, aby przypiąć klatkę piersiową do ramienia.
Za pomocą pipety transferowej upuścić ciepły heparynizowany kompletny roztwór Tyrode'a na serce, aby było wilgotne. Przytrzymaj płuca bardzo cienkimi kleszczami Graefe i odetnij tchawicę nożyczkami chirurgicznymi, aby usunąć płuca. Aby usunąć serce, przytrzymaj wierzchołek serca bardzo cienkimi kleszczami Graefe i przetnij aortę i żyłę główną dolną nożyczkami chirurgicznymi.
Przenieść serce na szalkę Petriego zawierającą utwardzony elastomer silikonowy i użyć pipety do przenoszenia do kąpieli serca w dwóch do trzech mililitrach ciepłego heparynizowanego kompletnego roztworu Tyrode. Przymocuj wierzchołek serca do naczynia za pomocą szpilki do rozwarstwienia. Przytrzymaj żyłę główną dolną za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont 2.
Włóż igłę strzykawki o rozmiarze 22 przez żyłę główną dolną i górną, aby zlokalizować ich położenie w prawym przedsionku, który określa również przybliżone położenie węzła zatokowo-przedsionkowego. Przytrzymaj prawy wyrostek przedsionka za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont 2 i włóż szpilkę do wypreparowania przez prawy przydatek przedsionka, aby utrzymać go na miejscu. Powtórz tę samą procedurę dla uszka lewego przedsionka, a następnie wyjmij igłę strzykawki, która obejmuje żyłę główną.
Użyj nożyczek Castroviejo, aby usunąć wierzchołek serca, wykonując poprzeczne nacięcie w poprzek komór w celu uwolnienia krwi z serca, a następnie umyj serce, dodając ciepły heparynizowany kompletny roztwór Tyrode. Użyj nożyczek Castroviejo, aby przeciąć wzdłuż przegrody przedsionkowo-komorowej, aż przedsionki zostaną oddzielone od komór i utrzymuj nacięcie bliżej komory. Przeciąć wzdłuż przegrody międzytętniczej, aby usunąć lewe przedsionki.
Umieść szpilki do wycinki na obrzeżach prawego przedsionka, aby leżało płasko. Usuń pozostały tłuszcz, naczynia lub tkanki z przedsionka za pomocą nożyczek Castroviejo i zlokalizuj węzeł zatokowo-przedsionkowy w prawym przedsionku. Dodaj roztwór Tyrode'a do modelu roztworu wejściowego i włącz przepływ gazu karbogenicznego, aby natlenić roztwór Tyrode.
Ustaw pompę perystaltyczną na 25 obr./min, co daje natężenie przepływu dwóch mililitrów na minutę. Po uruchomieniu pompy należy upewnić się, że bufor nie wycieka z układu i ustawić regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Użyj kleszczyków Dumont 55, aby przenieść wypreparowaną tkankę z preparowanej szalki Petriego na siatkę matrycy mikroelektrod.
Delikatnie ułóż tkankę miękkim pędzlem, aby nałożyć na nią obszar węzła zatokowo-przedsionkowego siatki elektrod. Następnie umieść siatkę na tkance za pomocą kleszczyków kostnych lub dowolnych zakrzywionych kleszczy. Za pomocą kleszczy do kości umieść kotwicę harfy na siatce, aby utrzymać wszystko na miejscu.
Ułóż miskę z matrycą mikroelektrod na płytce łączącej. Ostrożnie umieść nasadkę perfuzyjną na czaszy układu mikroelektrod, nie naruszając kotwicy plastra harfy i zabezpiecz szczelinę perfuzyjną taśmą. Włącz wzmacniacz i skonfiguruj przepływ pracy dla nagrywania w oprogramowaniu.
Wybierz beat_recording. szablon moflo. Otwórz go i ustaw liczbę ścieżek, czas trwania ścieżki, interwał śledzenia, napięcie wejściowe, częstotliwość próbkowania i inne parametry nagrywania zgodnie z żądanymi warunkami nagrywania.
Kliknij przycisk nagrywania i odtwarzania, aby rozpocząć nagrywanie i pobrać dane dla 10 śladów o czasie trwania jednej minuty z dwuminutowymi przerwami między śladami. Wstrzymać pompę i przełączyć rurkę doprowadzającą pompę z normalnego roztworu rejestrującego na roztwór Tyrode'a zawierający żądany lek z wyboru. Uruchom ponownie pompę i wznów nagrywanie.
Gdy roztwór Tyrode'a z lekiem dotrze do tkanki, zapisz 10 śladów w taki sam sposób, jak zrobiono to wcześniej dla zapisów wyjściowych. Zrób końcowe zdjęcie położenia tkanki na matrycy mikroelektrod. Otwórz zapisany plik z nagranymi danymi w szablonie analizy częstotliwości dudnień w oprogramowaniu do analizy.
Kliknij na odtworzenie i pozwól, aby całe nagranie zostało uruchomione w celu wizualizacji danych, a następnie przypisz odpowiednie parametry analizy. Wybierz kanały, które mają zostać uwzględnione w analizie i ustaw żądane wartości progowe maksimów amplitudy lub minimów amplitudy w celu automatycznej identyfikacji pików przebiegu. Kliknij ponownie ikonę odtwarzania, aby ponownie uruchomić zestaw danych i potwierdzić, że parametry analizy są odpowiednie dla wyodrębnienia wartości szczytowych.
Do analizy zidentyfikuj trzy najbardziej stabilne kolejne ślady, które wykazują stabilną szybkość dudnienia dla każdego śladu w większości kanałów w okresie wyjściowym eksperymentu i kolejne trzy kolejne stabilne ślady w okresie ekspozycji na lek. Kliknij ikonę odtwarzania i nagrywania, aby rozpocząć analizę. Dane zebrano od 45-dniowego samca czarnej myszy szwajcarskiej typu dzikiego w celu pomiaru częstotliwości uderzeń węzła zatokowo-przedsionkowego.
Przebiegi o różnych kształtach i amplitudach obserwowano w różnych kanałach i wszystkie kanały wykazywały identyczne interwały między kolcami i częstotliwości odpalania. Jednak stopień kontaktu tkanki z elektrodą może również wpływać na charakterystykę przebiegu, taką jak amplituda. Z 10 zarejestrowanych śladów wybrano trzy kolejne kanały o stabilnej częstotliwości dudnień i interwale między kolcami do dalszej analizy.
Źle wyodrębnione wzory kolców powinny być nieobecne, ale jeśli występują, to albo wpływ na nie ma szum, albo są niestabilne. Kształty fal, które odpowiadają poszczególnym uderzeniom serca, odzwierciedlają wewnętrzną aktywność rozrusznika serca. System matrycy mikroelektrod umożliwia łatwe stosowanie środków leczniczych w celu analizy efektów farmakologicznych.
Stwierdzono, że wewnętrzna szybkość wypalania wybranych trzech ścieżek we wszystkich 64 kanałach wynosi około 320 uderzeń na minutę w danych próbkowania. Wprowadzenie 4-aminopirymidyny zgodnie z oczekiwaniami zwiększyło odstępy między kolcami, co zmniejszyło częstotliwość uderzeń z 320 do 210 uderzeń na minutę. Aby zebrać wiarygodne dane do analizy, ważne jest, aby potwierdzić, że tkanka jest zdrowa podczas rejestracji, sprawdzając, czy ślady są stabilne i spełniają standardowe kryteria.
MEA mogą być używane do rejestrowania aktywności serca w innych regionach serca, umożliwiając szczegółową charakterystykę specyficzną dla regionu, która jest podatna na badanie skutków manipulacji genetycznych i farmakologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę pomiaru wewnętrznej częstości wyładowań serca za pomocą rejestracji mikroelektrodowej tablicy elektrod tkanki węzła zatokowego u myszy. Technika ta pozwala na identyfikację defektów rytmu serca i wprowadzenie środków farmakologicznych do badania ich wpływu.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Technologia mikroelektrodowych tablic elektrod
- Analiza farmakologiczna
Tło
- Wewnętrzna częstość akcji serca jest kluczowym wskaźnikiem zdrowia serca.
- Dokładne pomiary częstości wyładowań są niezbędne do zrozumienia funkcji węzła zatokowego.
- Tradycyjne metody mogą wymagać rozległego szkolenia z elektrofizjologii.
- Zdrowe preparaty tkankowe są niezbędne do niezawodnego zbierania danych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody pomiaru wewnętrznej częstości wyładowań serca.
- Identyfikacja defektów rytmu serca w modelach mysich.
- Ocena wpływu środków farmakologicznych na wewnętrzny rytm serca.
Stosowane metody
- Rejestracja mikroelektrodowa tkanki węzła zatokowego.
- Sekcja myszy po uśmierceniu w celu uzyskania próbek tkanki.
- Optymalizacja buforów i ustawień zbierania danych.
- Szkolenie w technikach chirurgicznych do przygotowania tkanki.
Główne wyniki
- Technika ta zapewnia dokładne dane dotyczące częstości wyładowań, porównywalne z rejestracjami jednokomórkowymi.
- Wszystkie początkowe eksperymenty mogą wymagać praktyki, aby uzyskać zdrowe preparaty tkankowe.
- Środki farmakologiczne mogą być skutecznie wprowadzane do badania ich wpływu.
- Demonstracja procedury przez doświadczonych badaczy zwiększa niezawodność.
Wnioski
- Ta metodologia oferuje solidne podejście do badania rytmu serca.
- Ułatwia badanie wewnętrznych mechanizmów serca i efektów farmakologicznych.
- Przyszłe badania mogą budować na tej technice, aby dalsze zbadać zdrowie serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of intrinsic cardiac firing rate is essential for identifying pacemaking defects and de-risking cardiovascular target validation. This microelectrode array method enables reliable, high-throughput assessment of sinoatrial node function in murine models, supporting mechanistic insight into autonomic-independent heart rate regulation. The approach bridges discovery electrophysiology with pharmacological screening, enhancing predictive confidence in early-stage cardiac safety and efficacy evaluations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac pacemaker function by isolating intrinsic firing rate from autonomic influences.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for validating genetic or pharmacological modulation of sinoatrial node activity.
- Strategic Value: Supports target confidence by confirming on-target effects of compounds modulating heart rate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, channel-resolved extracellular field potential data for beat frequency and interspike interval analysis.
- Operational Value: Allows simultaneous recording from 64 electrodes, increasing throughput and data robustness compared to single-cell methods.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization for cardiovascular liability screening and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables region-specific characterization of cardiac electrophysiology in whole-mount sinoatrial node preparations.
- Operational Value: Supports dose-response testing of pharmacological agents such as 4-aminopyrimidine to assess chronotropic effects.
- Strategic Value: Improves translational continuity by providing preclinical data directly comparable to clinical heart rate endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, by providing a scalable readout of pacemaker cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel or gene contributions to automaticity by measuring spontaneous firing rates.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (beats per minute, interspike interval) suitable for compound effect profiling.
- Analytics: Enables automated spike extraction and frequency analysis across multiple channels for consistent, objective quantification.
- Translational Research: Connects murine sinoatrial node function to human cardiac safety biomarkers through conserved pacemaker mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for chronic disease model testing and repeat pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in heart rate regulation by providing direct, autonomic-independent pacemaker readouts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through stable tissue preparation and consistent MEA-based signal acquisition.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by minimizing reliance on low-throughput, technically demanding patch-clamp or isolated heart methods.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets based on validated effects on intrinsic pacemaker function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac dissection and tissue handling to ensure viable sinoatrial node preparations.
- Dependent on microelectrode array instrumentation, perfusion systems, and electrophysiology amplifiers for extracellular recording.
- Necessitates standardization of buffer composition, temperature (37°C), and flow rate (2 mL/min) across laboratories for data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to disease models with structural or fibrotic atrial remodeling.
- Limited by tissue viability duration, necessitating timely experimentation post-dissection to maintain stable baseline recordings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Dissecting the Sinoatrial Node
3:50
Microelectrode Array System Preparation for Recording
4:18
Heart Tissue Placement on Microelectrode Array Grid
5:03
Data Acquisition
6:10
Analysis of Microelectrode Array Recordings for Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
7:13
Results: The Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
8:41
Conclusion
