Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii
18 stycznia 2022
Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.
Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący pomiaru sztywności hydrożeli i ogniw za pomocą dostępnego na rynku nanoindendenta, a także przedstawia oprogramowanie typu open source do powtarzalnej analizy pozyskanych danych. Protokół pozwala nam uzyskać dane podobne do mikroskopii sił atomowych, jednak przy ułamku złożoności. Protokół ten będzie więc przydatny dla naukowców zainteresowanych badaniem właściwości mechanicznych zdrowych i chorych próbek, ale wierzymy również, że będzie miał szersze zastosowanie w kontekście nanowgłębień dla miękkich materiałów.
Po włączeniu przyrządu i zamontowaniu wybranej sondy do eksperymentu należy przystąpić do kalibracji sondy. Kliknij przycisk Inicjalizuj w głównym oknie oprogramowania. W wyświetlonym menu kalibracji wprowadź szczegóły sondy w polach wejściowych.
Następnie napełnij grubą, szklaną szalkę Petriego z płaskim dnem tym samym podłożem co naczynie na próbkę i dopasuj temperaturę pożywki do temperatury próbki. Następnie umieść naczynie kalibracyjne pod sondą. W celu kalibracji w cieczy należy wstępnie zwilżyć sondę kroplą 70% etanolu lub izopropanolu tak, aby końcówka pipety lekko stykała się ze szklaną skuwką, tak aby kropla ślizgała się po wsporniku i kulistej końcówce.
Następnie ręcznie przesuń ramię nanoinddenta w dół, aż sonda zostanie całkowicie zanurzona, ale nadal daleko od dna szalki Petriego. Odczekaj pięć minut, aby umożliwić osiągnięcie warunków równowagi w cieczy. Następnie w menu inicjowania oprogramowania kliknij Scan Wavelength (Długość fali skanowania).
Na ekranie interferometru pojawi się pasek postępu. Sprawdź, czy skanowanie optyczne zakończyło się pomyślnie, przechodząc do panelu Skanowanie długości fali w polu interferometru. Następnie w menu Inicjalizacja kliknij Znajdź powierzchnię, aby stopniowo obniżać sondę.
Sonda przestaje się poruszać, gdy zetknie się ze szklaną szalką Petriego. Gdy sonda zetknie się z powierzchnią, przesuń sondę w dół o jeden mikrometr za pomocą przycisku strzałki y w dół w głównym oknie oprogramowania. Obserwuj zielony sygnał w oknie na żywo, aby sprawdzić zmiany linii podstawowej przy każdym kroku o jeden mikrometr.
Następnie kliknij przycisk Kalibruj w menu inicjowania. Po zakończeniu kalibracji sprawdź stary i nowy współczynnik kalibracji w wyświetlonym wyskakującym okienku. Jeśli nowy współczynnik kalibracji mieści się w prawidłowym zakresie, jak wyjaśniono w manuskrypcie, kliknij przycisk Użyj nowego współczynnika.
Następnie przesuń piezo w górę o 500 mikrometrów. Następnie sprawdź, czy krąg demodulacji został prawidłowo skalibrowany, przechodząc do zakładki Demodulacja na pulpicie interferometru. Delikatnie dotknij stołu optycznego lub nanoindentera, aby wywołać wystarczający hałas.
Biały okrąg z dyskretnymi punktami danych powinien w przybliżeniu pokrywać czerwone kółko. Załaduj szalkę Petriego zawierającą próbkę na stolik mikroskopu i ręcznie przesuń sondę nanoindentera do żądanej pozycji nad próbką. Wsuń sondę do roztworu, uważając, aby pozostawić od jednego do dwóch milimetrów między sondą a powierzchnią próbki.
Odczekaj pięć minut, aż sonda zrównoważy się w roztworze. Ustaw ostrość na sondzie za pomocą mikroskopu optycznego. Aby zmierzyć moduł Younga dla miękkich materiałów, kliknij Konfiguruj eksperyment.
Dodaj krok Znajdź powierzchnię i pojedyncze wcięcie w kontrolce przemieszczenia, aby określić parametry eksperymentalne, które zostaną następnie użyte do automatycznego skanowania matrycy. Jeśli pojedyncze wcięcie zakończy się pomyślnie, skonfiguruj skanowanie matrycy zawierające od 50 do 100 punktów rozmieszczonych w odstępach od 10 do 100 mikrometrów. Po upewnieniu się, że pole Automatyczne wyszukiwanie powierzchni jest zaznaczone, kliknij Użyj pozycji stołu montażowego, aby rozpocząć skanowanie matrycy od bieżącej pozycji stołu.
Skonfiguruj profil skanowania matrycy w kontroli przemieszczenia. Pozostaw liczbę segmentów na pięć i użyj domyślnego profilu przemieszczenia. W razie potrzeby zmień profil przemieszczenia i czas dla każdego nachylonego segmentu.
Nie przekraczaj prędkości odkształcania większej niż 10 mikrometrów na sekundę. Zapisz skonfigurowany eksperyment w żądanej ścieżce eksperymentu. Kliknij Uruchom eksperyment i poczekaj na jego zakończenie.
Po zebraniu wszystkich danych wyczyść sondę i wyłącz przyrząd zgodnie z opisem w tekście. Do przesiewania krzywych siła-przemieszczenie i tworzenia oczyszczonego zestawu danych w formacie JSON należy przygotować się do uruchomienia. py z wiersza polecenia na komputerze laboratoryjnym.
Wybierz format danych Optics11 z listy rozwijanej. Jeśli dane nie zostaną załadowane poprawnie, uruchom ponownie graficzny interfejs użytkownika i wybierz Optics11 Old. Następnie kliknij Załaduj folder i wybierz folder zawierający dane do analizy.
Wyczyść zestaw danych za pomocą zakładek znajdujących się po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika. Następnie kliknij Zapisz JSON i wprowadź odpowiednią nazwę dla oczyszczonego zestawu danych. Wyślij plik JSON do komputera, na którym zainstalowano oprogramowanie NanoAnalysis, jeśli jest inny niż bieżący komputer.
Uruchom plik nano. py z wiersza poleceń. W lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika kliknij Załaduj eksperyment i wybierz plik JSON.
Spowoduje to wypełnienie listy plików i wykresu krzywych surowych przedstawiającego zestaw danych pod względem krzywych siła-przemieszczenie. W polu Statystyki sprawdź wartości trzech parametrów: N aktywowany, N nieudany i N wykluczony. Aby bardziej szczegółowo zobrazować konkretną krzywą, kliknij krzywą.
Spowoduje to podświetlenie go na zielono i pokazanie go na bieżącym wykresie krzywej. Po wybraniu pojedynczej krzywej parametry R i k zostaną wypełnione w polu Statystyki. Po dalszym oczyszczeniu zestawu danych przefiltruj wszelkie szumy w krzywych za pomocą filtrów zaimplementowanych w polu Filtrowanie.
Następnie sprawdź przefiltrowane krzywe na bieżącym wykresie krzywej. Krzywa z filtrem jest w kolorze czarnym, podczas gdy wersja bez filtra jest w kolorze zielonym. Aby znaleźć punkt kontaktowy, w polu Punkt kontaktowy wybierz jedną z serii procedur numerycznych, które zostały zaimplementowane w oprogramowaniu.
Dostosuj parametry algorytmu do zestawu danych, tak aby punkt kontaktowy był prawidłowo zlokalizowany, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Aby zobaczyć, gdzie na pojedynczej krzywej znaleziono punkt kontaktowy, wybierz krzywą, klikając ją. Następnie kliknij przycisk Sprawdź.
Sprawdź wyskakujące okienko, które się pojawi, aby określić, gdzie znajduje się punkt kontaktowy. Następnie kliknij Analiza Hertz. Spowoduje to wygenerowanie trzech wykresów.
Sprawdź dane wcięcia siły dla każdej krzywej w zestawie danych, wraz ze średnim pasowaniem hercowym pokazanym na czerwono. Następnie sprawdź krzywą wcięcia średniej siły z pasmem błędu pokazującym jedno odchylenie standardowe, wraz ze średnim pasowaniem Hertza pokazanym na czerwono. Następnie sprawdź wykres punktowy modułu Younga wynikający z dopasowania modelu Hertza do każdej pojedynczej krzywej.
Sprawdź pole Wyniki pod kątem obliczonego średniego modułu Younga i jego odchylenia standardowego, a następnie upewnij się, że są one rozsądne dla danego eksperymentu. Następnie w polu Zapisz kliknij Hertz. W wyskakującym okienku wprowadź nazwę pliku i katalog, a następnie kliknij Zapisz.
Zostanie utworzony plik tsv. Otwórz plik tsv w dowolnym dodatkowym oprogramowaniu w celu analizy statystycznej i dalszego kreślenia. Aby uzyskać dane dotyczące nanotwardości komórek, kliknij Analiza widm sprężystości.
Sprawdź dwa utworzone wykresy, a mianowicie moduł Younga jako funkcję głębokości wcięcia dla każdej krzywej oraz średni moduł Younga jako funkcję wcięcia dopasowanego przez model dwuwarstwowy. Po zakończeniu analizy kliknij ES w polu Zapisz. Spowoduje to wyeksportowanie pliku tsv w określonym katalogu, który można otworzyć i wydrukować w dowolnym innym wybranym oprogramowaniu.
Wynikiem udanego eksperymentu jest segment podejścia krzywej siła-przemieszczenie, mający wyraźną, płaską linię bazową, obszar przejściowy i obszar nachylony. Krzywe pokazujące zmiany w stosunku do tego kształtu można łatwo usunąć ze zbioru danych za pomocą NanoPrepare. Przedstawiono tutaj średnie krzywe siła-wgłębienie wraz ze średnim modelem Hertza dla miękkiego hydrożelu poliakrylamidowego i sztywnego hydrożelu.
Wykreślając indywidualne wartości modułu Younga, uzyskano oczekiwany średni moduł Younga dla obu hydrożeli. W przypadku eksperymentów z nanowgłębieniami komórek średnia krzywa siła-wgłębienie i odpowiadający jej model średniej hertza pokazują, że model Hertza nie oddaje w pełni ewolucji siły wraz ze wzrostem głębokości wgłębienia w eksperymentach z nanowgłębieniem komórek. Przedstawiono tutaj średnie widma sprężystości dopasowane do wgłębienia 200 nanometrów.
Średnie widma sprężystości zaczynają rosnąć na głębokości wgłębienia 200 nanometrów, co wskazuje na udział substratu w badanym pozornym module Younga. Z tego powodu wybrano 200 nanometrów jako zakres dopasowania zarówno dla modelu Hertz, jak i dwuwarstwowego. Dopasowanie modelu dwuwarstwowego pozwala na wyodrębnienie większej ilości informacji o stanie mechanicznym komórki, w tym o grubości kory aktynowej komórki, module kory aktynowej komórki i module objętości komórki, jak wyjaśniono w tekście głównym.
Bezpośrednie porównanie modelu Hertza z podejściem widm sprężystości pod względem rozkładu modułu Younga ujawnia nakładające się rozkłady z porównywalnymi średnimi, co pokazuje wykonalność podejścia opartego na widmach sprężystości. Dokładne zlokalizowanie punktu kontaktowego i utrzymanie spójności wybranych parametrów algorytmu między zestawami danych, które chce się porównać, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych porównań między próbkami. Metoda ta ma ogólne zastosowanie do ilościowego określania lokalnych właściwości elastycznych próbek biologicznych, w tym sferoidów, organoidów, tkanek i ogólnie całej miękkiej masy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół zapewnia kompleksowy przepływ pracy do przeprowadzania eksperymentów nanownikania na miękkich materiałach, w tym na hydrożelach i komórkach. Szczegółowo opisuje kroki zbierania danych spektroskopii sił i przedstawia oprogramowanie open-source w Pythonie do analizy danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Nauki o materiałach
Tło
- Nanownikanie to technika stosowana do pomiaru właściwości mechanicznych materiałów.
- Hydrożele i komórki są ważne do badania mechaniki biologicznej.
- Spektroskopia sił zapewnia wgląd w sztywność materiałów.
- Oprogramowanie open-source poprawia reprodukowalność analizy danych.
Cel badania
- Aby dokładnie zmierzyć sztywność hydrożeli i komórek.
- Aby zapewnić uproszczoną metodę uzyskania danych spektroskopii sił.
- Aby uczynić analizę danych dostępną za pomocą narzędzi open-source.
Stosowane metody
- Kalibracja sondy nanownikacza.
- Krokowa pomiara sztywności materiału.
- Użycie komercyjnie dostępnego nanownikacza.
- Analiza danych przy użyciu oprogramowania open-source w Pythonie.
Główne wyniki
- Skuteczne pomiary właściwości mechanicznych miękkich materiałów.
- Zbieranie danych podobne do mikroskopii sił atomowych.
- Zmniejszenie złożoności w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Szerokie zastosowanie w badaniach próbek zdrowych i chorobowych.
Wnioski
- Protokół upraszcza proces nanownikania dla miękkich materiałów.
- Oprogramowanie open-source ułatwia reprodukowalną analizę danych.
- Ta metoda jest korzystna dla badaczy z różnych dziedzin.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Nanoindentation enables quantitative assessment of local mechanical properties in hydrogels and cells, supporting target validation in mechanobiology and biomaterials design. The method provides predictive confidence by reducing ambiguity in material stiffness measurements, which is critical for preclinical model selection and lead identification. Its compatibility with soft matter systems facilitates translational biomarker discovery and disease-relevant system modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of elastic modulus in disease-relevant hydrogels and cellular systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of material stiffness for target validation workflows.
- Predictive Value: Enhances lead identification by enabling mechanical phenotyping of biomaterials and cells to prioritize candidates with desired biophysical profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological and biomaterial systems for downstream screening by establishing baseline mechanical phenotypes.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through automated data filtering, contact point detection, and Hertz model fitting.
- Scalability: Enables high-throughput-like screening readiness via matrix scan configurations (50–100 points) and open-source software for batch analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by enabling consistent mechanical phenotyping across hydrogels, cells, spheroids, and organoids.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by quantifying mechanical biomarkers that correlate with functional outcomes in disease models.
- Mechanistic De-risking: Elasticity spectra analysis extracts actin cortex and bulk modulus parameters, reducing uncertainty in cellular mechanical state interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery for target validation, proceeds through screening for assay development, and supports translational research by enabling mechanical phenotyping across disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying stiffness changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized force-displacement curve acquisition, automated screening of invalid curves, and JSON-based data export for interoperability.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Young’s modulus, elasticity spectra) enabling statistical comparison of conditions and lead ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling mechanical profiling of 3D models (spheroids, organoids) and tissue analogs.
- Enterprise Reuse: The open-source Python software (NanoPrepare, NanoAnalysis) establishes a reusable analytics platform across projects, reducing redundant tool development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in mechanical property measurements.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via calibrated probe operation, automated data cleaning, and open-source analysis pipelines.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early mechanical de-risking of biomaterials and cellular models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative mechanical phenotypes aligned with disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomechanics, probe calibration, and force spectroscopy principles.
- Depends on commercially available nanoindenter hardware and compatible computing infrastructure for Python-based analysis.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols, indentation parameters, and data filtering thresholds.
- Requires adaptation of probe geometry and indentation depth limits when transitioning between hydrogels, cells, and 3D models.
- Practical limitation: Hertz model assumptions may not fully capture cell mechanics, necessitating bilayer or elasticity spectra analysis for accurate interpretation.
