Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący pomiaru sztywności hydrożeli i ogniw za pomocą dostępnego na rynku nanoindendenta, a także przedstawia oprogramowanie typu open source do powtarzalnej analizy pozyskanych danych. Protokół pozwala nam uzyskać dane podobne do mikroskopii sił atomowych, jednak przy ułamku złożoności. Protokół ten będzie więc przydatny dla naukowców zainteresowanych badaniem właściwości mechanicznych zdrowych i chorych próbek, ale wierzymy również, że będzie miał szersze zastosowanie w kontekście nanowgłębień dla miękkich materiałów.

Po włączeniu przyrządu i zamontowaniu wybranej sondy do eksperymentu należy przystąpić do kalibracji sondy. Kliknij przycisk Inicjalizuj w głównym oknie oprogramowania. W wyświetlonym menu kalibracji wprowadź szczegóły sondy w polach wejściowych.

Następnie napełnij grubą, szklaną szalkę Petriego z płaskim dnem tym samym podłożem co naczynie na próbkę i dopasuj temperaturę pożywki do temperatury próbki. Następnie umieść naczynie kalibracyjne pod sondą. W celu kalibracji w cieczy należy wstępnie zwilżyć sondę kroplą 70% etanolu lub izopropanolu tak, aby końcówka pipety lekko stykała się ze szklaną skuwką, tak aby kropla ślizgała się po wsporniku i kulistej końcówce.

Następnie ręcznie przesuń ramię nanoinddenta w dół, aż sonda zostanie całkowicie zanurzona, ale nadal daleko od dna szalki Petriego. Odczekaj pięć minut, aby umożliwić osiągnięcie warunków równowagi w cieczy. Następnie w menu inicjowania oprogramowania kliknij Scan Wavelength (Długość fali skanowania).

Na ekranie interferometru pojawi się pasek postępu. Sprawdź, czy skanowanie optyczne zakończyło się pomyślnie, przechodząc do panelu Skanowanie długości fali w polu interferometru. Następnie w menu Inicjalizacja kliknij Znajdź powierzchnię, aby stopniowo obniżać sondę.

Sonda przestaje się poruszać, gdy zetknie się ze szklaną szalką Petriego. Gdy sonda zetknie się z powierzchnią, przesuń sondę w dół o jeden mikrometr za pomocą przycisku strzałki y w dół w głównym oknie oprogramowania. Obserwuj zielony sygnał w oknie na żywo, aby sprawdzić zmiany linii podstawowej przy każdym kroku o jeden mikrometr.

Następnie kliknij przycisk Kalibruj w menu inicjowania. Po zakończeniu kalibracji sprawdź stary i nowy współczynnik kalibracji w wyświetlonym wyskakującym okienku. Jeśli nowy współczynnik kalibracji mieści się w prawidłowym zakresie, jak wyjaśniono w manuskrypcie, kliknij przycisk Użyj nowego współczynnika.

Następnie przesuń piezo w górę o 500 mikrometrów. Następnie sprawdź, czy krąg demodulacji został prawidłowo skalibrowany, przechodząc do zakładki Demodulacja na pulpicie interferometru. Delikatnie dotknij stołu optycznego lub nanoindentera, aby wywołać wystarczający hałas.

Biały okrąg z dyskretnymi punktami danych powinien w przybliżeniu pokrywać czerwone kółko. Załaduj szalkę Petriego zawierającą próbkę na stolik mikroskopu i ręcznie przesuń sondę nanoindentera do żądanej pozycji nad próbką. Wsuń sondę do roztworu, uważając, aby pozostawić od jednego do dwóch milimetrów między sondą a powierzchnią próbki.

Odczekaj pięć minut, aż sonda zrównoważy się w roztworze. Ustaw ostrość na sondzie za pomocą mikroskopu optycznego. Aby zmierzyć moduł Younga dla miękkich materiałów, kliknij Konfiguruj eksperyment.

Dodaj krok Znajdź powierzchnię i pojedyncze wcięcie w kontrolce przemieszczenia, aby określić parametry eksperymentalne, które zostaną następnie użyte do automatycznego skanowania matrycy. Jeśli pojedyncze wcięcie zakończy się pomyślnie, skonfiguruj skanowanie matrycy zawierające od 50 do 100 punktów rozmieszczonych w odstępach od 10 do 100 mikrometrów. Po upewnieniu się, że pole Automatyczne wyszukiwanie powierzchni jest zaznaczone, kliknij Użyj pozycji stołu montażowego, aby rozpocząć skanowanie matrycy od bieżącej pozycji stołu.

Skonfiguruj profil skanowania matrycy w kontroli przemieszczenia. Pozostaw liczbę segmentów na pięć i użyj domyślnego profilu przemieszczenia. W razie potrzeby zmień profil przemieszczenia i czas dla każdego nachylonego segmentu.

Nie przekraczaj prędkości odkształcania większej niż 10 mikrometrów na sekundę. Zapisz skonfigurowany eksperyment w żądanej ścieżce eksperymentu. Kliknij Uruchom eksperyment i poczekaj na jego zakończenie.

Po zebraniu wszystkich danych wyczyść sondę i wyłącz przyrząd zgodnie z opisem w tekście. Do przesiewania krzywych siła-przemieszczenie i tworzenia oczyszczonego zestawu danych w formacie JSON należy przygotować się do uruchomienia. py z wiersza polecenia na komputerze laboratoryjnym.

Wybierz format danych Optics11 z listy rozwijanej. Jeśli dane nie zostaną załadowane poprawnie, uruchom ponownie graficzny interfejs użytkownika i wybierz Optics11 Old. Następnie kliknij Załaduj folder i wybierz folder zawierający dane do analizy.

Wyczyść zestaw danych za pomocą zakładek znajdujących się po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika. Następnie kliknij Zapisz JSON i wprowadź odpowiednią nazwę dla oczyszczonego zestawu danych. Wyślij plik JSON do komputera, na którym zainstalowano oprogramowanie NanoAnalysis, jeśli jest inny niż bieżący komputer.

Uruchom plik nano. py z wiersza poleceń. W lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika kliknij Załaduj eksperyment i wybierz plik JSON.

Spowoduje to wypełnienie listy plików i wykresu krzywych surowych przedstawiającego zestaw danych pod względem krzywych siła-przemieszczenie. W polu Statystyki sprawdź wartości trzech parametrów: N aktywowany, N nieudany i N wykluczony. Aby bardziej szczegółowo zobrazować konkretną krzywą, kliknij krzywą.

Spowoduje to podświetlenie go na zielono i pokazanie go na bieżącym wykresie krzywej. Po wybraniu pojedynczej krzywej parametry R i k zostaną wypełnione w polu Statystyki. Po dalszym oczyszczeniu zestawu danych przefiltruj wszelkie szumy w krzywych za pomocą filtrów zaimplementowanych w polu Filtrowanie.

Następnie sprawdź przefiltrowane krzywe na bieżącym wykresie krzywej. Krzywa z filtrem jest w kolorze czarnym, podczas gdy wersja bez filtra jest w kolorze zielonym. Aby znaleźć punkt kontaktowy, w polu Punkt kontaktowy wybierz jedną z serii procedur numerycznych, które zostały zaimplementowane w oprogramowaniu.

Dostosuj parametry algorytmu do zestawu danych, tak aby punkt kontaktowy był prawidłowo zlokalizowany, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Aby zobaczyć, gdzie na pojedynczej krzywej znaleziono punkt kontaktowy, wybierz krzywą, klikając ją. Następnie kliknij przycisk Sprawdź.

Sprawdź wyskakujące okienko, które się pojawi, aby określić, gdzie znajduje się punkt kontaktowy. Następnie kliknij Analiza Hertz. Spowoduje to wygenerowanie trzech wykresów.

Sprawdź dane wcięcia siły dla każdej krzywej w zestawie danych, wraz ze średnim pasowaniem hercowym pokazanym na czerwono. Następnie sprawdź krzywą wcięcia średniej siły z pasmem błędu pokazującym jedno odchylenie standardowe, wraz ze średnim pasowaniem Hertza pokazanym na czerwono. Następnie sprawdź wykres punktowy modułu Younga wynikający z dopasowania modelu Hertza do każdej pojedynczej krzywej.

Sprawdź pole Wyniki pod kątem obliczonego średniego modułu Younga i jego odchylenia standardowego, a następnie upewnij się, że są one rozsądne dla danego eksperymentu. Następnie w polu Zapisz kliknij Hertz. W wyskakującym okienku wprowadź nazwę pliku i katalog, a następnie kliknij Zapisz.

Zostanie utworzony plik tsv. Otwórz plik tsv w dowolnym dodatkowym oprogramowaniu w celu analizy statystycznej i dalszego kreślenia. Aby uzyskać dane dotyczące nanotwardości komórek, kliknij Analiza widm sprężystości.

Sprawdź dwa utworzone wykresy, a mianowicie moduł Younga jako funkcję głębokości wcięcia dla każdej krzywej oraz średni moduł Younga jako funkcję wcięcia dopasowanego przez model dwuwarstwowy. Po zakończeniu analizy kliknij ES w polu Zapisz. Spowoduje to wyeksportowanie pliku tsv w określonym katalogu, który można otworzyć i wydrukować w dowolnym innym wybranym oprogramowaniu.

Wynikiem udanego eksperymentu jest segment podejścia krzywej siła-przemieszczenie, mający wyraźną, płaską linię bazową, obszar przejściowy i obszar nachylony. Krzywe pokazujące zmiany w stosunku do tego kształtu można łatwo usunąć ze zbioru danych za pomocą NanoPrepare. Przedstawiono tutaj średnie krzywe siła-wgłębienie wraz ze średnim modelem Hertza dla miękkiego hydrożelu poliakrylamidowego i sztywnego hydrożelu.

Wykreślając indywidualne wartości modułu Younga, uzyskano oczekiwany średni moduł Younga dla obu hydrożeli. W przypadku eksperymentów z nanowgłębieniami komórek średnia krzywa siła-wgłębienie i odpowiadający jej model średniej hertza pokazują, że model Hertza nie oddaje w pełni ewolucji siły wraz ze wzrostem głębokości wgłębienia w eksperymentach z nanowgłębieniem komórek. Przedstawiono tutaj średnie widma sprężystości dopasowane do wgłębienia 200 nanometrów.

Średnie widma sprężystości zaczynają rosnąć na głębokości wgłębienia 200 nanometrów, co wskazuje na udział substratu w badanym pozornym module Younga. Z tego powodu wybrano 200 nanometrów jako zakres dopasowania zarówno dla modelu Hertz, jak i dwuwarstwowego. Dopasowanie modelu dwuwarstwowego pozwala na wyodrębnienie większej ilości informacji o stanie mechanicznym komórki, w tym o grubości kory aktynowej komórki, module kory aktynowej komórki i module objętości komórki, jak wyjaśniono w tekście głównym.

Bezpośrednie porównanie modelu Hertza z podejściem widm sprężystości pod względem rozkładu modułu Younga ujawnia nakładające się rozkłady z porównywalnymi średnimi, co pokazuje wykonalność podejścia opartego na widmach sprężystości. Dokładne zlokalizowanie punktu kontaktowego i utrzymanie spójności wybranych parametrów algorytmu między zestawami danych, które chce się porównać, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych porównań między próbkami. Metoda ta ma ogólne zastosowanie do ilościowego określania lokalnych właściwości elastycznych próbek biologicznych, w tym sferoidów, organoidów, tkanek i ogólnie całej miękkiej masy.