Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii
6 września 2016
Prezentujemy zestaw technik do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych mózgu w mikro-, mezo- i makro-skali.
Ogólnym celem tych technik charakterystyki mechanicznej jest pomiar właściwości wiskoelastycznych tkanki biologicznej w różnych skalach długości i przy różnych prędkościach obciążania. Metody te mogą posłużyć do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii biologicznej. Przykładowo, w jaki sposób mózg odkształca się przy bardzo wysokich prędkościach obciążania lub jak choroby takie jak stwardnienie rozsiane czy autyzm wpływają na właściwości mechaniczne tkanki mózgowej.
Główną zaletą tych technik jest to, że w przypadku materiałów o bardzo niskiej sztywności i bardzo wysokim stopniu nawodnienia, takich jak tkanka biologiczna, można przeprowadzać badania w szerokim zakresie warunków obciążenia, a także dla szerokiego zakresu objętości materiału – od poziomu pojedynczej komórki aż po poziom całego mózgu. Zastosowanie tych technik obejmuje modelowanie reakcji mózgu podczas urazu, co jest istotne dla opracowania strategii ochronnych. Choć metoda ta pozwala na poznanie właściwości mechanicznych mózgu, można ją również zastosować do innych podatnych tkanek biologicznych, takich jak serce i wątroba.
Podczas charakterystyki mechanicznej tkanek podatnych kluczowe jest zapewnienie odpowiedniego kontaktu między sondą pomiarową a tkanką. Ostrożnie zamontuj w uchwycie sondę AFM o nominalnej stałej sprężystości 0,03 N/m z borokrzemową kulką o średnicy 20 µm. Umieść skrawka mózgu zamontowanego w szalce Petriego na grzejniku zamocowanym na stoliku AFM, który został uprzednio rozgrzany do 37 °C.
Następnie dodaj około dwóch mililitrów uprzednio ogrzanego medium. Dalej, ostrożnie nanieś kroplę medium na sondę AFM, aby zapobiec jej złamaniu wskutek napięcia powierzchniowego podczas zanurzania w medium otaczającym skrawek mózgu. Następnie umieść głowicę AFM ponownie nad stolikiem i zacznij ją opuszczać, aż zostanie zanurzona w medium.
Używając mikroskopu optycznego, przesuń stolik tak, aby obszar zainteresowania znajdował się pod skalibrowaną sondą AFM, a następnie obniż sondę AFM, aby nawiązać kontakt z powierzchnią tkanki. W celu przeprowadzenia eksperymentów podatności pełzania, utwórz funkcję przyłożonej siły w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja składa się z rampy trwającej 0,1 sekundy do wartości zadanej 5 nanonewton, która jest utrzymywana przez 20 sekund, a następnie rampy spadkowej trwającej jedną sekundę do zera nanonewton.
Oprogramowanie zarejestruje dane dotyczące wgłębienia się sondy AFM w tkankę podczas wykonywania funkcji przyłożonej siły. Po przeprowadzeniu eksperymentu zgodności pełzania, należy przeprowadzić eksperymenty relaksacji siły, tworząc w oprogramowaniu funkcję przyłożonego wgłębienia. Uruchom tę funkcję, podczas gdy oprogramowanie zbiera dane o sile działającej na sondę AFM w momencie wbijania się w tkankę.
Aby rozpocząć testy wkluwaniowe z uderzeniem, dopasuj sferyczną sondę, nasuwając ją na wahadło za pomocą pęsety. Następnie zamocuj trzpień z próbką z topionego kwarcu do płytki i przykręć płytkę do stołu translacyjnego. Aby umożliwić przeprowadzenie dynamicznych eksperymentów uderzeniowych na uwodnionych tkankach mózgu, w pierwszej kolejności wykonaj kalibrację celi z cieczą.
Przejdź do menu Kalibracja w oprogramowaniu, wybierz Komórka cieczowa i postępuj zgodnie z instrukcjami programu, aby nawiązać kontakt z próbką z topionego kwarcu. Następnie wybierz Normalny jako Typ Indentera i pozostaw domyślną wartość 0,05 millinewtonów dla Obciążenia Indentera. Kliknij następnie kontynuuj, aby przeprowadzić kalibrację dla normalnej konfiguracji indentera.
Teraz przesuń stół z próbką z powrotem o co najmniej pięć milimetrów i zamontuj ramię dźwigni. Powtórz kalibrację komórki z cieczą w nowej konfiguracji, wybierając Liquid Cell jako typ wgłębnika. Kliknij Continue, aby uzyskać współczynnik kalibracji komórki z cieczą.
Następnie zwiększ odstęp między okładkami kondensatora. Zwiększenie odstępu między okładkami kondensatora pozwoli na zwiększenie maksymalnej mierzalnej głębokości, co jest niezbędne podczas testowania materiałów o wysokiej podatności. Za pomocą klucza obróć zgodnie z ruchem wskazówek zegara trzy nakrętki regulujące odstęp między okładkami kondensatora, wykonując niewielkie obroty.
Po każdym pełnym obrocie zgodnie z ruchem wskazówek zegara należy wybrać opcję Bridge Box Adjustment w menu Maintenance i przeprowadzić pomyślny test wahadła (pendulum test). Należy powoli regulować nakrętki, aż wartość Approx. Depth Calibration osiągnie 70 000 nanometers per volt lub więcej.
Następnie umieść nowy ogranicznik u dołu wahadła, który może być włączany i wyłączany za pomocą zasilacza. Wycofaj oryginalny ogranicznik znajdujący się za wahadłem, aby usunąć potencjalną przeszkodę w ruchu wahadła i umożliwić uzyskanie wyższych prędkości uderzenia, a także większych głębokości penetracji w próbkach podatnych. Włącz zasilacz elektromagnesu i ustaw napięcie na 10 V.
Następnie przejdź do menu Experiment i wybierz Impact and Adjust Impulse Displacement. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby skalibrować dystans wychylenia wahadła. Po pełnym ukończeniu konfiguracji wgłębienia uderzeniowego, odessaj medium i wysusz skrawek mózgu.
Następnie należy użyć cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować przekrojony mózg do aluminiowego wspornika na próbkę. Po czym nasuń cel płynny na drugą uszczelkę O-ring na wsporniku na próbkę i wypełnij cel płynny pięcioma mililitrami pożywki niezależnej od dwutlenku węgla, aby całkowicie zanurzyć tkankę. Przesuń kąpiel w kierunku ujemnym osi X, aż końcówka ramienia dźwigni znajdzie się w odpowiednim położeniu nad kąpielą.
Następnie przesuń w dodatnim kierunku osi Z, aż końcówka zostanie całkowicie zanurzona w kąpieli i znajdzie się przed próbką. Używając okna Sample Stage Control, ostrożnie nawiąż kontakt, a następnie odsuń stół od powierzchni próbki o około 30 micrometers. W menu Experiment kliknij Impact i skonfiguruj eksperyment uderzeniowy.
Wybierz konkretny impuls obciążenia, który będzie bezpośrednio powiązany z wynikową prędkością uderzenia na podstawie kalibracji odległości wychylenia. Następnie przeprowadź zaplanowany eksperyment. Gdy wahadło powróci, a powierzchnia próbki będzie nadal przemieszczać się w stronę płaszczyzny pomiarowej, wyłącz dolny wyłącznik krańcowy.
Oprogramowanie zarejestruje przemieszczenie sondy w funkcji czasu. Przymocuj papier ścierny do sondy pomiarowej o średnicy 25 milimetrów. Następnie podłącz system termiczny i zamontuj sondę.
Na koniec przymocuj kolejny kawałek papieru ściernego do dolnej płyty, tak aby była wyrównana z płytą górną. Skalibruj reometr zgodnie z instrukcjami producenta. W pierwszej kolejności wyzeruj siłę na sondzie.
Po drugie, należy ustanowić kontakt między sondą a płytą dolną. Następnie zmierz bezwładność sondy. Na koniec wykonaj regulację silnika.
Następnie powoli opuść płytkę pomiarową. Gdy płytka znajdzie się w odległości jednego milimetra od tkanki, obniżaj ją w przyrostach 0,1 milimetra, aż płytka w pełni zetknie się z górną powierzchnią tkanki, a zmierzona siła normalna osiągnie pożądaną wartość. Nanieś niewielką objętość pożywki na krawędzie próbki, aby utrzymać nawilżenie podczas procedury.
Obniż osłonę termiczną. Następnie kliknij Plik, Nowy i w zakładce Żel wybierz Skan częstotliwości. Następnie kliknij pomiar okna jeden skan częstotliwości i dwukrotnie kliknij pole oscylacji.
Wprowadź zakres częstotliwości, odkształcenie oraz liczbę punktów. Na koniec wybierz OK i kliknij Start, aby rozpocząć pomiar częstotliwości. Poniżej przedstawiono reprezentatywne odpowiedzi wgłębienia i siły w czasie dla eksperymentów dotyczących pełzania oraz relaksacji naprężeń.
Wykorzystując te dane oraz geometrię układu, można obliczyć moduły pełzania i relaksacji naprężeń dla różnych obszarów mózgu. Indentacja udarowa pozwala zmierzyć właściwości mechaniczne tkanki przy wysokich prędkościach obciążenia, skoncentrowanego w przestrzeni i czasie. Wynikowe parametry odpowiedzi na udar mogą być ilościowo określone dla różnych prędkości uderzenia, co stanowi metodę badania właściwości tkanki zależnych od prędkości.
Reologia mierzy zależne od częstotliwości właściwości wiskoelastyczne tkanki objętościowej w postaci modułów zachowawczego i stratności. Moduł zachowawczy jest niemal o rząd wielkości większy od modułu stratności przy niskich częstotliwościach, co wskazuje, że w zachowaniu tkanki mózgowej dominują właściwości sprężyste. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać tkankę w stanie odpowiedniego nawodnienia lub zanurzyć ją w płynie, który pomaga tkance zachować prawidłową strukturę.
Opracowanie tych zademonstrowanych technik utorowało drogę badaczom materiałów do projektowania i optymalizacji syntetycznych żeli, które mogą naśladować odpowiedź mechaniczną mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób wgłębienia z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych, wgłębienia udarowe oraz reologia są wykorzystywane do charakteryzacji wiskoelastycznych właściwości mechanicznych tkanki. Interpretując zebrane dane, pamiętaj o podstawowym założeniu, że odkształcona objętość tkanki jest strukturalnie jednorodna i elastycznie izotropowa.
Nie musi to być prawdą w przypadku wszystkich tkanek biologicznych. W miarę jak Twoje pytania dotyczące mechaniki tkanek biologicznych staną się bardziej precyzyjne, możesz wybrać jeden lub więcej z tych eksperymentów mechanicznych, aby odpowiedzieć na pytanie w odpowiedniej skali długości lub skali czasu, która Cię interesuje.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia techniki charakteryzacji wiskoelastycznych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej w różnych skalach. Metody te są kluczowe dla zrozumienia, w jaki sposób mózg reaguje na różne warunki obciążenia oraz jak choroby wpływają na jego właściwości mechaniczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Inżynieria biologiczna
- Charakterystyka mechaniczna
Wstęp
- Właściwości wiskoelastyczne są kluczowe dla zrozumienia mechaniki mózgu.
- Techniki te pozwalają ocenić odkształcenia mózgu przy wysokich prędkościach obciążania.
- Choroby, takie jak stwardnienie rozsiane i autyzm, mogą zmieniać mechanikę tkanki mózgowej.
- Zdobyte informacje mogą pomóc w opracowaniu strategii ochrony przed urazami mózgu.
Cel badania
- Pomiar właściwości wiskoelastycznych tkanek biologicznych.
- Badanie wpływu różnych warunków obciążenia na mechanikę mózgu.
- Rozszerzenie wyników na inne tkanki biologiczne, takie jak serce i wątroba.
Zastosowane metody
- Techniki charakteryzacji tkanek biologicznych.
- Testowanie w szerokim zakresie warunków obciążenia.
- Ocena właściwości materiałowych od pojedynczych komórek po całe mózgi.
- Modelowanie reakcji mózgu w scenariuszach urazowych.
Główne wyniki
- Techniki te skutecznie mierzą lepkosprężystość tkanki mózgowej.
- Wyniki ujawniają, w jaki sposób choroby wpływają na właściwości mechaniczne.
- Uzyskane informacje przyczyniają się do zrozumienia reakcji na urazy mózgu.
- Metody te są możliwe do zastosowania w przypadku innych podatnych tkanek biologicznych.
Wnioski
- Techniki charakteryzacji są kluczowe dla inżynierii biologicznej.
- Zrozumienie właściwości mechanicznych pomaga w zapobieganiu urazom.
- Implikacje badawcze wykraczają poza neuronaukę i obejmują inne dziedziny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Charakteryzacja właściwości wiskoelastycznych tkanki mózgowej w wielu skalach pozwala badaniom i rozwojowi w sektorze biofarmaceutycznym na zmniejszenie ryzyka podczas walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie fenotypów mechanicznych z mechanizmami chorobowymi. To wieloskalowe podejście zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, zapewniając ilościowe, powtarzalne wyniki, które wspierają opracowywanie testów oraz strategie biomarkerów translacyjnych. Techniki te wypełniają krytyczną lukę w badaniach nad mechanobiologią, oferując narzędzia o znaczeniu przemysłowym do przesiewu i identyfikacji wiodących związków w neuroterapii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację wpływu perturbacji genetycznych lub farmakologicznych na sztywność tkanki mózgowej oraz odpowiedź lepkosprężystą.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych odczytów mechanicznych, specyficznych dla danej skali długości, co wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w przypadku celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację związków, które normalizują patologiczne fenotypy mechaniczne w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, wysokorozdzielczych danych mechanicznych (podatność pełzania, relaksacja siły, odpowiedź na uderzenie) odpowiednich do standaryzacji testów w modelach od skali mikro do makro.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalny pomiar właściwości mechanicznych tkanek w kontrolowanych warunkach nawilżenia i obciążenia, co zapewnia odporność i skalowalność testów.
- Gotowość do screeningu: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego screeningu związków poprzez ustalenie bazowych fenotypów mechanicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zmiany mechaniczne w tkance mózgowej ze stanami chorobowymi, takimi jak stwardnienie rozsiane i autyzm, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczenie wielkoskalowego fenotypowania mechanicznego.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację wpływu interwencji na właściwości mechaniczne tkanki, które są prognostyczne dla wyników funkcjonalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po testy przedkliniczne – zapewniając fenotypowanie mechaniczne w odpowiednich skalach biologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar wpływu zmian molekularnych na wiskoelastyczność tkanek na poziomie komórkowym i tkankowym.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników mechanicznych (moduły zachowania/strat, podatność pełzania), które umożliwiają rzetelną ocenę związków przy różnych prędkościach obciążania.
- Analityka: Generuje zależne od częstotliwości i czasu parametry wiskoelastyczne, które pozwalają zespołom porównywać fenotypy mechaniczne w różnych warunkach i tłach genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany mechaniczne w tkance mózgowej z modelami chorób, wspierając ciągłość przedkliniczną i rozwój biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę charakterystyki mechanicznej, którą można zastosować do wielu tkanek podatnych (mózg, serce, wątroba) w różnych projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celów w OUN dzięki bezpośredniemu fenotypowaniu właściwości mechanicznych na poziomie tkanki.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność między laboratoriami dzięki skalibrowanym protokołom AFM, wgniatania udarowego i reometrii.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka kandydatów na leki neuroterapeutyczne w oparciu o przywrócenie fenotypu mechanicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków, które przywracają prawidłowe zachowanie lepkosprężyste w modelach tkanki mózgowej istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biomechaniki, obsługi AFM oraz analizy reologicznej w celu zapewnienia dokładnej akwizycji i interpretacji danych.
- Zależne od wyspecjalizowanej aparatury, w tym AFM z podatnymi sondami, wahadłowych indentatorów udarowych oraz reometrów z kontrolą temperatury.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji przygotowania próbek, utrzymania nawodnienia oraz procedur kalibracji w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy stosowaniu technik w różnych typach tkanek lub modelach chorobowych o zróżnicowanej integralności strukturalnej.
- Ograniczone przez założenie o homogeniczności strukturalnej i izotropii sprężystej, które może nie być spełnione w tkankach heterogenicznych lub patologicznie zmienionych.
