Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii
6 września 2016
Prezentujemy zestaw technik do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych mózgu w mikro-, mezo- i makro-skali.
Ogólnym celem tych technik charakterystyki mechanicznej jest pomiar właściwości lepkosprężystych tkanki biologicznej w różnych skalach długości i szybkościach obciążenia. Metody te mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w inżynierii biologicznej. Na przykład, w jaki sposób mózg deformuje się pod wpływem bardzo dużego obciążenia lub jak choroby takie jak stwardnienie rozsiane lub autyzm wpływają na właściwości mechaniczne tkanki mózgowej.
Główną zaletą tych technik jest to, że w przypadku materiałów o bardzo niskiej sztywności i bardzo wysokim uwodnieniu, takich jak tkanka biologiczna, można testować w szerokim zakresie warunków obciążenia, a także można testować w szerokim zakresie objętości materiału, aż do poziomu pojedynczej komórki i do poziomu całego mózgu. Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku modelowania reakcji mózgu podczas urazu, co jest ważne dla inżynierii strategii ochronnych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w właściwości mechaniczne mózgu, można ją również zastosować do innych podatnych tkanek biologicznych, takich jak serce i wątroba.
Podczas mechanicznej charakterystyki podatnych tkanek kluczowe znaczenie ma ustanowienie odpowiedniego kontaktu między sondą pomiarową a tkanką. Ostrożnie załaduj sondę AFM o nominalnej stałej sprężystości 0,03 niutona na metr i koraliku borokrzemianowym o średnicy 20 mikrometrów do uchwytu sondy. Umieść plasterek mózgu zamontowany na szalce Petriego na grzejniku AFM stage, który został wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj około dwóch mililitrów podgrzanego podłoża. Następnie ostrożnie dodaj kroplę pożywki na sondę AFM, aby chronić ją przed pęknięciem z powodu napięcia powierzchniowego, gdy jest opuszczana do pożywki otaczającej wycinek mózgu. Następnie umieść głowicę AFM na stoliku i zacznij opuszczać głowicę, aż zostanie zanurzona w medium.
Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik tak, aby obszar zainteresowania znajdował się poniżej skalibrowanej sondy AFM, a następnie opuść sondę AFM, aby zetknąć się z powierzchnią tkanki. Aby przeprowadzić eksperymenty z pełzaniem, skonstruuj funkcję siły przyłożonej w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja składa się z 0,1-sekundowej rampy do nastawy 5 nanoniutonów, która jest utrzymywana przez 20 sekund, a następnie jednosekundowej rampy w dół do zera nanoniutonów.
Oprogramowanie zarejestruje dane dotyczące wgłębienia sondy AFM w tkance podczas funkcji przyłożonej siły. Po przeprowadzeniu eksperymentu zgodności pełzania przeprowadź eksperymenty relaksacji siły, tworząc zastosowaną funkcję wcięcia w oprogramowaniu. Uruchom tę funkcję, podczas gdy oprogramowanie zbiera dane o sile odczuwanej przez sondę AFM podczas wciskania się w tkankę.
Aby rozpocząć testy wgnieceń udarności, dopasuj sondę sferyczną, wsuwając ją na wahadło za pomocą pęsety. Następnie przymocuj próbkę z topionego kwarcu do płytki i przykręć płytkę do etapu translacyjnego. Aby umożliwić eksperymenty z dynamicznym wpływem na uwodnione tkanki mózgowe, najpierw wykonaj kalibrację komórek płynnych.
Przejdź do menu Kalibracja w oprogramowaniu, wybierz Liquid Cell i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby nawiązać kontakt z stopioną próbką kwarcu. Następnie wybierz opcję Normalny dla opcji Typ wgłębu i użyj domyślnej wartości 0,05 miliniutonów dla opcji Obciążenie wgłębnika. Następnie kliknij przycisk Kontynuuj, aby przeprowadzić kalibrację dla normalnej konfiguracji wgłębnika.
Teraz przesuń stolik na próbkę do tyłu o co najmniej pięć milimetrów i zamontuj ramię dźwigni. Powtórz kalibrację kuwety cieczowej w nowej konfiguracji, wybierając Liquid Cell (Ogniwo cieczowe) jako typ wgłębnika. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uzyskać współczynnik kalibracji ogniwa cieczowego.
Następnie zwiększ odstępy między płytkami kondensatorów. Zwiększenie odstępów między płytkami kondensatorów zwiększy maksymalną mierzalną głębokość, co jest niezbędne podczas testowania materiałów o wysokiej zgodności. Za pomocą klucza przekręć trzy nakrętki sterujące rozstawem płytek kondensatora zgodnie z ruchem wskazówek zegara w małych krokach.
Po każdym pełnym skręcie zgodnie z ruchem wskazówek zegara wybierz Regulacja skrzynki mostka w menu Konserwacja i uzyskaj dobry test wahadła. Kontynuuj powolną regulację nakrętek, aż kalibracja przybliżonej głębokości wskaże wartość 70 000 nanometrów na wolt lub wyższą.
Następnie umieść nowy ogranicznik w dolnej części wahadła, który można włączać i wyłączać za pomocą zasilacza. Cofnij pierwotny ogranicznik znajdujący się za wahadłem, aby usunąć potencjalną przeszkodę w ruchu wahadła i umożliwić wyższe prędkości uderzenia, a także większe głębokości penetracji w zgodnych próbkach. Włącz zasilanie elektrozaworu i ustaw go na 10 woltów.
Następnie przejdź do menu Eksperyment i wybierz Uderzenie i Dostosuj przemieszczenie impulsu. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby skalibrować odległość wychylenia wahadła. Gdy konfiguracja wgłębień udarowych jest w pełni zakończona, odessać podłoże i wysuszyć wycinek mózgu.
Następnie użyj cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować pokrojony mózg do aluminiowego słupka na próbkę. Następnie nasuń płynną komórkę na drugi O-ring na słupku próbki i napełnij płynną komórkę pięcioma mililitrami podłoża niezależnego od dwutlenku węgla, aby całkowicie zanurzyć tkankę. Przesuń wannę w ujemnym kierunku X, aż końcówka ramienia dźwigni znajdzie się prawidłowo nad wanną.
Następnie poruszaj się w dodatnim kierunku Z, aż końcówka zostanie całkowicie zanurzona w kąpieli i znajdzie się przed próbką. Korzystając z okienka Sample Stage Control, ostrożnie nawiąż kontakt, a następnie cofnij stolik od powierzchni próbki o około 30 mikrometrów. W menu Eksperyment kliknij Wpływ i skonfiguruj eksperyment dotyczący wpływu.
Wybierz konkretne obciążenie impulsowe, które będzie bezpośrednio odnosiło się do wynikowej prędkości uderzenia w oparciu o kalibrację odległości wymachu. A następnie uruchom zaplanowany eksperyment. Gdy wahadło odchyli się do tyłu, a powierzchnia próbki będzie nadal przesuwać się do płaszczyzny pomiarowej, wyłącz dolny wyłącznik krańcowy.
Przemieszczenie sondy w funkcji czasu zostanie zarejestrowane przez oprogramowanie. Przymocuj papier ścierny do sondy pomiarowej o średnicy 25 milimetrów. Następnie zamocuj system termiczny i zamontuj sondę.
Na koniec przymocuj kolejny kawałek papieru ściernego do dolnej płyty wyrównanej z górną płytą. Skalibruj reometr zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw wyzeruj siłę działającą na sondę.
Po drugie, nawiąż kontakt między sondą a dolną płytą. Następnie zmierz bezwładność sondy. Na koniec wykonaj regulację silnika.
Następnie powoli opuść płytkę pomiarową. Gdy płytka znajdzie się w odległości milimetra od tkanki, obniżaj ją w krokach co 0,1 milimetra, aż płytka całkowicie zetknie się z górną powierzchnią tkanki, a zmierzona siła normalna osiągnie pożądaną wartość. Wyciśnij niewielką objętość pożywki na krawędzie próbki, aby utrzymać nawodnienie podczas zabiegu.
Opuść pokrywę termiczną. Następnie kliknij Plik, Nowy i na karcie Żel wybierz Frequency Sweep. Następnie kliknij na pomiar okna o jedno przemiatanie częstotliwości i kliknij dwukrotnie pole oscylacji.
Wprowadź zakres częstotliwości, odkształcenie i liczbę punktów. Na koniec wybierz OK i kliknij Start, aby zainicjować przemiatanie częstotliwości. Poniżej znajdują się reprezentatywne reakcje wcięć i siły w funkcji czasu zarówno dla eksperymentów z podatnością pełzania, jak i relaksacją siły.
Korzystając z tych danych i geometrii systemu, można obliczyć moduły podatności pełzania i relaksacji siły dla różnych obszarów mózgu. Wgłębienie udarowe mierzy właściwości mechaniczne tkanki przy wysokich wskaźnikach obciążenia skoncentrowanego przestrzennie i czasowo. Uzyskane parametry reakcji na uderzenie można określić ilościowo przy różnych prędkościach uderzenia, co zapewnia środki do badania właściwości tkanki zależnych od szybkości.
Reologia mierzy zależne od częstotliwości właściwości lepkosprężyste tkanki masowej pod względem modułów magazynowania i ubytku. Moduł pamięci jest prawie o rząd wielkości większy niż moduł strat przy niskich częstotliwościach, co wskazuje, że właściwości sprężyste dominują w zachowaniu tkanki mózgowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby tkanka była odpowiednio nawodniona lub zanurzona w płynie, który pomaga tkance utrzymać jej prawidłową strukturę.
Rozwój tych zademonstrowanych technik utorował drogę badaczom materiałowym do zaprojektowania zoptymalizowanych syntetycznych żeli, które mogą naśladować mechaniczną reakcję mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób mikroskop sił atomowych umożliwił wgłębienie, wgłębienie udarowe i reologię są wykorzystywane do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych tkanki. Interpretując zebrane dane, należy pamiętać o podstawowym założeniu, że zdeformowana objętość tkanki jest strukturalnie jednorodna i elastycznie izotropowa.
Niekoniecznie jest to prawdą w przypadku wszystkich tkanek biologicznych. W miarę jak twoje pytania dotyczące mechaniki tkanek biologicznych stają się coraz lepiej zdefiniowane, możesz wybrać jeden lub więcej z tych eksperymentów mechanicznych, aby odpowiedzieć na pytanie w odpowiedniej skali długości lub skali czasowej, która cię interesuje.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia techniki charakteryzacji wiskoelastycznych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej na różnych skalach. Metody te są niezbędne do zrozumienia, jak mózg reaguje na różne warunki obciążenia i jak choroby wpływają na jego właściwości mechaniczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Inżynieria biologiczna
- Charakteryzacja mechaniczna
Tło
- Właściwości wiskoelastyczne są niezbędne do zrozumienia mechaniki mózgu.
- Techniki mogą oceniać deformację mózgu w warunkach wysokiego obciążenia.
- Choroby takie jak stwardnienie rozsiane i autyzm mogą zmienić mechanikę tkanki mózgowej.
- Wgląd może pomóc w opracowywaniu strategii ochronnych przed urazami mózgu.
Cel badania
- Zmierzyć właściwości wiskoelastyczne tkanek biologicznych.
- Zbadać wpływ różnych warunków obciążenia na mechanikę mózgu.
- Rozszerzyć wyniki na inne tkanki biologiczne, takie jak serce i wątroba.
Stosowane metody
- Techniki charakteryzacji tkanek biologicznych.
- Testowanie w szerokim zakresie warunków obciążenia.
- Ocenianie właściwości materiałów od pojedynczych komórek do całych mózgów.
- Modelowanie reakcji mózgu w scenariuszach urazowych.
Główne wyniki
- Techniki skutecznie mierzą wiskoelastyczność tkanki mózgowej.
- Wyniki ujawniają, jak choroby wpływają na właściwości mechaniczne.
- Wgląd przyczynia się do zrozumienia reakcji mózgu na urazy.
- Metody mają zastosowanie do innych sprężystych tkanek biologicznych.
Konkluzje
- Techniki charakteryzacji są niezbędne dla inżynierii biologicznej.
- Zrozumienie właściwości mechanicznych pomaga w zapobieganiu urazom.
- Implikacje badań rozciągają się poza neuronauki na inne dziedziny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Characterizing the viscoelastic properties of brain tissue across multiple scales enables biopharma R&D to de-risk target validation by linking mechanical phenotypes to disease mechanisms. This multiscale approach supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible readouts that inform assay development and translational biomarker strategies. The techniques address a critical gap in mechanobiology research, offering enterprise-relevant tools for screening and lead identification in neurotherapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how genetic or pharmacological perturbations alter brain tissue stiffness and viscoelastic response.
- Operational Value: Provides standardized, length-scale-specific mechanical readouts that support pathway clarification and biological de-risking of CNS targets.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize pathological mechanical phenotypes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution mechanical data (creep compliance, force relaxation, impact response) suitable for assay standardization across microscale to macroscale models.
- Operational Value: Enables reproducible measurement of tissue mechanical properties under controlled hydration and loading conditions, supporting assay robustness and scalability.
- Screening Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline mechanical phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mechanical alterations in brain tissue to disease states such as multiple sclerosis and autism, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing cross-scale mechanical phenotyping.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how interventions affect tissue-level mechanical properties predictive of functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical testing by providing mechanical phenotyping at relevant biological scales.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how molecular changes affect tissue viscoelasticity at cellular and tissue levels.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative mechanical outputs (storage/loss moduli, creep compliance) that enable reliable compound evaluation across loading rates.
- Analytics: Generates frequency-dependent and time-dependent viscoelastic metrics that allow teams to compare mechanical phenotypes across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects mechanical changes in brain tissue to disease models, supporting preclinical continuity and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mechanical characterization platform applicable to multiple compliant tissues (brain, heart, liver) across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS target validation through direct phenotyping of tissue-level mechanical properties.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories via calibrated AFM, impact indentation, and rheometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neurotherapeutic candidates based on mechanical phenotype rescue.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that restore normal viscoelastic behavior in disease-relevant brain tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomechanics, AFM operation, and rheological analysis to ensure accurate data acquisition and interpretation.
- Dependent on specialized instrumentation including AFM with compliant probes, pendulum-based impact indenters, and temperature-controlled rheometers.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, hydration maintenance, and calibration procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying techniques across different tissue types or disease models with varying structural integrity.
- Limited by the assumption of structural homogeneity and elastic isotropy, which may not hold in heterogeneous or pathologically altered tissues.
