Name: Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę budowy mikroelektrod do równoczesnych nagrań potencjałów lokalnego pola z wielu struktur mózgu in vivo. Ta elastyczna konstrukcja umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health (RO1 NS120945, R37NS119012 do JK) oraz UVA Brain Institute.

Niniejsza praca została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Wirginijskiego. Do eksperymentów wykorzystano myszy C57Bl/6 obu płci (7–12 tygodni). Zwierzęta utrzymywano w cyklu 12 h światła / 12 h ciemności i miały dostęp ad libitum do pokarmu i wody.
1. Budowa mikroelektrody
<ol>
	<li>Aby skonstruować mikroelektrody, należy użyć drutu niklowo-chromowego powlekanego diamelem o średnicy 50 µm (patrz Tabela materiałów). Jeden koniec drutu przykleić taśmą do tyłu platformy, a następnie owinąć drut trzykrotnie wokół najbliższego uchwytu na platformie (Rycina 1A,C). 
	UWAGA: W tej procedurze zastosowano platformę akrylową z dwoma uchwytami (2 x 5 cali), lecz można użyć dowolnej platformy.
	<ol>
		<li>Naciągnąć drut wokół drugiego, dalszego uchwytu, aby utworzyć dwie pętle między uchwytami. Owinąć drut trzykrotnie wokół pierwszego uchwytu, aby go unieruchomić, a następnie ponownie przykleić koniec drutu taśmą do tyłu platformy. 
		UWAGA: Po rozdzieleniu drutów (kroki 1.2-1.3.1) po każdej stronie muszą znajdować się dwa druty (łącznie cztery druty, Rycina 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod drutami umieścić listwy napinające z owiniętą wokół nich taśmą (stroną klejącą do góry) (Rycina 1C). 
	UWAGA: Jako listwy napinające zastosowano trójkątne elementy akrylowe owinięte taśmą (stroną klejącą na zewnątrz, aby przymocować druty). Lepka strona taśmy na zewnątrz listew napinających utrzyma druty w miejscu, co pozwoli na regulację odległości między nimi. Listwy napinające muszą znajdować się ok. 2,5 cm od uchwytów, a druty nie mogą być luźne.</li>
	<li>Używając mikroskopu i precyzyjnej pęsety, pozostawić między drutami przerwę o szerokości 3 mm lub 4,5 mm (przerwa 3 mm dla mikroelektrod kora mózgowa (Ctx) – jądro brzuszzoboczne wzgórza (VL); przerwa 4,5 mm dla mikroelektrod prążkowie (Str) – prążkowanie czarne (SNR)) (Rycina 1B).
	<ol>
		<li>W przypadku stosowania powiększenia w mikroskopie należy obliczyć i skorygować różnicę między powiększeniem a rzeczywistą odległością między drutami. 
		UWAGA: Jeśli mikroelektrody są konstruowane dla innych struktur niż te opisane tutaj, odległość między drutami należy dostosować do stereotaktycznej odległości między tymi strukturami. Rycina 2B przedstawia przykład organizacji drutów; odpowiednio należy skorygować współrzędne stereotaktyczne dla innych struktur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciąć cztery małe kawałki plastiku (grubość 0,5 mm) o wymiarach ok. 6 mm (szerokość) x 3 mm (wysokość) (Rycina 1C). 
	UWAGA: Można użyć dowolnych kawałków plastiku, pod warunkiem, że mają grubość 0,5 mm; tutaj wykorzystano rurki kwadratowe, w których sprzedawano piny (Piny, patrz Tabela materiałów). W przypadku zastosowania innej grubości należy dodać więcej lub mniej kawałków plastiku, aby dopasować je do wymaganych współrzędnych stereotaktycznych.</li>
	<li>Nanieść klej (patrz Tabela materiałów) na plastik i umieścić go na drutach (Rycina 1C). Kawałki plastiku umieścić ok. 1,0 cm od środka drutu, który znajduje się 1,0 cm od listwy napinającej. Nadmiar superglue usunąć przy pomocy patyczka higienicznego.</li>
	<li>Po wyschnięciu superglue przeciąć druty precyzyjnymi nożyczkami w kolejności wskazanej na Rycynie 1C.</li>
	<li>Wyciąć cztery szklane rurki o długości 7 mm za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu (patrz Tabela materiałów) i wsunąć druty elektrod do szklanych rurek zgodnie z instrukcją na Rycynie 2A.
	<ol>
		<li>Wsunąć pary elektrod VL i SNR do szklanych rurek. 
		UWAGA: Do szklanych rurek należy wsunąć tylko druty przeznaczone dla struktur głębokich, aby umożliwić implantację chirurgiczną. Należy upewnić się, że elektrody korowe nie zostały włożone do szklanej rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałożyć klej u podstawy szklanych rurek, aby połączyć je z plastikiem. Odczekać do czasu wyschnięcia kleju.</li>
	<li>Przeciąć szklane rurki i druty za pomocą skalpela zgodnie z Tabelą 1; upewnić się, że długości mikroelektrod są prawidłowe. Jeśli mikroelektrody są skierowane do innych struktur, należy dostosować odległość cięcia do wymaganych współrzędnych stereotaktycznych.</li>
</ol>
<img alt="Schemat platformy rozciągającej z prętami naprężeniowymi i drutami, przedstawiający precyzyjne pomiary i miejsca cięcia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat konstrukcji mikroelektrody. (A) Rozmieszczenie drutów na platformie z prętami naprężeniowymi pod drutami. (B) Przerwa między drutami. (C) Cztery kawałki plastiku przyklejone do drutów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ctx</td>
			<td>Str</td>
			<td>VL</td>
			<td>SNR (stosunek sygnału do szumu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP (przednio-tylna)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>-1.3</td>
			<td>-3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML (przyśrodkowo-boczny)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV (grzbietowo-brzuszna)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość elektrody</td>
			<td>4</td>
			<td>4.75</td>
			<td>5.25</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Koordynaty implantacji stereotaktycznej i wymiary mikroelektrod.
2. Montaż matrycy mikroelektrod
<ol>
	<li>Użyj kleju, aby połączyć elementy plastikowe w żądanej kolejności obszarów docelowych. Przykład dla elektrod korowych, wzgórzowych, prążkowiowych i prążkowia czarnej pokazano na Rysunku 2B,C.
	<ol>
		<li>Umieść parę elektrod Ctx-VL stroną roboczą do dołu (strona z przewodami elektrod musi być skierowana w dół) i przyklej na górze dwa puste kawałki plastiku o wymiarach 6 mm x 3 mm.</li>
		<li>Na wierzchu trzech elementów plastikowych umieść drugą parę elektrod Ctx-VL elektrodami skierowanymi do góry (użyj mikroskopu i upewnij się, że elektrody VL są wyrównane). 
		UWAGA: Wyrównanie elektrod obustronnych (w tym przypadku wyrównanie lewej i prawej elektrody VL) jest niezbędne do właściwego celowania w pożądane struktury obustronne.</li>
		<li>Użyj kleju, aby przymocować na górze elektrody SNR w odległości 2.0 mm od elektrod VL i ok. 5.0 mm od elektrod korowych (przewody elektrod SNR muszą być skierowane do góry).</li>
		<li>Powtórz krok 2.1.3. dla drugiej strony (przewody elektrod SNR muszą być skierowane na zewnątrz matrycy mikroelektrod).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż żywicę epoksydową wokół plastiku, aby związać elektrody. Unikaj nakładania żywicy epoksydowej bezpośrednio na elektrody.</li>
	<li>Weź gruby drut i zrób pętlę na jednym końcu. Zanurz pętlę w roztworze epoksydowym i połóż ją na plastiku, upewniając się, że gruby drut leży płasko (Rysunek 2D), tak aby w kolejnych krokach drut ten mógł służyć jako uchwyt. Odczekaj do całkowitego wyschnięcia elektrod.</li>
	<li>Przytnij przewody do długości 2 cm, jak pokazano na Rysunku 2E.</li>
</ol>
<img alt="Schemat montażu elektrod; układ do rejestracji sygnałów nerwowych; schemat z wymiarami; przyklejone komponenty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konstrukcja i wymiary mikroelektrod. (A) Cztery pary elektrod powstałe po przecięciu drutów nożyczkami, zgodnie z Rysunkiem 1C (2 pary elektrod Ctx-VL i 2 pary elektrod Str-SNR). Wprowadzenie elektrod do struktur głębokich (VL i SNR) do szklanych rurek i przyklejenie ich podstaw do tworzywa (czerwone kropki). (B) Widok z góry: Pary elektrod z (A) są przyklejane w stosie w celu stworzenia rdzenia mikroelektrody. Czerwone linie oznaczają miejsca przyklejenia. (C) Widok z przodu (B). (D) Do mikroelektrod przymocowano gruby drut. (E) Druty są grupowane zgodnie ze wskazaniami, a izolowane końce są zeskrobane i przycięte do 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
3. Podłączenie mikroelektrod do zestawu słuchawkowego
<ol>
	<li>Pogrupować przewody zgodnie ze wskazówkami na Rysunku 2E i zeskrobać skalpelem 1 mm izolacji z końców.</li>
	<li>Zgiąć elektrody korowe, jak pokazano na Rysunku 3A. Rozdzielić przewody, jak pokazano na Rysunku 3B. Za pomocą precyzyjnej pęsety utworzyć pętlę na końcu każdego przewodu (Rysunek 3B).</li>
	<li>Przytrzymać 10-pinową wtyczkę za pomocą kleszczyków hemostatycznych (patrz Tabela Materiałów) i za pomocą drewnianego końca patyczka higienicznego nanieść minimalne ilości topnika na piny (Rysunek 3C). Należy uważać, aby nie nanieść topnika poza piny, aby zapobiec zwarciu między nimi.</li>
	<li>Za pomocą drewnianego końca patyczka higienicznego nanieść topnik na pętle przewodów.</li>
	<li>Przylutować pętle przewodów do 10-pinowej wtyczki, jak pokazano na Rysunku 3C. Po lutowaniu osuszyć wtyczkę, aby zapobiec zwarciu między pinami.</li>
	<li>Użyć cienkiego przewodu (0.005-0.008 inch) jako przewodu referencyjnego i uziemiającego, a następnie zdjąć plastik z jednego końca. Na drugim końcu przewodu utworzyć pętlę.</li>
	<li>Przylutować odizolowany koniec przewodu referencyjnego i uziemiającego do odpowiednich pinów (Rysunek 3A,C).</li>
	<li>Trzymając gruby przewód (Rysunek 2D), nanieść cement do kranioplastyki wokół mikroelektrod, szczególnie w miejscach połączenia przewodów z pinami. Należy unikać kontaktu cementu z końcówkami elektrod.</li>
	<li>Po wyschnięciu cementu nanieść żywicę epoksydową u podstawy szklanych rurek, na przewody mikroelektrod prążkowiowych oraz na całą elektrodę. Należy unikać kontaktu żywicy epoksydowej z końcówkami elektrod. Odczekać do całkowitego wyschnięcia elektrod.</li>
	<li>Elektrody są gotowe. Wywiercić otwory w czaszce myszy (zgodnie z wymaganymi współrzędnymi stereotaktycznymi) za pomocą wiertła stomatologicznego i zaimplantować wtyczkę, jak pokazano na Rysunku 3D, opuszczając ją tak, aby mikroelektrody były skierowane w stronę czaszki i odpowiednich otworów. W celu stabilizacji podczas implantacji wtyczkę można przymocować do ramienia stereotaktycznego.</li>
</ol>
<img alt="Schemat obustronnych elektrod korowych i zestaw do implantacji w celu rejestracji sygnałów neuronalnych u myszy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63633/63633fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Implantacja mikroelektrod. (A) Elektrody korowe są zginane zgodnie ze wskazówkami. (B) Przewody są rozdzielane w celu utworzenia pętli na końcach. (C) Topnik (w miejscach czerwonych kropek) oraz pętle przewodów są lutowane do 10-pinowej głowicy, z zapewnieniem, że każdy przewód trafia do odpowiedniego pinu. (D) Głowica jest implantowana w celu rejestracji LFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63633/63633fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Oznaczenie lokalizacji elektrody po zakończeniu rejestracji
<ol>
	<li>Po zakończeniu rejestracji LFP potwierdź prawidłowe umieszczenie elektrod w docelowym obszarze, podając prąd na końcówki elektrod w celu wywołania uszkodzenia (lesji), a następnie odczekaj 30 min przed perfuzją myszy. 
	UWAGA: Parametry wywoływania uszkodzenia w celu potwierdzenia lokalizacji końcówek elektrod: pojedyncza seria, 40 µA, jednofazowy impuls prostokątny 0,75 ms, 50 Hz, 30 s.</li>
	<li>Zanurz myszy w narkozie izofluranem (do momentu zaśnięcia zwierzęcia) i przeprowadź perfuzję10 transkardialną za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym sodu. Wykonaj skrawki mózgu (grubości 40 µm) na kriotomie (patrz Tabela materiałów) i zabarw je DAPI (0,02% w PBS). Potwierdź prawidłową lokalizację elektrod na podstawie obecności uszkodzeń po końcówkach elektrod, jak pokazano na Rysunku 4B,C. 
	UWAGA: Stężenie izofluranu należy dobrać zgodnie z wytycznymi danej instytucji.</li>
</ol>
5. Pomiar rezystancji elektrody
<ol>
	<li>Zmierzyć rezystancję elektrod i sprawdzić występowanie zwarcia między nimi za pomocą omomierza wielozakresowego (patrz Tabela materiałów). Ustawić skalę rezystancji na R x 10 000, co oznacza, że jednostkowe wychylenie wskazówki odpowiada rezystancji 1 kΩ. Elektrody o długości 2 cm powinny mieć rezystancję 60-70 kΩ.</li>
	<li>Dostosować zestaw słuchawkowy, pobierając dziesięć pojedynczych pinów (patrz Tabela materiałów). Przylutować każdy pin do cienkiego, wielodrutowego miedzianego przewodu w kablu.
	<ol>
		<li>Wcisnąć przylutowane piny wraz z odpowiadającymi im końcami kabli do 10-pinowego dwurzędowego gniazda sprzęgającego (gniazda pasujące). Wcisnąć otwarte końce pinów gniazda sprzęgającego do zestawu słuchawkowego LFP. W ten sposób każda elektroda LFP ma przypisany przewód kablowy w zestawieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurzyć końcówkę każdej elektrody LFP (której rezystancja ma zostać zmierzona) w 0,9% roztworze soli NaCl (stężenie NaCl we krwi). Połączyć koniec przewodu kablowego odpowiadający elektrodzie LFP z zaciskiem dodatnim omomierza.
	<ol>
		<li>Użyć przewodu o niskiej rezystancji (̴100 Ω), którego jeden koniec znajduje się w roztworze soli, a drugi pozostaje wolny. Połączyć wolny koniec przewodu o niskiej rezystancji z masą wskazówki omomierza. 
		UWAGA: Taki układ zamyka obwód i powoduje wychylenie wskazówki omomierza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnić się, że między żadnymi dwiema elektrodami w zestawie słuchawkowym nie ma połączenia elektrycznego. Sprawdzić izolację elektryczną par elektrod LFP (masa: jeden kabel odpowiada jednej elektrodzie; biegun dodatni: inny kabel odpowiada drugiej elektrodzie). Odrzucić elektrody, jeśli w tym przypadku zaobserwowane zostanie jakiekolwiek wychylenie.</li>
</ol>

<ol><li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents-EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptive+fields+of+single+neurones+in+the+cat%27s+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex.</a> The Journal of Physiology. 148 (3), 574-591 (1959).</li>
<li>O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+units+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Place units in the hippocampus of the freely moving rat.</a> Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).</li>
<li>Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+in+the+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial representation in the entorhinal cortex.</a> Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nature Neuroscience. 7, 446-451 (2004).</li>
<li>Buckmaster, P. S., Edward Dudek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+intracellular+analysis+of+granule+cell+axon+reorganization+in+epileptic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo intracellular analysis of granule cell axon reorganization in epileptic rats.</a> Journal of Neurophysiology. 81 (2), 712-721 (1999).</li>
<li>Driscoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+in+vivo+recording+using+transparent+graphene+microelectrodes+illuminates+spatiotemporal+seizure+dynamics+at+the+microscale%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale.</a> Communications Biology. 4, 1-14 (2021).</li>
<li>Roy, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+retrieval+by+activating+engram+cells+in+mouse+models+of+early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease.</a> Nature. 531, 508-512 (2016).</li>
<li>Igarashi, K. M., Lu, L., Colgin, L. L., Moser, M. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+entorhinal-hippocampal+ensemble+activity+during+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of entorhinal-hippocampal ensemble activity during associative learning.</a> Nature. 510, 143-147 (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Brodovskaya, A., Shiono, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+basal+ganglia+and+indirect+pathway+neurons+during+frontal+lobe+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Activation of the basal ganglia and indirect pathway neurons during frontal lobe seizures.</a> Brain. 144 (7), 2074-2091 (2021).</li>
<li>Ren, X., Brodovskaya, A., Hudson, J. L., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectivity+and+neuronal+synchrony+during+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Connectivity and neuronal synchrony during seizures.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (36), 7623-7635 (2021).</li>
<li>Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+microdrive+arrays+for+chronic+neural+recordings+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50470(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Historycznie rzecz biorąc, układy mikroelektrod były szeroko stosowane do rejestrowania aktywności neuronalnej z określonego obszaru mózgu 2,3,4,5,6,7,8,9,13. Jednak nasza prosta konstrukcja mikroelektrod pozwala na jednoc...

Lokalne potencjały pola (LFP) to potencjały elektryczne rejestrowane z przestrzeni pozakomórkowej w mózgu. Są one generowane przez nierównowagę stężenia jonów poza neuronami i reprezentują aktywność małej, zlokalizowanej populacji neuronów, co pozwala na precyzyjne monitorowanie aktywności określonego obszaru mózgu w porównaniu z zapisami EEG w makroskali1. Szacuje się, że mikroelektrody LFP oddalone od siebie o 1 mm odpowiadają dwóm zupełnie różnym populacjom neuronów. Podczas gdy sygnał EEG jest filtrowany przez tkankę mózgową, płyn mózgowo-rdzeniowy, czaszkę, mięśnie i skórę, sygnał LFP jest wiarygodnym markerem lokalnej aktywności neuronalnej1.
Badacze często muszą jednocześnie rejestrować LFP z kilku struktur mózgu, ale komercyjnie dostępne układy mikroelektrod często nie oferują takiej elastyczności. W tym przypadku obecny protokół opisuje w pełni konfigurowalne, łatwe do skonstruowania mikroelektrody do jednoczesnego rejestrowania LFP z dowolnego pożądanego obszaru mózgu na różnych głębokościach. Chociaż LFP są szeroko stosowane do rejestrowania aktywności neuronalnej określonego regionu mózgu2,3,4,5,6,7,8,9, obecny, łatwy do dostosowania projekt pozwala na nagrywanie LFP z dowolnej wielu powierzchownych lub Głębokie regiony mózgu11,12. Protokół można również zmodyfikować w celu skonstruowania dowolnej pożądanej matrycy mikroelektrod, określając współrzędne stereotaktyczne regionów mózgu i odpowiednio składając matrycę. Te mikroelektrody o częstotliwości próbkowania 10 kHz i rezystancji 60-70 kΩ (2 cm długości) pozwalają nam rejestrować LFP z milisekundową precyzją. Dane mogą być następnie wzmacniane przez 16-kanałowy wzmacniacz, filtrowane (dolnoprzepustowy 1 Hz, górnoprzepustowy 5 kHz) i digitalizowane.

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz 16-kanałowy</td><td>system AM</td><td>Model 3600</td><td>Wzmacniacz</td></tr><tr><td>Cement do kranioplastyki</td><td>Coltene</td><td>Perm Reeline/Repair Resin Typ II Klasa I Odcień - Przezroczysty</td><td>Cement do przechowywania mikroelektrod</td></tr><tr><td>Mikrotom Kriostatu</td><td>Precyzyjny</td><td>CF-6100</td><td>Do krojenia mózgu</td></tr><tr><td>Drut niklowo-chromowy pokryty Diamel</td><td>Johnson Matthey Inc.</td><td>50 &mikro; m</td><td>Drut mikroelektrodowy</td></tr><tr><td>Dremel Dremel</td><td></td><td>Seria 300</td><td>Do wiercenia otworów w czaszce myszy</td></tr><tr><td>Epoksyd</td><td>CEC Corp</td><td>C-POXY 5</td><td>Klej szybkowiążący</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Do trzymania zestawu słuchawkowego</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Do trzymania mikroelektrod</td></tr><tr>Mikroskop<td>świetlny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10</td><td>Aby zobaczyć wyrównanie</td></tr><tr><td>Omomierz</td><td>Dowolna</td><td></td><td>do pomiaru rezystancji</td></tr><tr><td>Pny (nagłówki i pasujące gniazda)</td><td>Mill-Max</td><td>Interkonekty, seria 833, 2 mm siatka mewa skrzydło mewa do montażu powierzchniowego Nagłówki i gniazda</td><td>Do mocowania mikroelektrod do</td></tr><tr><td>zestawu rurek Polymicro</td><td>Neuralynx</td><td>ID 100 &plusmn; 04 &micro; m, OD 164 &plusmn; 06 &mikro; m, grubość powłoki 12 i mikro; m</td><td>Rurki szklane</td></tr><tr><td>Stymulator impulsów</td><td>Systemy AM</td><td>Model 2100</td><td>Aby oznaczyć położenie mikroelektrody na końcu nagrań</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Dowolne</td><td></td><td>Do cięcia mikroelektrod</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Gorilla</td><td></td><td>Adhesive</td></tr><tr><td>Gruby drut 0,008 cala &ndash; 0,011 cala</td><td>AM Systems</td><td>791900</td><td>Drut kleszczowy do przytrzymywania układu mikroelektrod</td></tr><tr><td>Cienki drut 0,005 cala - 0,008 cala</td><td>AM Systems</td><td>791400</td><td>Cienki przewód do odniesienia i uziemienia</td></tr></tbody></table>

budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Construction of Local Field Potential Microelectrodes for in vivo Recordings from Multiple Brain Structures Simultaneously

Badacze często muszą rejestrować lokalne potencjały pola (LFP) jednocześnie z kilku struktur mózgu. Nagrywanie z wielu pożądanych obszarów mózgu wymaga różnych konstrukcji mikroelektrod, ale dostępne na rynku układy mikroelektrod często nie oferują takiej elastyczności. W tym przypadku obecny protokół nakreśla prostą konstrukcję niestandardowych układów mikroelektrod do rejestrowania LFP z wielu struktur mózgu jednocześnie na różnych głębokościach. W pracy opisano jako przykład budowę obustronnych mikroelektrod korowych, prążkowiowych, brzuszno-bocznych wzgórzowych i nikralnych. Nakreślona zasada projektowania zapewnia elastyczność, a mikroelektrody można modyfikować i dostosowywać do rejestrowania LFP z dowolnej struktury, obliczając współrzędne stereotaktyczne i szybko zmieniając odpowiednio konstrukcję, aby celować w różne obszary mózgu u swobodnie poruszających się lub znieczulonych myszy. Montaż mikroelektrod wymaga standardowych narzędzi i materiałów eksploatacyjnych. Te niestandardowe matryce mikroelektrod umożliwiają badaczom łatwe projektowanie układów mikroelektrod w dowolnej konfiguracji w celu śledzenia aktywności neuronalnej, zapewniając nagrania LFP z rozdzielczością milisekundową.

W niniejszej pracy mikroelektrody LFP wykorzystano do mapowania rozprzestrzeniania się napadu drgawkowego poprzez jądra podstawy11. Symultaniczne rejestracje LFP przeprowadzono z prawej kory przedmotorycznej (gdzie znajdowało się ognisko napadu) oraz z lewego VL, prążkowia i SNR (Rycina 4). Początek napadu zidentyfikowano jako odchylenie śladu napięcia co najmniej dwukrotnie przekraczające linię bazową (Rycina 4A, czerwona strzałka). Wykr...

Obecny protokół opisuje konstrukcję specjalnie wykonanych układów mikroelektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie.

Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Researchers often need to record local field potentials (LFPs) simultaneously from several brain structures. Recording from multiple desired brain regions ...

Naukowcy często muszą rejestrować lokalne potencjały pola z wielu struktur jednocześnie. Nasza prosta konstrukcja mikroelektrod pozwala nam rejestrować LFP z kilku struktur mózgu na różnych głębokościach jednocześnie. Dostępne na rynku mikroelektrody często nie są elastyczne i nie pozwalają na zapis z wielu struktur mózgu.Nasza konstrukcja mikroelektrody pozwala na łatwą modyfikację konstrukcji tak, aby pasowała do dowolnej pożądanej konstrukcji. Zacznij od wzięcia drutu niklowo-chromowego pokrytego dianalem o średnicy 50 mikrometrów. Przyklej jeden koniec drutu do tylnej części platformy i owiń drut trzy razy wokół najbliższego pokrętła na platformie.Rozciągnij drut wokół najdalszego drugiego pokrętła, aby utworzyć dwie pętle między pokrętłami. Owiń drut jeszcze trzy razy wokół pierwszego pokrętła, aby zamocować drut na miejscu i przyklej koniec z tyłu platformy. Umieść pręty napinające pod drutami z owiniętą wokół nich taśmą.Za pomocą mikroskopu i cienkich kleszczyków wykonaj trzymilimetrową przerwę między drutami, aby wykonać mikroelektrody korowe, brzuszno-boczne, jądra wzgórza lub 4,5-milimetrową szczelinę, aby wykonać mikroelektrody prążkowiowo-nidrowe. Jeśli w mikroskopie używane jest powiększenie, należy obliczyć i dostosować różnicę powiększenia do rzeczywistej odległości między przewodami. Wytnij cztery małe kawałki plastiku o grubości 0,5 milimetra o szerokości około sześciu milimetrów i wysokości trzech milimetrów.Nałóż klej na plastik. Umieść plastikowe kawałki w odległości około jednego centymetra od środka drutu, który jest oddalony o jeden centymetr od pręta napinającego. Usuń nadmiar kleju bawełnianym wacikiem.Po wyschnięciu kleju przetnij drut drobnymi nożyczkami. Wytnij cztery siedmiomilimetrowe szklane rurki za pomocą dostępnego w handlu zestawu i włóż drut elektrody do szklanych rurek. Umieść klej u podstawy szklanych rurek, aby połączyć je z plastikiem.Poczekaj, aż klej wyschnie, a następnie przetnij szklane rurki i druty za pomocą skalpela. Użyj super kleju, aby przymocować tworzywa sztuczne w żądanej kolejności obszarów docelowych. Nałóż żywicę epoksydową na plastik, aby związać ze sobą elektrody.Weź gruby drut i zrób pętlę na jednym końcu, zanurz pętlę w roztworze żywicy epoksydowej i umieść ją na plastiku, upewniając się, że gruby drut leży płasko, aby ten drut mógł służyć jako uchwyt. Przytnij drut na dwa centymetry. Pogrupuj druty i zeskrob jeden milimetr izolowanych końców skalpelem.Zegnij elektrody korowe i oddziel przewody. Za pomocą drobnych kleszczy wykonaj pętlę na końcu każdego drutu. Trzymaj 10-pinowy zestaw słuchawkowy z hemostatem i użyj drewnianej końcówki bawełnianego wacika, aby nałożyć minimalną ilość topnika na szpilki.Za pomocą drewnianej końcówki bawełnianego wacika nałóż topnik na pętle z drutu. pętle przewodów do 10-pinowego zestawu słuchawkowego. Wysusz zestaw słuchawkowy, aby zapobiec zwarciu między stykami.Weź cienki drut o długości około 0,05 do 0,008 cala jako przewody odniesienia i uziemienia i zdejmij plastik z jednego końca. Zrób pętlę na drugim końcu drutu. odizolowaną stronę przewodów odniesienia i uziemienia do odpowiednich pinów.Trzymając gruby drut, nałóż cement do kranioplastyki wokół mikroelektrod, zwłaszcza w miejscu, w którym druty łączą się z kołkami. Unikaj dotykania właściwych końców elektrody cementem. Po wyschnięciu cementu umieść żywicę epoksydową u podstawy szklanych rurek, drutów mikroelektrod prążkowia i wokół całej elektrody.Unikaj dotykania końców elektrod żywicą epoksydową. Zapisy potencjału pola lokalnego wykonano z prawej kory przedruchowej, lewego VL, prążkowia i SNR. Początek napadu stwierdzono jako odchylenie ścieżki napięcia co najmniej dwukrotnie w stosunku do wartości podstawowej.Wykres widma mocy przedstawia rozkład częstotliwości dla zarejestrowanych lokalnych nagrań potencjału. Opóźnienia początku napadu można było porównać między każdą strukturą z dokładnością do milisekundy. Na końcu nagrań zastosowano impuls prądowy, aby zaznaczyć i potwierdzić położenie końcówek elektrod tworzących zmianę.Jeśli mikroelektrody są skonstruowane dla różnych struktur mózgu, pamiętaj, aby zmodyfikować przerwy między przewodami zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi pożądanej struktury. Umieść elektrody o głębokiej strukturze w szklanych rurkach i wyreguluj długości mikroelektrod. Następnie przymocuj tworzywa sztuczne w wymaganej kolejności.

construction-local-field-potential-microelectrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Fundamentalnym problemem w naszym rozumieniu obwodów korowych jest sposób, w jaki sieci w różnych warstwach kory kodują informacje sensoryczne. W niniejszej pracy opisujemy techniki elektrofizjologiczne z wykorzystaniem wielokontaktowych elektrod laminarnych do rejestracji pojedynczych jednostek oraz potencjałów polowych (LFP) i przedstawiamy analizy służące do identyfikacji warstw kory.

Badanie przetwarzania w lokalnych sieciach za pomocą rejestracji z zastosowaniem wielokontaktowych elektrod laminarnych

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Ten film demonstruje in vivo rejestrację potencjału lokalnego pola (LFP) z obustronnych obszarów M2 mózgu myszy. Znieczulona mysz jest zabezpieczona i przygotowana do zabiegu. Aby zarejestrować LFP, należy wprowadzić mikroelektrody do docelowych współrzędnych obustronnych obszarów M2, które są odpowiedzialne za złożone ruchy motoryczne.

Rejestracja potencjału pola lokalnego z obu półkul mózgu myszy

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Ten film demonstruje procedurę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i lokalnych potencjałów pola (LFP) u znieczulonego szczura. Proces polega na przygotowaniu szczura i przymocowaniu elektrod stymulujących do jego opuszków wąsów. Elektroda pająka EEG jest umieszczana na czaszce szczura w celu powierzchniowych pomiarów EEG. W tym samym czasie wielokanałowa mikroelektroda jest wprowadzana do określonego obszaru mózgu przez otwór w czaszce, aby rejestrować...

Równoczesne zapisy potencjału elektroencefalograficznego i lokalnego potencjału pola u znieczulonego szczura

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Tutaj prezentujemy unikalny, drukowalny w 3D implant dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie.

TD Drive: parametryczny implant o otwartym kodzie źródłowym do wieloobszarowych zapisów elektrofizjologicznych u zachowujących się i śpiących szczurów

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Poznaj metodę budowy mikroelektrod do równoczesnych nagrań potencjałów lokalnego pola z wielu struktur mózgu in vivo. Ta elastyczna konstrukcja umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Przeglądaj więcej filmów