Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

PCLS wspomaga ocenę aktywności komórek mięśni gładkich dróg oddechowych i naczyń krwionośnych w prawie nienaruszonym środowisku tkankowym, zapewniając w ten sposób nieoceniony model ex vivo do badań płuc. Jeśli chodzi o badania nad mięśniami gładkimi, precyzyjnie wycięte plastry płuc zachowują fenotyp in vivo komórek mięśni gładkich i ich interakcję z otaczającymi strukturami, umożliwiając jednocześnie dostęp do komórek mięśni gładkich, co jest ważne dla badań mechanistycznych na poziomie komórkowym. Na początek umieść ciało myszy na desce sekcyjnej w pozycji leżącej.

Przygnij ogon, przednie łapy i głowę igłami strzykawkowymi 25G i zdezynfekuj ciało 70% etanolem. Ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej wzdłuż mostka i obustronnej dolnej klatki piersiowej powyżej przepony. Następnie skieruj ostrą końcówkę nożyczek z dala od tkanki płucnej i usuń część obustronnych brzusznych klatek piersiowych, aby odsłonić serce.

Obserwuj, że płaty płuc zapadają się, gdy otwiera się jama klatki piersiowej. Użyj nożyczek, aby usunąć tkankę miękką z szyi myszy, aby odsłonić tchawicę. Na górnym końcu tchawicy wykonaj mały otwór o średnicy 1,2 milimetra, który powinien umożliwić przejście końcówki cewnika dożylnego w kształcie litery Y o pojemności 20 G.

Połącz jeden port adaptera cewnika w kształcie litery Y z 3-mililitrową strzykawką napełnioną 0,5 mililitra powietrza, a drugi port z 3-mililitrową strzykawką napełnioną 2 mililitrami 1,5% roztworu agarozy podgrzanego do 42 stopni Celsjusza. Wstrzyknąć roztwór agarozy, aby napełnić cewnik, a następnie wepchnąć cewnik przez otwór do tchawicy na 5 do 8 milimetrów. Powoli wstrzykiwać roztwór agarozy w ilości 1 mililitra na 5 sekund.

Obserwuj, że płuco rozszerza się wzdłuż osi bliższej do dystalnej. Wstrzyknięcie należy przerwać, gdy krawędź każdego płata płuca jest napompowana. Następnie wstrzyknij od 0,2 do 0,3 mililitra powietrza z drugiej strzykawki, aby wepchnąć pozostałą agarozę do przewodzących dróg oddechowych do dystalnej przestrzeni pęcherzyków płucnych.

Clip zamknął tchawicę parą zakrzywionych kleszczy hemostatycznych. Aby wypełnić naczynia płucne, napełnij 1 mililitrową strzykawkę ciepłą 6% żelatyną i podłącz ją do cewnika do żył głowy z igłą. Napełnij cewnik roztworem żelatyny, a następnie nakłuj igłą prawą komorę w pobliżu dolnej ściany.

Wbij igłę na 2 do 3 milimetrów do prawej komory i skieruj końcówkę igły do głównej tętnicy płucnej. Wstrzyknąć powoli około 0,2 mililitra roztworu żelatyny do prawej komory i naczyń tętnic płucnych. Trzymać igłę na miejscu przez pięć minut po wstrzyknięciu i schłodzić płaty płuc, wylewając lodowaty roztwór HBSS na serce i płuca, a następnie umieścić ciało w lodówce.

Po tym kroku usuń nożyczkami płuco i serce myszy z otaczających tkanek łącznych. Następnie oddziel każdy płat płuca i trzymaj je w roztworze HBSS na lodzie. Przyciąć płatek płuca i ustawić go tak, aby kierunek cięcia był prostopadły do większości dróg oddechowych od wnęki do powierzchni płuc

Przymocuj go do kolumny próbki za pomocą super kleju. Użyj wibratomu ze świeżą, cienką żyletką, aby pokroić płat płuca na plastry o grubości 150 mikrometrów. Zbierz plastry na sterylnych szalkach Petriego wypełnionych zimnym roztworem HBSS.

Przenieś plastry na szalki Petriego wypełnione pożywką DMEM/F-12. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc przed eksperymentami. Umieść pojedynczy precyzyjnie pokrojony plasterek płuc w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej wypełnionej HBSS.

Zlokalizuj plasterek na środku studzienki, a następnie usuń roztwór HBSS za pomocą pipety. Pod mikroskopem znajdź docelową drogę oddechową i naczynie w plastrze, a następnie przykryj je nylonową siatką z wyciętym centralnym otworem, aby odsłonić docelowy obszar naczynia oddechowego. Umieść pustą metalową podkładkę na siatce, aby utrzymać plastry na miejscu.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów roztworu HBSS, aby zanurzyć plastry. Po 10 minutach nagraj obrazy linii bazowej. Aby wywołać skurcz dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, ostrożnie usuń roztwór HBSS za pomocą pipety i dodaj 600 mikrolitrów HBSS z agonistą.

Aby przygotować bufor ładujący barwnik wapniowy, najpierw rozpuść 50 mikrogramów barwnika w 10 mikrolitrach DMSO i 0,2 grama proszku Pluronic F-12 w 1 mililitrze DMSO. Wymieszaj 10 mikrolitrów roztworu Pluronic z 10 mikrolitrami roztworu barwnika wapniowego. Dodaj tę mieszaninę do 2 mililitrów roztworu HBSS zawierającego 200 mikromolów sulfobromoftaleiny.

Następnie umieść 15 precyzyjnie pokrojonych plastrów płuc w 2 mililitrach buforu ładującego wapń i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie inkubuj w HBSS zawierającym 100 mikromolowych sulfobromoftaleiny przez 30 minut. Następnie umieść plastry obciążone barwnikiem wapniowym na dużym szkle nakrywkowym. Napełnij wysokopróżniową naprężoną smarem silikonowym w 3-mililitrowej strzykawce przymocowanej do igły 18G lub końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i narysuj dwie równoległe linie w poprzek szkła nakrywkowego, powyżej i poniżej plasterka.

Przykryj plasterek nylonową siatką między dwiema liniami smaru. Umieść drugą szklankę nakrywkową na wierzchu siatki, aby wygenerować komorę. Dodać HBSS lub roztwór agonisty do komory z jednego końca za pomocą pipety.

Usuń płyn z komory, odsysając z drugiego końca bibułę. Komora plastra jest teraz gotowa do obrazowania wapnia za pomocą szybkiego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wiązki tętnic płucnych dróg oddechowych obserwowano w precyzyjnie wyciętych wycinkach płuc o grubości 150 mikrometrów pod mikroskopem z kontrastem fazowym.

W stanie spoczynku droga oddechowa została zidentyfikowana przez prostopadłościenne komórki nabłonkowe z pobliską tętnicą płucną. Po ekspozycji na metacholinę obszar światła uległ zmniejszeniu, podczas gdy tętnica płucna nie wykazywała odpowiedzi na bodźce. Reakcje skurczowe dróg oddechowych określono ilościowo za pomocą procentowego zmniejszenia powierzchni światła i wykazano podobne odpowiedzi zależne od dawki w posiewach jednodniowych i pięciodniowych.

Po dotarciu do obwodowego pola płuc przewodzące drogi oddechowe rozgałęziają się na drogi oddechowe i worki otaczające małe tętniczki wewnątrzgroniaste. Po wystawieniu na śródbłonek zarówno drogi oddechowe, jak i tętnice płucne zwężają się, po czym następuje relaksacja wywołana przez NOC-5. W stanie spoczynku plastry obciążone barwnikiem wapnia wykazywały niską fluorescencję w komórkach mięśni gładkich dróg oddechowych i układu naczyniowego pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.

Po ekspozycji na agonistów intensywność fluorescencji wapnia wzrosła w komórkach i rozchodziła się do całej komórki, co korelowało z sygnałami oscylacyjnymi. Ze względów technicznych ważne jest, aby napompować płuca agarozą równomiernie i unikać szybkiego lub nadmiernego wstrzykiwania agarozy. Zawsze wciskaj powietrze na końcu, aby wypłukać agarozę z przewodzących dróg oddechowych do dystalnej przestrzeni pęcherzyków płucnych.

Podsumowując, korzystając z precyzyjnie wyciętych plastrów płuc, można zapewnić szczególną różnorodność funkcji mięśni gładkich płuc i modelować deregulację mięśni gładkich in vitro. Stanowi również idealną platformę do badań przesiewowych leków rozszerzających naczynia krwionośne lub oskrzela.