Demonstracja narzędzia do dopasowywania sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków w celu szybkiej oceny zachowania białek

W kontekście bezpieczeństwa chemicznego, protokół SeqAPASS zapewnia szybki i sprawny proces oceny zachowania białek w różnych gatunkach, w celu ekstrapolacji zarówno toksyczności, jak i wiedzy na temat szlaków biologicznych. SeqAPASS został opracowany jako uproszczony, przejrzysty i przyjazny dla użytkownika interfejs internetowy do szybkiej ekstrapolacji międzygatunkowej, przeznaczony do użytku zarówno przez badaczy, jak i decydentów. Narzędzie jest odpowiedzią na wyzwanie polegające na ekstrapolacji wiedzy na temat toksyczności chemicznej przy użyciu dostępnych informacji na temat wrażliwości gatunków, aby konsekwentnie przewidywać podatność chemiczną setek lub tysięcy gatunków, której nigdy nie można było przetestować w warunkach laboratoryjnych.

Aby rozpocząć pracę z narzędziem SeqAPPASS, najpierw przejdź do seqapass.epa.gov. Obecni użytkownicy mogą wybrać przycisk logowania do swojego konta. Nowi użytkownicy mogą utworzyć konto, wybierając link na stronie głównej.

Po zalogowaniu się do narzędzia SeqAPASS przejdź do zakładki Request SeqAPASS Run. SeqAPASS zawiera kilka pomocnych zasobów, które pomogą użytkownikom zidentyfikować cel białka zapytania. Dostęp do nich można uzyskać, klikając przyciski rozwijane w obszarze Zidentyfikuj docelowe białko.

Po zidentyfikowaniu docelowego białka kliknij opcję Według gatunku lub Według akcesji w obszarze Porównaj sekwencje aminokwasów pierwszorzędowych. Na przykład, aby przeanalizować zachowanie receptora opioidowego mu, kliknij opcję Według akcesji i wprowadź numer dostępu w polu akcesji białka. O ile akcesja białka nie została już zidentyfikowana przez użytkownika, zalecana jest opcja wyszukiwania gatunków.

Wybierz pozycję Zażądaj uruchomienia , aby zainicjować zapytanie. Po przesłaniu zapytania wybierz kartę SeqAPASS Run Status w górnej części strony, aby wyświetlić stan przesłanego przebiegu. Czas do zakończenia będzie zależał od aktualnego użycia narzędzia.

W zakładce Wyświetl raporty SeqAPASS znajdują się wszystkie uruchomienia przeprowadzone w ramach danego konta. Wybierz opcję Wyświetl raport, aby wyświetlić dane w przeglądarce internetowej, a następnie kliknij przycisk Zażądaj wybranego raportu, aby otworzyć stronę poziomu pierwszego Informacje o białku zapytania oraz wyświetlić wyniki i opcje dostosowywania danych. Aby opracować i uruchomić analizę SeqAPASS poziomu drugiego, oceniającą zachowanie określonych domen białkowych, kliknij znak plus obok nagłówka poziomu drugiego na stronie Informacje o białku zapytania poziomu pierwszego, aby wypełnić menu zapytania poziomu drugiego.

Kliknij pole Wybierz domenę, aby wypełnić listę domen funkcjonalnych dla białka zapytania. Po zidentyfikowaniu domeny w bazie danych NCBI Conserved Domain Database i wybraniu jej z listy rozwijanej SeqAPASS zainicjuj zapytanie poziomu drugiego. W tym celu należy kliknąć przycisk Request Domain Run (Uruchom żądać uruchomienia domeny).

Kliknij pozycję Odśwież przebiegi poziomu drugiego i trzeciego, aby wypełnić dane poziomu drugiego. W obszarze Wyświetl dane poziomu drugiego kliknij pole wyboru ukończonej domeny, aby wybrać ukończone akcesjonowanie domeny. Następnie możesz kliknąć przycisk Wyświetl dane drugiego poziomu, aby otworzyć wyniki.

Dane są wyświetlane w zakładce View SeqAPASS dla wybranego poziomu, najpierw spójrzmy na dane poziomu pierwszego. Na stronie Query Protein Information (Zapytanie o informacje o białku) wybierz przycisk radiowy obok raportu podstawowego lub pełnego, aby wyświetlić dane w formacie skondensowanym lub rozszerzonym. Gatunki będą miały prognozę podatności na tak lub nie, wskazując, czy białko jest konserwatywne w stosunku do sekwencji zapytania.

W raporcie kliknij odpowiedni identyfikator dostępu do białka lub gatunku, aby połączyć się z bazami danych NCBI i uzyskać dostęp do dalszych informacji. Aby zapoznać się z odpowiednimi danymi dotyczącymi toksyczności dla gatunków z prognozami wrażliwości, przewiń w prawą stronę tabeli wyników, aby wyświetlić kolumnę ECOTOX. Kliknij łącza, aby otworzyć dane gatunki w bazie wiedzy EKOTOKSIKOLOGIA, w której można znaleźć dane dotyczące toksyczności Oprócz raportów pełnych i podstawowych, raport podsumowujący dane można wyświetlić, wybierając opcję Wyświetl raport podsumowujący poziomu pierwszego.

Raport podsumowujący zawiera metryki podsumowujące i przewidywania podatności w grupach taksonomicznych. Dane w dowolnym formacie raportu można łatwo pobrać. Po wybraniu żądanego typu raportu kliknij przycisk Pobierz tabelę, aby zapisać go jako plik arkusza kalkulacyjnego.

Aby wyświetlić dane poziomu drugiego, przewiń do góry karty Wyświetl SeqAPASS i wybierz opcję Poziom drugi. Dane SeqAPASS poziomu drugiego są wyświetlane w raportach, takich jak raport poziomu pierwszego, i są również dostępne u dołu strony Zapytanie o informacje o białku. Wybierz pole opcji obok pożądanego typu raportu, aby wyświetlić dane.

Raporty poziomu drugiego wyświetlają informacje podobne do tych z poziomu pierwszego, z dodatkowymi informacjami na temat domeny białkowej. Dane SeqAPASS można łatwo wizualizować, aby ułatwić interpretację. Kliknij znak plus obok pozycji Wizualizacja, a następnie przycisk Wizualizuj dane, aby otworzyć interaktywny wykres skrzynkowy w nowej karcie.

Na nowej karcie wybierz przycisk BoxPlot. W górnej części strony BoxPlot znajdują się opcje formantu, które mogą pomóc użytkownikowi w dostosowaniu wykresu. Użytkownicy mogą dodawać lub usuwać grupy taksonomiczne z wykresu, wybierać gatunki do wyświetlenia w legendzie, wybierać sposób wyświetlania nazw gatunków i wyróżniać określone podzbiory gatunków, takie jak gatunki zagrożone lub zagrożone.

Wizualizacje można łatwo eksportować i zapisywać. Kliknij przycisk Pobierz BoxPlot, aby wybrać typ pliku i pobrać rysunek. Przed pobraniem użytkownicy mogą dostosować rozdzielczość typu pliku obrazu.

Mimo że domyślne ustawienia raportu są wystarczające dla większości analiz, parametry można zmieniać za pomocą podmenu w górnej części menu Query Protein Information. Aby zarejestrować ustawienia bieżącego raportu, kliknij przycisk Pobierz ustawienia bieżącego raportu, aby pobrać plik z zastosowanymi bieżącymi ustawieniami. Można to zrobić dla poziomu pierwszego i drugiego.

Tutaj przykład dotyczy poziomu pierwszego. Aby zainicjować analizę SeqAPASS poziomu trzeciego, przejdź do strony Informacje o białku zapytania poziomu pierwszego i kliknij znak plus obok nagłówka poziomu trzeciego, aby wypełnić menu zapytania poziomu trzeciego, które umożliwia porównania reszt aminokwasowych poszczególnych poziomów. Zanim będzie można przeprowadzić analizę poziomu trzeciego, należy zidentyfikować specyficzne reszty aminokwasowe poprzez przegląd istniejącej literatury.

Kliknij znak plus obok Eksploratora odwołań, aby otworzyć narzędzie Eksplorator odwołań. Może to pomóc w wygenerowaniu wstępnie zdefiniowanego ciągu logicznego w celu wykonywania zapytań dotyczących dostępnej literatury. Kliknij link Generuj Google Scholar, aby wygenerować ciąg wyszukiwania literatury.

Można go skopiować i wykorzystać do przeszukiwania żądanych baz danych literatury. Wybranie opcji Szukaj w Google Scholar spowoduje automatyczne przeszukanie literatury Google Scholar przy użyciu wstępnie zdefiniowanego ciągu wyszukiwania. Po wybraniu reszt aminokwasowych użytkownicy mogą skonfigurować analizę poziomu trzeciego.

Wybierz sekwencję szablonu, do której wybrane przez użytkownika gatunki zostaną wyrównane i porównane. Opcjonalnie można wprowadzić dodatkowe sekwencje szablonów w polu Dodatkowe porównania. Przed wyrównaniem określonych sekwencji użytkownicy muszą wprowadzić zdefiniowaną przez użytkownika nazwę przebiegu.

Zostanie to użyte do identyfikacji przebiegu. Wybierz grupę taksonomiczną w polu Wybierz grupę taksonomiczną. Należy zauważyć, że proces ten zostanie powtórzony dla wszystkich grup taksonomicznych, dla których użytkownik chciałby dokonać oceny pod kątem ochrony.

Po wybraniu wszystkich żądanych gatunków do wyrównania do sekwencji szablonu, wybierz opcję Zażądaj przebiegu pozostałości. Po wyrównaniu wszystkich gatunków kliknij przycisk Odśwież przebiegi poziomu drugiego i trzeciego, aby wypełnić menu Wybierz nazwę uruchomienia poziomu trzeciego ukończonymi zadaniami poziomu trzeciego. Dane poziomu trzeciego mogą być przeglądane według poszczególnych grup taksonomicznych lub wielu grup taksonomicznych.

Kliknij przycisk Połącz dane poziomu trzeciego, aby otworzyć okno dialogowe połączonego poziomu trzeciego i jednocześnie analizować wiele grup taksonomicznych. Korzystając z okna dialogowego Łączenie raportów poziomu trzeciego, wybierz szablon poziomu trzeciego, który ma zostać użyty jako podstawa porównania. Następnie wybierz ukończone zadania do porównania.

Uporządkuj zadania poziomu trzeciego zgodnie z potrzebami i kliknij przycisk Wyświetl dane poziomu trzeciego, aby utworzyć stronę raportu poziomu trzeciego. Na stronie Informacje o białku matrycy poziomu trzeciego wyświetlane są wcześniej zidentyfikowane pozycje aminokwasów z sekwencji matrycy, które można wybrać do wyrównania. Wprowadź pozycje w polu tekstowym, oddzielając je przecinkami lub alternatywnie wybierz z listy pozostałości.

Po wprowadzeniu wszystkich pozycji wybierz opcję Kopiuj do listy pozostałości, aby przenieść pozostałości do pola wyboru. Po wybraniu wszystkich pozycji aminokwasów i sprawdzeniu ich dokładności kliknij przycisk Aktualizuj raport, aby zaktualizować wyrównane sekwencje z określonymi pozycjami. Przewiń do dołu strony, aby wyświetlić raport z wynikami.

Podobnie jak w przypadku poprzednich poziomów, wybierz przycisk radiowy obok raportu podstawowego lub pełnego, aby wybrać typ raportu. Raporty poziomu trzeciego przedstawiają podobne gatunki i białka oraz zawierają informacje o dopasowaniu i ochronie dla każdej ocenianej reszty aminokwasowej. Aby zapisać raport, kliknij przycisk Pobierz tabelę u dołu raportu i zapisz go jako plik arkusza kalkulacyjnego.

Użytkownicy mogą również wybrać opcję Wyświetl raport podsumowujący poziomu trzeciego, aby wyświetlić i pobrać tabelę raportu podsumowania. Aby wyświetlić wizualizację dla danych poziomu trzeciego, kliknij znak plus obok nagłówka wizualizacji i wybierz opcję Wizualizuj dane, aby otworzyć nową stronę. Kliknij przycisk Mapa skupień na stronie informacji o wizualizacji, aby otworzyć interaktywną grafikę i kontrolki.

Na stronie wizualizacji w obszarze Kontrolki wybierz grupy taksonomiczne, które mają być wyświetlane na mapie cieplnej, przenieś je za pomocą przycisku strzałki i w razie potrzeby zmień ich kolejność. Domyślnie wizualizacja mapy cieplnej wyświetla nazwę zwyczajową gatunku, ogólne prognozy podatności oraz stan dopasowania każdej reszty aminokwasowej. Opcje manipulowania ustawieniami mapy skupień znajdują się w rozwijanych menu pod nagłówkiem Kontrola.

W obszarze Opcje raportu można wybrać prosty lub pełny raport, a wyświetlane gatunki można przełączać między nazwami zwyczajowymi lub naukowymi. W obszarze Selekcje opcjonalne można wybrać i wyróżnić na mapie skupień podzbiory gatunków, takie jak kandydaci na ortologów, gatunki zagrożone, gatunki zagrożone i typowe organizmy modelowe. W obszarze Ustawienia mapy skupień informacje wyświetlane na mapie skupień można dostosować, usuwając zaznaczenie i zaznaczając pola.

Przewidywania podatności i tekst podatności można usunąć, a wyrównania aminokwasów i informacje o aminokwasach można usunąć. Aby zapisać wizualizację mapy cieplnej, kliknij przycisk Pobierz mapę skupień i wybierz żądany typ pliku. SeqAPASS zawiera raport podsumowujący decyzje, który pozwala użytkownikom szybko ocenić przewidywania podatności na różnych poziomach i gatunkach jednocześnie.

Kliknięcie opcji Przenieś poziom do raportu DS na stronie wyników lub wizualizacji danych spowoduje przeniesienie danych do zakładki Raport DS, gdzie można połączyć i wyświetlić wszystkie poziomy analiz. Wyniki analizy pierwszego poziomu dla receptora opioidowego mu pokazują granicę wrażliwości wynoszącą 55%, przy czym procentowe podobieństwa dla ssaków, ptaków,, i większości gatunków ryb mieszczą się powyżej tego progu i otrzymują prognozę podatności Tak. Te pola całkowicie poniżej granicy otrzymują prognozę podatności na nie.

Analiza poziomu drugiego dla domeny funkcjonalnej opioidów mu zidentyfikowała wyższą granicę podatności wynoszącą 88% podobieństwo do ssaków, ptaków,, i większości gatunków ryb powyżej tej granicy, dostarczając kolejnej linii dowodów na ochronę lub receptora opioidowego mu u kręgowców. W ramach analizy na poziomie trzecim wszystkie oceniane gatunki dały prognozę podatności twierdzącą. Ponieważ aminokwasy te odgrywają ważną rolę w wiązaniu zarówno silnych agonistów receptora opioidowego mu, jak i silnych antagonistów, dane te sugerują, że związki opioidowe skierowane do receptorów ludzkich mogą wchodzić w podobne interakcje z receptorami u różnych gatunków kręgowców.

Trzeci poziom SeqAPASS jest przydatny do generowania hipotez. Nawet jeśli krytyczne reszty aminokwasowe nie są znane dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, narzędzie może być wykorzystane do przyjrzenia się gatunkom i określenia, gdzie istnieje ochrona lub gdzie jest ona mniej konserwowana. Hipotezy te można następnie przetestować za pomocą technik biologii molekularnej, takich jak badania mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.

Początkowo projekt SeqAPASS koncentrował się na celach chemicznych. Jednak nasze badania rozszerzają się o pierwotne enzymy metabolizujące, białka transportowe, a także białka biorące udział w bioakumulacji.