Name: Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego z ludzkiej tkanki tłuszczowej w celu badania ich wzajemnych oddziaływań z adipocytami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni Wydziałowi Nauk Biologicznych (University of Leeds, Wielka Brytania) za korzystanie z urządzenia do cytometrii przepływowej, które było wspierane przez grant Rady ds. Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC BB/R000352/1). SS był wspierany przez British Heart Foundation Clinical Research Training Fellowship (FS/CRTF/20/24071). CL był wspierany przez stypendium doktoranckie British Heart Foundation (FS/19/59/34896). LDR był wspierany przez nagrodę Diabetes UK RD Lawrence Fellowship (16/0005382). RMC było wspierane przez British Heart Foundation Intermediate Clinical Research Fellowship (FS/12/80/29821). MTK jest profesorem British Heart Foundation w dziedzinie badań nad układem sercowo-naczyniowym i cukrzycą (CH/13/1/30086) oraz posiada grant programowy British Heart Foundation (RG/F/22/110076)

Human SATMVECs: Isolation and Adipocyte Cross-Talk Studies

<ol><li>Bierhansl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+metabolism+in+endothelial+cell+function+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease.</a> Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).</li>
<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li>
<li>Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidases+in+glucose+homeostasis+and+diabetes-related+endothelial+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction.</a> Cells. 10 (9), 2315(2021).</li>
<li>Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+role+of+the+endothelium+in+metabolic+homeostasis+in+health+and+nutrient+excess%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess.</a> Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).</li>
<li>Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf</a> (2024).</li>
<li>Bouïs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+in+vitro%3A+A+review+of+human+vascular+endothelial+cell+lines+for+blood+vessel-related+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research.</a> Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).</li>
<li>Ades, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMEC-1%3A+establishment+of+an+immortalized+human+microvascular+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line.</a> J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).</li>
<li>Chi, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li>
<li>Brignole, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((213+ESC+Guidelines+on+cardiac+pacing+and+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy.</a> Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).</li>
<li>Greenspon, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+permanent+pacemaker+implantation+in+the+United+States+from+1993+to+2009%3A+Increasing+complexity+of+patients+and+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures.</a> J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prioritized+Research+Agenda+for+Prevention+and+Control+of+Noncommunicable+Diseases%22">Prioritized Research Agenda for Prevention and Control of Noncommunicable Diseases</a>. Mendis, S. A., Alwan, A. , World Health Organization. Geneva. (2011).</li>
<li>Brown, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+among+diabetes%2C+obesity%2C+and+cardiovascular+disease+phenotypes%3A+A+UK+biobank+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Relationship among diabetes, obesity, and cardiovascular disease phenotypes: A UK biobank cohort study.</a> Diabetes Care. 46 (8), 1531-1540 (2023).</li>
</ol>

SS otrzymało wsparcie niefinansowe, honoraria prelegentów i honoraria od AstraZeneca. RC otrzymał honoraria prelegentów od Janssen Oncology. OIB otrzymało honoraria za prelegentów od Novartis.

W badaniu opisano technikę izolowania hSATMVEC pobranego z SAT podczas rutynowej implantacji CIEDs. Wykazujemy, że wyizolowany hSATMVEC ma wysoką czystość, ulega ekspresji specyficznych dla EC białek transbłonowych CD144 i CD31 i nie wykazuje znaczącej ekspresji leukocytów CD45. Następnie pokazujemy, że w powtarzalny i wiarygodny sposób izolowany hSATMVEC namnaża się i może być wykorzystany eksperymentalnie do badania wewnątrzkomórkowej maszynerii zaangażowanej w sygnalizację insuliny i angiogenezę. Oprócz możliwości hodowania ich w izolacji, mogą być również wykorzystywane we wspólnej hodowli do badania wzajemnych oddziaływań hSATMVEC-adipocytów.
Komórki śródbłonka wykorzystywane w badaniach podstawowych i translacyjnych są zwykle pozyskiwane z dużych naczyń, takich jak aorta i ludzka żyła pępowinowa lub mikrokrążenie. Oba te źródła mają swoje własne ograniczenia 7,8; Komórki śródbłonka z dużych naczyń krwionośnych są albo trudno dostępne (w przypadku tkanki aorty), albo pochodzą z tkanki noworodka o potencjalnie różnej fizjologii i narażeniu środowiskowym9. Wykorzystanie komórek śródbłonka wyizolowanych z tkanki pobranej podczas implantacji CIED pozwala na badanie i eksperymentowanie z fizjologią komórkową w określonych rzeczywistych grupach pacjentów. CIED są wszczepiane w różnych wskazaniach, w tym u pacjentów z bradyarytmią, niewydolnością serca oraz prewencją pierwotną i wtórną tachyarytmii komorowych10. Pacjenci ci często cierpią na wiele chorób współistniejących, w tym cukrzycę, otyłość i chorobę wieńcową, które są głównym globalnym celem badań sercowo-naczyniowych 11,12,13. Ponadto, chociaż dane ilustracyjne w tym artykule odnoszą się do pacjentów kontrolnych, zastosowaliśmy te techniki do wyizolowania i zbadania SATMVEC od szeregu pacjentów, w tym tych z zaawansowaną niewydolnością serca i / lub cukrzycą typu 2.
Nierzadko spotykamy się z problemami ze słabymi wynikami hSATMVEC po próbie izolacji komórek. Ryzyko to można znacznie zmniejszyć, stosując większą początkową objętość SAT do izolacji hSATMVEC. Ponadto spotykamy się z tym częściej w SAT u osób z chorobami kardiometabolicznymi, a w szczególności z cukrzycą.
Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że izolowany hSATMVEC może przejść tylko ograniczoną liczbę pasaży. Z naszego doświadczenia wynika, że po pasażu 5, niezależnie od fenotypu pacjenta, proliferacja hSATMVEC znacznie zwalnia. Ponadto hSATMVEC wyizolowany przy użyciu tej techniki nie namnaża się dobrze, gdy jest zbyt słabo zaludniony; dlatego zalecamy, aby nie przechodzić hSATMVEC w stosunku większym niż 1:6. jak wspomniano na stronie 1. Udało nam się rozmrozić i ożywić hSATMVEC przechowywany w ciekłym azocie przez okres do 4 lat, a z naszego doświadczenia wynika, że szansa na reanimację jest większa, gdy kriokonserwuje się go przy niższej liczbie pasaży (zwykle krioprezerwujemy hSATMVEC przy pasażu 2).
Tkanka pobrana podczas insercji CIED jest swobodnie dostępna i może być pobrana bez szkody dla pacjenta. Dlatego łatwo dostępne, stosunkowo nieinwazyjne źródło komórek śródbłonka z tych grup pacjentów jest bardzo korzystne w prowadzeniu ukierunkowanych badań. Podczas gdy reprezentatywne obrazy w tym artykule pochodzą od pacjentów "kontrolnych" (tj. pacjentów bez rozpoznania niewydolności serca lub cukrzycy, choć ze wskazaniem do implantacji CIED), udało nam się wyizolować, wyhodować i współhodować SATMVEC od pacjentów z niewydolnością serca, cukrzycą i kombinacją tych patologii. Co więcej, techniki te można również zastosować do innych łożysk mikronaczyniowych, w tym mięśni szkieletowych, a obecnie optymalizujemy model przesłuchu MVEC-miocytów mięśni szkieletowych.
hSATMVEC można wyizolować z tkanki ludzkiej pobranej w momencie insercji CIED i mają wystarczającą czystość, aby można je było stosować eksperymentalnie do badania dysfunkcji mikronaczyniowej i wzajemnego oddziaływania komórek śródbłonka i adipocytów u osób z chorobą kardiometaboliczną i bez niej.

Komórki śródbłonka (ECs) to komórki płaskonabłonkowe, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię ściany naczynia krwionośnego jako monowarstwę. Pełnią one wiele istotnych ról, w tym kontrolę napięcia naczyniowego, regulację zakrzepicy, modulowanie odpowiedzi zapalnej i przyczynianie się do angiogenezy1. Biorąc pod uwagę znaczenie komórek śródbłonka w fizjologii kardiometabolicznej, są one często wykorzystywane eksperymentalnie w celu lepszego zrozumienia patofizjologii i zbadania nowych metod leczenia farmakologicznego chorób kardiometabolicznych.
Istnieje jednak ogromna niejednorodność w morfologii komórek śródbłonka, funkcji, ekspresji genów i składzie antygenu, w zależności od pochodzenia ich łożyska naczyniowego2. Podczas gdy komórki śródbłonka z dużych tętnic najlepiej nadają się do badań miażdżycy, komórki śródbłonka z małych naczyń, znane jako komórki śródbłonka mikronaczyniowego (MVEC), są bardziej odpowiednie do badań angiogenezy2. Zrozumienie molekularnych podstaw heterogeniczności śródbłonka może dostarczyć cennych informacji na temat terapii specyficznych dla łóżka naczyniowego. Funkcja śródbłonka mikronaczyniowego również znacznie różni się w wielu chorobach, w tym cukrzycy, chorobach układu krążenia i infekcjach ogólnoustrojowych3,4. W związku z tym możliwość izolowania komórek śródbłonka ze zdefiniowanych grup pacjentów pozwala na bezpośrednie porównanie funkcji ich komórek śródbłonka i przesłuchu komórkowego5. 
W tym artykule opisujemy nowatorską metodę izolowania ludzkich MVEC z podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVEC) pobranej podczas wprowadzania wszczepialnego elektronicznego urządzenia do implantacji serca (CIED). hSATMVEC wyizolowany po enzymatycznym trawieniu podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) był hodowany i pasażowany na płytkach pokrytych żelatyną. Następnie opisujemy szereg testów fenotypowania, które zostały z powodzeniem zastosowane do hSATMVEC w celu walidacji ich fenotypu i wykazania zastosowania w rutynowych testach komórek śródbłonka. Na koniec opisujemy zastosowanie hSATMVECs w eksperymentalnym modelu wzajemnego oddziaływania hSATMVECs i adipocytów.

<table><tbody><tr><td>170L CO2 Inkubator</td><td>GS Biotech</td><td>170G-014</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)Amino)-2-Deoksyglukoza)</td><td>Invitrogen</td><td>N13195</td><td></td></tr><tr><td>4% PARAFIX buforowany histologiczny utrwalacz</td><td>VWR Chemicals</td><td>PRC/R/38/1</td><td></td></tr><tr><td>Akt (tAkt) Królik&nbsp; 1:1000</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Pomarańczowy, 50/opk</td><td>Medisave</td><td>393230</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 7,5%</td><td>Merck</td><td>A8412-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CD144&nbsp;( VE-Cadherin) Przeciwciało, anty-ludzkie, PE, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-495</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Przeciwciało, anty-ludzkie, PerCP-Vio 700, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-811</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, człowiek, 1 zestaw</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Przeciwciało, antyludzkie, FITC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-769</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja komórek Wirówka do</td><td>FNN0011</td><td></td>Buffer <td>Invitrogen</td></tr><tr><td>5804 R</td> Zestaw <td></td> do proliferacji komórek <td>Eppendorf</td> 5805000060 <td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488</td><td>Zestaw do obrazowania proliferacji komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td></tr><tr><td>Kolagenaza / Dyspaza, 500 mg</td><td>Roche/Merck</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Macierz błony podstawnej</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td>Matryca membrany podstawnej</td></tr><tr><td>Corning 100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TC</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Costar 24-dołkowe, przezroczyste płytki wielodołkowe nasączone TC, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>kordoning&nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-dołkowe, przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TC, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>kordonowanie&nbsp;</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S &ndash; 4 Cytometr laserowy</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Merck</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EASYssitko Sito komórkowe do probówek 50 mL, 70 &mikro; m siatka, Niebieska, sterylna, 50/pk</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV</td><td>PromoCell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Eppendorf Safe-Lock</td><td>Merck</td><td>EP0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego</td><td>Merck</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polistyrenowa przepuszczalna płyta nośna, z pokrywką, Sterylne, 1/opakowanie, 50/skrzynka</td><td>Appleton Woods</td><td>CF537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Permeable Support do płytki 24-dołkowej z 0,4 i mikro; m Przezroczysta membrana PET, sterylna, 1/opakowanie, 48/opakowanie</td><td>Appleton Woods</td><td>CF521</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażalnik Cryo-SFM</td><td>PromoCell</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny, 2% w wodzie</td><td>Merck</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antybiotyk-Antybiotyk (100x), 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570486</td><td></td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowej</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>12563029</tr><tr><td>Hanks&prime; Zrównoważony roztwór soli</td><td>Merck</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie podskórne komórki preadipocytów</td><td>Lonza</td><td>PT-5020</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>System analizy żywych komórek</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzki</td><td>Merck</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny, 25/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przechowywania tkanek MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Rotator rurowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Rotator rurowy</td></tr><tr><td>MS, 25/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&ndash; 12% Bis-tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-8002</td><td></td></tr><tr><td>Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9570</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Rabbit&nbsp; 1:1000</td><td>Technologia</td> <td>sygnalizacji komórkowej4060</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do separacji wstępnej 30 i mikro; m, 50/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia jodku propidyny (PI)/RNazy</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4087</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy sterylny styl 10</td><td>VWRI</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Tubka z nakrętką, 15 ml, (Lx&Oslash;): 120 x 17 mm, PP, z nadrukiem</td><td>Sarstetd</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka tubka, 50 ml, (Lx&Oslash;): 114 x 28 mm, PP, z nadrukiem</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Tubka z nakrętką, 50 ml, (Lx&Oslash;): 114 x 28 mm, PP, z nadrukiem</td><td>Sarstetd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Total eNOS Mouse 1:1000</td><td>BD Biosciences</td><td>610297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, BioUltra, do biologii molekularnej</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktyna (C4) Mysz 1:5000</td><td>Santa Cruz Biotechnologia</td><td>&nbsp; SC-47778</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego (MVEC) pełnią wiele kluczowych ról, w tym kontrolę napięcia naczyniowego, regulację zakrzepicy i angiogenezę. Znaczna heterogeniczność genotypu i fenotypu komórek śródbłonka (EC) zależy od ich łożyska naczyniowego i stanu choroby gospodarza. Możliwość izolowania MVEC z łożysk naczyniowych specyficznych tkankowo i poszczególnych grup pacjentów daje możliwość bezpośredniego porównania funkcji MVEC w różnych stanach chorobowych. Tutaj, za pomocą podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) pobranej w momencie wprowadzania wszczepialnych urządzeń elektronicznych do implantacji serca (CIED), opisujemy metodę izolacji czystej populacji funkcjonalnej ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej MVEC (hSATMVEC) oraz eksperymentalny model przesłuchu hSATMVEC-adipocyty.
hSATMVEC zostały wyizolowane po enzymatycznym trawieniu SAT przez inkubację z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałem anty-CD31 i przejście przez kolumny magnetyczne. hSATMVEC były hodowane i pasażowane na płytkach pokrytych żelatyną. W eksperymentach wykorzystano komórki w przejściach 2-4. Komórki zachowały klasyczne cechy morfologii EC co najmniej do pasażu 5. Ocena cytometrii przepływowej wykazała 99,5% czystości izolowanego hSATMVEC, zdefiniowanego jako CD31+/CD144+/CD45-. Wyizolowany hSATMVEC z grupy kontrolnej miał czas podwojenia populacji wynoszący około 57 godzin, a aktywną proliferację potwierdzono za pomocą zestawu do obrazowania proliferacji komórek. Izolowaną funkcję hSATMVEC oceniano na podstawie ich odpowiedzi na stymulację insuliną i potencjału tworzenia cewek angiogennych. Następnie ustaliliśmy model kohodowli adipocytów hSATMVEC i podskórnie w celu zbadania przesłuchów komórkowych i wykazaliśmy dalszy wpływ hSATMVEC na funkcję adipocytów.
hSATMVEC może być wyizolowany z SAT pobranego w czasie insercji CIED i ma wystarczającą czystość, aby zarówno eksperymentalnie fenotypować, jak i badać przesłuch hSATMVEC-adipocyty.

Czystość i fenotyp hSATMVEC 
Wyizolowane hSATMVEC od pacjentów z grupy kontrolnej (tj. osób bez historii chorób kardiometabolicznych) wykazywały w badaniu cytometrii przepływowej 99,5% CD31+CD144+CD45- (Rysunek 2). Wyizolowane hSATMVEC miały morfologię przypominającą brukowaną kostkę, typową dla komórek śródbłonka (Rysunek 3A). Średni czas podwojenia populacji hSATMVEC wynosił 56,6 h ± 8,1 h (średnia ± SEM, n = 10) (Rysunek 3B), a aktywna replikacja DNA w hSATMVEC została potwierdzona przy użyciu zestawu do obrazowania proliferacji komórek (Rysunek 3C).
hSATMVEC zachowywały się jak funkcjonalne MVEC i tworzyły cewki w Matrigelu (Rysunek 3D). Względna ekspresja kluczowych białek zaangażowanych w szlak sygnalizacji insulinowej Akt-eNOS jest przedstawiona na Rysunku 3E. Zarówno eNOs, jak i Akt wykazały wzrost fosforylacji indukowanej insuliną, przedstawiony jako stosunek białka fosforylowanego do całkowitej ilości białka, z normalizacją względem ß-aktyny (Rysunek 3E).
Współhodowla hSATMVEC-adipocytów 
Ilustracyjny model współhodowli hSATMVEC-adipocytów przedstawiono na Rysunku 4A. W miarę różnicowania się ludzkich podskórnych białych preadipocytów zauważalny jest rozwój wakuol lipidowych (Rysunek 4B), które można ilościowo określić za pomocą barwienia Oil Red O (Rysunek 4B).
Ilustracyjne obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne (pobudzenie 440-480 nm/emisja 504-544 nm) zróżnicowanych adipocytów po 30 min inkubacji z 20 µM 2-NBD glukozy przedstawiono na Rysunku 4C. Pobór glukozy można określić ilościowo, mierząc zielony obszar jako procent całkowitej powierzchni komórek.
<img alt="Schemat izolacji i oczyszczania komórek tkanki tłuszczowej podskórnej, metoda separacji koralikami magnetycznymi CD31." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający pozyskiwanie i przetwarzanie hSATMVECs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy z cytometrii przepływowej; analiza sortowania komórek z użyciem markerów CD45, CD14, CD144, CD31; wyniki histogramów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Typowy wynik analizy cytometrii przepływowej hodowlanych hSATMVECs. (A) Wykres kropkowy pola rozproszenia bocznego (SSC-A) i pola rozproszenia przedniego (FSC-A) przedstawiający bramkowanie (czerwona ramka) hodowlanych hSATMVECs wokół konkretnej gęstości populacji komórek. (B) Wykres kropkowy szerokości rozproszenia przedniego (FSC-Width) i FSC-A przedstawiający bramkowanie (czerwona ramka) hodowlanych hSATMVECs wokół konkretnej gęstości populacji komórek. (C) Histogram przedstawiający fluorescencję bramkowanych komórek dla CD45-FITC. (D) Wykres kropkowy intensywności fluorescencji CD144-PE (oś x) i CD31-PerCP (oś y). (E) Histogram przedstawiający fluorescencję bramkowanych komórek dla CD144-PE. (F) Histogram przedstawiający fluorescencję bramkowanych komórek dla CD31-PerCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie komórek hSATMVEC: morfologia brukowana, czas podwojenia, tworzenie cewek, wykres sygnalizacji insulinowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Fenotyp hSATMVEC. (A) Obraz z mikroskopii świetlnej komórek hSATMVEC blisko konfluencji, wykazujący morfologię przypominającą brukowaną. (B) Czas podwojenia hSATMVEC – mikroskopia świetlna HATEC wykonana w odstępach 24 h, demonstrująca zakres proliferacji komórek. (C) Proliferacja hSATMVEC. Mikroskopia fluorescencyjna komórek hSATMVEC z jodekiem propidyny i EdU/Alexa-fluor 488 od osób z grupy kontrolnej. (D) Tworzenie cewek przez hSATMVEC od osób z grupy kontrolnej (obrazy wykonane przy powiększeniu 4x). (E) Stymulacja insuliną komórek HATEC – przedstawiająca względną ekspresję fosforylowanego Akt (seryna 473) w stosunku do całkowitego Akt (lewy panel) oraz fosforylowanego eNOS (seryna 1177) w stosunku do całkowitego eNOS (prawy panel) przy rosnących stężeniach insuliny, wraz z ilustracyjnymi obrazami western blot poniżej, standaryzowanymi względem B-actin. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Wielkości próbek znajdują się pod każdym panelem. Skróty: 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU), ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka tkanki tłuszczowej podskórnej (hSATMVEC), błąd standardowy średniej (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat kokultury hSATMVEC/adipocytów, dane dotyczące różnicowania adipocytów i poboru glukozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Kokultura hSATMVEC-adipocytów. (A) Schemat kokultury hSATMVEC-adipocytów. (B) Różnicowanie adipocytów. Panel lewy przedstawia preadipocyty w dniu 0, a panel prawy przedstawia zróżnicowane adipocyty w dniu 10 po dodaniu PDM. Dolna rycina przedstawia ilość lipidów zgromadzonych w adipocytach i preadipocytach barwionych Oil Red O. (C) Test poboru glukozy. Panel lewy przedstawia obrazy w kontraście fazowym adipocytów po kokulturze i inkubacji z 20 µM 2-NBD glukozy przez 30 min. Panel prawy przedstawia obrazowanie zielonej fluorescencji, na podstawie którego można ilościowo określić pobór glukozy (jako % zielonego obszaru do całkowitej powierzchni). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Skróty: Dzień 10 (D10), ludzkie komórki śródbłonka mikro naczyniowego tkanki tłuszczowej podskórnej (hSATMVEC), pożywka do różnicowania preadipocytów (PDM) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Koktajl barwiący do cytometrii przepływowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Chcemy zrozumieć rolę mikrokrążenia podskórnej tkanki tłuszczowej u osób z chorobą kardiometaboliczną i bez niej. W tym celu izolowaliśmy podskórne komórki mikronaczyniowe śródbłonka tkanki tłuszczowej od pacjentów poddawanych kardiologicznym wszczepialnym urządzeniom elektronicznym. Ma to na celu zbadanie fenotypu komórek śródbłonka i wzajemnego oddziaływania komórka-komórka z adipocytami.Historycznie rzecz biorąc, używaliśmy unieśmiertelnionych linii komórek ludzkich lub modeli zwierzęcych do badania chorób kardiometabolicznych in vitro. Nie są one jednak reprezentatywne dla chorób u ludzi. Nasza technika pozwala nam zrozumieć komórkowe podstawy chorób kardiometabolicznych przy użyciu tkanek pochodzących od rzeczywistych pacjentów.Nasza grupa bada obecnie mechanizm rozregulowanego przesłuchu adipocytów śródbłonka śródbłonka w śródbłonku tkanki tłuszczowej u osób z cukrzycą, w szczególności wpływ śródbłonka cukrzycowego na funkcję adipocytów i jak można to ukierunkować w celu poprawy zdrowia kardiometabolicznego. Na początek uzyskaj 250 miligramów SAT powyżej mięśnia piersiowego większego podczas implantacji CIED w roztworze do przechowywania tkanek do magnetycznego sortowania komórek. Przygotuj jeden miligram na mililitr kolagenazy / dispazy w 10 mililitrach zimnego roztworu soli Hanksa.Pod komorą z przepływem laminarnym zmiel tkanki na jednomilimetrowe kawałki w 500 mikrolitrach roztworu kolagenazy/dyspazy. Dodać 4,5 mililitra roztworu kolagenazy/dypazy do mieszanki i przenieść rozdrobnioną tkankę do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj pokrywkę szalki Petriego pięcioma mililitrami roztworu kolagenazy/dypazy i dodaj go do probówki.Inkubuj probówkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w rotatorze probówki ustawionym na 20 obrotów na minutę. Aby zatrzymać trawienie, wlej do probówki 10 mililitrów kompletnej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Po roztarciu straturowanej mieszanki za pomocą kaniuli Venflon o rozmiarze 14, przecedź ją przez sito komórkowe o średnicy 70 mikrometrów i przepłucz 10 mililitrami 0,5% buforu PBS-BSA.Odwirować filtrat o sile 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Aby usunąć martwe komórki, dodaj 200 mikrolitrów kulek do usuwania martwych komórek do osadu komórkowego, pobranych do probówki do mikrowirówki i inkubuj. Następnie przymocuj kolumnę do separacji cieczy z filtrem 30 mikrometrów do magnesu separatora i umieść pod spodem 15-mililitrową rurkę wirówkową.Po umyciu kolumny buforem wiążącym do usuwania martwych komórek, dodać zawiesinę próbki/kulki. Pozwól mu przejść pod wpływem grawitacji i zbierz eluat. Następnie odwiruj pobraną żywą komórkę, eluuj i ponownie zawieś powstały osad w 400 mikrolitrach 0,5% PBS-BSA.Inkubować zawieszone komórki z 20 mikrolitrami kulek magnetycznych pokrytych anty-CD 31 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach 0,5% PBS-BSA. Przymocuj kolumnę z filtrem 30 mikrometrów do magnesu separatora i umieść pod spodem 15-mililitrową rurkę wirówkową.Dodaj zawiesinę mikrokulek komórkowych do kolumny i pozwól jej przejść pod wpływem grawitacji. Po umyciu kolumny umieść ją w świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj jeden mililitr 0,5% PBS-BSA do kolumny. Naciskać tłok kolumny, aby zebrać frakcję dodatnią CD31.Odwirować próbkę, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić paletę komórek w jednym mililitrze kompletnego podłoża do wzrostu komórek śródbłonka mikronaczyniowego. Dozować zawiesinę do dwóch dołków 24-dołkowej płytki pokrytej 2% żelatyną. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa do czterech tygodni, aż komórki staną się prawie 80% zlewne.Na początek rozmrozić przejście jednego ludzkiego białego podskórnego preadipocytów i dodać komórki do kolby T75 zawierającej od 12 do 15 mililitrów ciepłej pożywki do wzrostu preadipocytów dwa. Po osiągnięciu przez komórki 90% zbieżności, umyj je PBS i inkubuj z jednym mililitrem 0,25% roztworu trypsyny/EDTA przez dwie minuty. Za pomocą mikroskopu świetlnego potwierdź oderwanie komórek i dodaj 23 mililitry pożywki do wzrostu preadipocytów dwa do komórek.Dozować jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki towarzyszącej do współhodowli i inkubować płytkę, aby osiągnąć zbieżność komórek. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki do różnicowania preadipocytów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 dni. W szóstym dniu różnicowania wysiewaj się pięć razy 10 do potęgi czterech ludzkich SAT-MVEC w 500 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej MVEC na wkładce transwell.Umieść wkładkę w studzience zawierającej 500 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej MVEC i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W 10 dniu, kiedy adipocyty są w pełni zróżnicowane, usuń połowę pożywki z każdej studzienki i przenieś wkładki transwell zawierające konfluencyjne SAT MVEC do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez 24 godziny, aby uzyskać kokulturę.W miarę jak ludzkie podskórne białe preadipocyty stają się bardziej zróżnicowane, można zauważyć rozwój wakuoli lipidowych.

studying-adipose-endothelial-celladipocyte-cross-talk-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Rękopis i związane z nim wideo demonstrują technikę biopsji przezskórnej w celu uzyskania próbek podskórnej tkanki tłuszczowej z obszarów otaczających pępek. Metoda ta jest mało ryzykownym i skutecznym sposobem badania szeregu parametrów (np. ekspresji genów lub białek, aktywności enzymów, zawartości lipidów) w tkance tłuszczowej.

Pobieranie próbek ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej techniką mini liposukcji

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego z ludzkiej tkanki tłuszczowej w celu badania ich wzajemnych oddziaływań z adipocytami.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów