Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych
July 11th, 2025
Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.
Badania te koncentrują się na miękkich materiałach biologicznych i mają na celu zbadanie podstawowych mechanizmów fizycznych, które regulują kształt i organizację oraz materiałów inspirowanych komórkami biologicznymi.
Systemy biologiczne i modele in vitro są z natury złożone i obarczone wieloma pułapkami, a przygotowanie próbek ma kluczowe znaczenie dla ich odtwarzalności. Protokół ten ma na celu poprawę odtwarzalności w tych systemach.
Wyniki te torują drogę do wykrywania, charakteryzowania mechanizmów i zrozumienia funkcji sił fizycznych i biomateriałów. Można to uogólnić na różne biopolimery i organelle.
[Narrator] Na początek przygotuj próbkę do załadowania, dodając pięć mikrolitrów buforu 10XF do mikroprobówki wirówkowej i dodaj objętość dejonizowanej wody destylowanej tak, aby końcowa objętość próbki wynosiła 50 mikrolitrów po dodaniu pozostałych składników. Odpipetować jeden mikrolitr 25% beta-merkaptoetanolu, jeden mikrolitr 225 miligramów na mililitr glukozy, jeden mikrolitr mieszaniny oksydazy glukozowej i 85 000 jednostek na mililitr katalizatora do roztworu. Następnie dodaj jeden mikrolitr 25 milimolowych ATP i 10 mikrolitrów 2%, 15 centypuazowej metylocelulozy i dokładnie wymieszaj pipetując. Aby rozpocząć polimeryzację aktyny, wymieszaj nieznakowaną aktynę ze znakowaną aktyną i dodaj mieszaninę aktyny do przygotowanego roztworu buforowego F. Pipetować roztwór w górę i w dół, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Pozostaw aktynę do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w probówce do mikrowirówki. Następnie, aby przygotować komórkę przepływową, umieść dwa kawałki taśmy dwustronnej równolegle do siebie na całej szerokości szkiełka mikroskopowego, aby utworzyć granice kanału komórki przepływowej. Umieść szkiełko nakrywkowe nad kanałem taśmy, upewniając się, że jest prostopadłe do szkiełka mikroskopu. Dociśnij obszar szkiełka nakrywkowego, który styka się z taśmą dwustronną, aby uzyskać dobre uszczelnienie i wyeliminować kieszenie powietrzne. Za pomocą żyletki odetnij nadmiar taśmy ze szkiełka mikroskopowego i szkiełka nakrywkowego tak, aby jedyna widoczna taśma znajdowała się w kanale próbki. Aby przygotować komorę na próbkę cylindra na dwie próbki odblokowywacza, należy najpierw przepłukać szkiełko nakrywkowe etanolem, wodą i etanolem. Wysuszyć go przefiltrowanym powietrzem. Nałożyć cienką warstwę pięciominutowej żywicy epoksydowej, aby przykleić szklany cylinder do klonowania do szkiełka nakrywkowego. Dodaj 3,5 mikrolitra roztworu środka powierzchniowo czynnego do przezroczystej lub jasnej probówki mikrowirówkowej. Nie mieszając, odpipetować pięć mikrolitrów roztworu aktyny na wierzch warstwy olejowego środka powierzchniowo czynnego. Zamknij rurkę. Przytrzymaj górną część probówki mikrowirówki i przesuń dolną krawędź, aby utworzyć początkową pianę z widoczną emulsją i kontynuuj trzepanie, aż utworzy jednolite mikroemulsje. Przed załadowaniem komory przepływowej wymieszaj niewielką ilość pięciominutowej żywicy epoksydowej. Aby załadować celę przepływową, należy odpipetować od jednego do trzech mikrolitrów roztworu środka powierzchniowo czynnego w oleju do kanału próbki komory przepływowej, aby utworzyć małą zatyczkę, która zwilży kanał. Przed dodaniem próbki przechylić komorę przepływową, aby usunąć wszelkie szczeliny powietrzne, które tworzą się z powodu cofającego się menisku środka powierzchniowo czynnego oleju. Natychmiast odpipetować zawiesinę emulsji roztworu próbki do wejścia do komory przepływowej w celu napełnienia kanału. Uszczelnij każdą stronę kanału komory przepływowej pięciominutową żywicą epoksydową. Aby załadować komorę na próbkę cylindra dla próbek niezawierających emulsji, należy odpipetować pięć mikrolitrów roztworu środka powierzchniowo czynnego w oleju na dno komory szklanego cylindra. Przechyl i powoli obróć szkiełko nakrywkowe, aby pokryć powierzchnię i dolny cylinder roztworem środka powierzchniowo czynnego. Usuń nadmiar roztworu środka powierzchniowo czynnego oleju za pomocą pipety, aby uzyskać cienką warstwę, jednocześnie zapobiegając całkowitemu odparowaniu oleju. Natychmiast dodać roztwór próbki do komory. Przykryj komorę małym kawałkiem politetrafluoroetylenu lub taśmą PTFE, aby zapobiec parowaniu i przepływowi. Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe aktyny za pomocą obiektywu 20x, 40x, 60x lub 100x z zanurzeniem w oleju lub wodzie, aby zapewnić wystarczająco wysoką aperturę numeryczną do obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W przypadku polimeryzacji w komorze na próbkę należy pozostawić polimeryzację na około 30 minut lub do momentu, gdy nie będzie widocznego wydłużenia lub ruchu filamentu. Dodaj środek sieciujący do próbki, a następnie dodaj miozynę w postaci wstępnie spolimeryzowanych włókien, powoli pipetując około połowy całkowitej objętości do próbki. Na koniec rozpocznij obrazowanie poklatkowe. Reprezentatywny obraz fluorescencji konfokalnej splątanej sieci aktynowej pokazano tutaj. Splątana sieć aktynowa jest równomiernie rozłożona na powierzchni. Jasne plamy na tym zdjęciu reprezentują nakładanie się włókien, podczas gdy ciemne obszary wskazują na minimalną obecność aktyny. Fluktuacje termiczne prowadzą do lokalnych zmian intensywności i widocznego wygięcia filamentów aktynowych. Dodatek miozyny II powoduje wygięcie i reorganizację sieci aktynowej z widoczną akumulacją miozyny puncta w długim czasie. Skurcz sieci zależy od stężenia miozyny i stężenia ATP. W usieciowanych sieciach aktynowych skurcz indukowany miozyną prowadzi do skoordynowanego ruchu w dłuższych skalach w porównaniu z sieciami splątanymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na miękkich materiałach biologicznych i ma na celu zbadanie podstawowych mechanizmów fizycznych regulujących kształt i organizację. Badanie prezentuje metody przygotowywania prawie dwuwymiarowych (2D) splątanych, sieciowanych i cieczowo-krystalicznych struktur aktynowych z oczyszczonych białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Materiały biologiczne
- Fizyka mięskiej materii
- Zestawianie białek
Tło
- Biologiczne i in vitro systemy modelowe są złożone.
- Przygotowanie próbki jest krytyczne dla reprodybowalności.
- Ten protokół ma na celu poprawę reprodykowalności w tych systemach.
- Rozumienie mechanizmów fizycznych jest niezbędne dla projektowania materiałów.
Cel badania
- Zbadać mechanizmy fizyczne regulujące materiały biologiczne.
- Opracować metody tworzenia stabilnych struktur aktynowych.
- Poprawić reprodykowalność w eksperymentach biologicznych.
Stosowane metody
- Przygotowanie prawie dwuwymiarowych struktur aktynowych.
- Sieciowanie filamentów aktynowych.
- Wykorzystanie właściwości cieczy krystalicznych.
- Protokoły czyszczenia białek.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie 2D splątanych struktur aktynowych.
- Wykazana reprodykowalność procesu składania.
- Wgląd w fizyczne właściwości struktur.
- Potencjalne zastosowania w materiałach biomimetycznych.
Wnioski
- Opracowanie metod może poprawić badania mięskich materiałów biologicznych.
- Poprawa reprodykowalności może prowadzić do lepszych wyników eksperymentalnych.
- Dalsze badania mogą zweryfikować zastosowania w różnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reconstituted actin-based assemblies provide a controllable platform for dissecting the physical mechanisms underlying cellular contractility and deformation, which are central to cytoskeletal target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ability to tune contractility and deformation modes in vitro enables predictive evaluation of cytoskeletal modulators and supports translational continuity from discovery to preclinical model development. These assemblies offer a reproducible system for quantitative analysis of force generation and shape regulation relevant to biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cytoskeletal force generation and shape regulation mechanisms.
- Supports functional target validation for actin-myosin interactions and crosslinker effects.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating physical drivers of contractility.
- Provides a quantitative platform for hypothesis testing in cytoskeletal biology.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible actin network systems for compound screening targeting cytoskeletal dynamics.
- Enables standardization of contractility and deformation assays for quantitative readouts.
- Supports scalability and platform reuse for screening modulators of actin-myosin function.
- Delivers robust, quantifiable outputs for comparative evaluation of candidate molecules.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation of cytoskeletal targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative force and deformation metrics.
- Supports translational biomarker development for cytoskeletal modulation.
Pipeline & Workflow Integration
These actin-based assemblies integrate into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation, supporting both target validation and predictive analytics for cytoskeletal drug discovery.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for actin-myosin contractility.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay systems for quantitative contractility and deformation measurements.
- Analytics: Enables quantitative comparison of network contraction, filament sliding, and buckling under defined conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to preclinical models of cytoskeletal dysfunction.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform for diverse cytoskeletal research and screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cytoskeletal target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of actin-based assays across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistically grounded outputs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cytoskeletal targets and candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, actin polymerization, and fluorescence microscopy.
- Demands access to high-resolution imaging and quantitative analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous sample preparation protocols for reproducibility across experiments.
- Adaptation to other cytoskeletal or biopolymer systems may require protocol optimization.
- Practical limitations include sensitivity to buffer conditions and protein quality.
