Name: Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych kinezyną i miozyną do badania dynamiki cytoszkieletu. Technika ta umożliwia precyzyjne programowanie struktury i zachowań materii aktywnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mayi Hendija i Dr. Jonathanowi Michelowi za pomoc w analizie danych, a także Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das i Dr. Michael Rust za pomocne dyskusje i wskazówki. Badania te były wspierane przez grant badawczy Fundacji Williama M. Kecka i nagrodę NSF DMREF Award (DMR 2119663) przyznaną RMRA i JLR oraz granty National Institutes of Health R15 (R15GM123420, 2R15GM123420-02) przyznane RMR-A i RJM.

<ol>
	<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).</li>
	<li>Koenderink, G. H., Paluch, E. K. Architecture shapes contractility in actomyosin networks. Current Opinion in Cell Biology. 50, 79-85 (2018).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 15 (5), 177-182 (2011).</li>
	<li>Xiao, Q., Hu, X., Wei, Z., Tam, K. Y. Cytoskeleton molecular motors: structures and their functions in neuron. International Journal of Biological Sciences. 12 (9), 1083-1092 (2016).</li>
	<li>Ajeti, V. et al. Wound healing coordinates actin architectures to regulate mechanical work. Nature Physics. 15 (7), 696-705 (2019).</li>
	<li>Jung, W. et al. Dynamic motions of molecular motors in the actin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (11-12), 517-531 (2019).</li>
	<li>Pollard, T. D., O&#39;Shaughnessy, B. Molecular mechanism of cytokinesis. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 661-689 (2019).</li>
	<li>Huber, F., Boire, A., L&#243;pez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Current Opinion in Cell Biology. 32, 39-47 (2015).</li>
	<li>Rivero, F. et al. The role of the cortical cytoskeleton: F-actin crosslinking proteins protect against osmotic stress, ensure cell size, cell shape and motility, and contribute to phagocytosis and development. Journal of Cell Science. 109 (11), 2679-2691 (1996).</li>
	<li>Duclos, G. et al. Topological structure and dynamics of three-dimensional active nematics. Science. 367 (6482), 1120-1124 (2020).</li>
	<li>Baclayon, M. et al. Optical tweezers-based measurements of forces and dynamics at microtubule ends. Optical Tweezers. 1486, 411-435 (2017).</li>
	<li>Gurmessa, B., Fitzpatrick, R., Falzone, T. T., Robertson-Anderson, R. M. Entanglement density tunes microscale nonlinear response of entangled actin. Macromolecules. 49 (10), 3948-3955 (2016).</li>
	<li>Francis, M. L. et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).</li>
	<li>Ricketts, S. N. et al. Varying crosslinking motifs drive the mesoscale mechanics of actin-microtubule composites. Scientific Reports. 9 (1), 12831 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (51), 20820-20825 (2012).</li>
	<li>Soares e Silva, M. et al. Active multistage coarsening of actin networks driven by myosin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9408-9413 (2011).</li>
	<li>Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Roichman, Y. Dynamics in steady state in vitro acto-myosin networks. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (16), 163002 (2017).</li>
	<li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127 (2013).</li>
	<li>F&#252;rthauer, S. et al. Self-straining of actively crosslinked microtubule networks. Nature Physics. 15 (12), 1295-1300 (2019).</li>
	<li>Lemma, L. M. et al. Multiscale microtubule dynamics in active nematics. Physical Review Letters. 127 (14), 148001 (2021).</li>
	<li>Fan, Y., Wu, K.-T., Aghvami, S. A., Fraden, S., Breuer, K. S. Effects of confinement on the dynamics and correlation scales in kinesin-microtubule active fluids. Physical Review E. 104 (3), 034601 (2021).</li>
	<li>Triclin, S. et al. Self-repair protects microtubules from destruction by molecular motors. Nature Materials. 20 (6), 883-891 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical Journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Yadav, V. et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).</li>
	<li>Ennomani, H. et al. Architecture and connectivity govern actin network contractility. Current Biology. 26 (5), 616-626 (2016).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., Koenderink, G. H. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Jung, W., Murrell, M. P., Kim, T. F-actin cross-linking enhances the stability of force generation in disordered actomyosin networks. Computational Particle Mechanics. 2 (4), 317-327 (2015).</li>
	<li>Lenz, M., Thoresen, T., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Contractile units in disordered actomyosin bundles arise from f-actin buckling. Physical Review Letters. 108 (23), 238107 (2012).</li>
	<li>Memarian, F.L. et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), e2117107118 (2021).</li>
	<li>Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).</li>
	<li>Foster, P. J., F&#252;rthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837 (2015).</li>
	<li>Thijssen, K. et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), e2106038118 (2021).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Colen, J. et al. Machine learning active-nematic hydrodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (10), e2016708118 (2021).</li>
	<li>Mitchell, K. A., Tan, A. J., Arteaga, J., Hirst, L. S. Fractal generation in a two-dimensional active-nematic fluid. Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. 31 (7), 073125 (2021).</li>
	<li>Pandolfi, R. J., Edwards, L., Johnston, D., Becich, P., Hirst, L. S. Designing highly tunable semiflexible filament networks. Physical Review E. 89 (6), 062602 (2014).</li>
	<li>Tan, A. J. et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e14 (2018).</li>
	<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
	<li>Sheung, J. Y. et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).</li>
	<li>McGorty, R. PyDDM v0.2.0. Zenodo. (2022).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv. (2021).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>McGorty, R. Image-Correlation. at &#60;https://github.com/rmcgorty/Image-Correlation&#62;. (2020).</li>
	<li>Robertson, C. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).</li>
	<li>McGorty, R. Differential Dynamic Microscopy - Python. at &#60;https://github.com/rmcgorty/Differential-Dynamic-Microscopy---Python&#62;. (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Robertson-Anderson, R. M. Optical tweezers microrheology: from the basics to advanced techniques and applications. ACS Macro Letters. 7 (8), 968-975 (2018).</li>
	<li>Pollard, T. D. Polymerization of ADP-actin. Journal of Cell Biology. 99 (3), 769-777 (1984).</li>
	<li>Cou&#233;, M., Brenner, S. L., Spector, I., Korn, E. D. Inhibition of actin polymerization by latrunculin A. FEBS Letters. 213 (2), 316-318 (1987).</li>
	<li>Pollard, T. D. Actin and actin-binding proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (8), a018226 (2016).</li>
	<li>Kumar, N. Taxol-induced polymerization of purified tubulin. Mechanism of action. Journal of Biological Chemistry. 256 (20), 10435-10441 (1981).</li>
	<li>K&#228;s, J. et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophysical Journal. 70 (2), 609-625 (1996).</li>
	<li>Viamontes, J., Narayanan, S., Sandy, A. R., Tang, J. X. Orientational order parameter of the nematic liquid crystalline phase of F -actin. Physical Review E. 73 (6), 061901 (2006).</li>
	<li>Hitt, A. L., Cross, A. R., Williams, R. C. Microtubule solutions display nematic liquid crystalline structure. Journal of Biological Chemistry. 265 (3), 1639-1647 (1990).</li>
	<li>Andexer, J. N., Richter, M. Emerging enzymes for ATP regeneration in biocatalytic processes. ChemBioChem. 16 (3), 380-386 (2015).</li>
	<li>Farhadi, L. et al. Actin and microtubule crosslinkers tune mobility and control co-localization in a composite cytoskeletal network. Soft Matter. 16 (31), 7191-7201 (2020).</li>
	<li>Falzone, T. T., Lenz, M., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Assembly kinetics determine the architecture of &#945;-actinin crosslinked F-actin networks. Nature Communications. 3 (1), 861 (2012).</li>
	<li>Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).</li>
	<li>Sanghvi-Shah, R., Weber, G. F. Intermediate filaments at the junction of mechanotransduction, migration, and development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 81 (2017).</li>
	<li>Shen, Y. et al. Effects of vimentin intermediate filaments on the structure and dynamics of in vitro multicomponent interpenetrating cytoskeletal networks. Physical Review Letters. 127 (10), 108101 (2021).</li>
	<li>Laan, L., Roth, S., Dogterom, M. End-on microtubule-dynein interactions and pulling-based positioning of microtubule organizing centers. Cell Cycle. 11 (20), 3750-3757 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Kluczowym osiągnięciem opisanego powyżej zrekonstruowanego systemu jest jego modułowość i możliwość dostrajania, dlatego użytkownicy są zachęcani do modyfikowania stężeń białek, silników, środków sieciujących itp., aby dopasować je do pożądanych wyników, niezależnie od tego, czy chodzi o emulację określonego procesu komórkowego, czy też zaprojektowanie materiału o określonej funkcjonalności lub właściwościach mechanicznych. Ograniczenia zakresu stężeń aktyny i tubuliny ustala się na dolnej granicy przez stężenie krytyczne potrzebne do polimeryzacji aktyny (~0,2 μM)57,58,59 i tubuliny (~3 - 4 μM)60, a na górnej granicy przez przejście do wyrównania nematycznego włókien aktyny (~90 μM)61,62 lub mikrotubul (~35 μM)63. Monomery aktyny i dimery tubuliny powinny być polimeryzowane razem we włókna, a nie mieszane ze sobą po polimeryzacji, aby zapewnić, że tworzą jednorodnie przenikające się sieci perkolowane, które synergistycznie się wspierają. Nowa dynamika, którą wykazują kompozyty, opiera się na tej interakcji. Chociaż ogólnie ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki opisane w protokole, aby pomyślnie odtworzyć pokazane wyniki, niektóre kroki są bardziej wymagające, podczas gdy inne mają miejsce na modyfikację i dostosowanie do konkretnych potrzeb i dostępnych zasobów.
Na przykład jednym z ważnych kroków w celu zapewnienia powtarzalnych wyników jest prawidłowe przygotowanie i przechowywanie odczynników zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabeli Materiałów. Białka cytoszkieletu (aktyna, tubulina, miozyna, kinezyna) są labilne i powinny być porcjowane, zamrażane w płomieniach ciekłym azotem i przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku. Po usunięciu z temperatury -80 °C podwielokrotności należy przechowywać na lodzie. Białka cytoszkieletu nie zachowują niezawodnie funkcji po dodatkowych cyklach zamrażania i rozmrażania.
Mikrotubule są bardziej wrażliwe na depolimeryzację i denaturację niż aktyna. Po usunięciu z temperatury -80 °C tubulina powinna być przechowywana na lodzie przed polimeryzacją i zużyta w ciągu 12 godzin. Po polimeryzacji mikrotubule należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Bardzo ważne jest również ustabilizowanie mikrotubul za pomocą taksolu, aby zapobiec depolimeryzacji. Stabilizacja faloidyny włókien aktyny jest również ważna dla stłumienia zużywającego ATP kieratu aktyny, który konkuruje z aktywnością miozyny i kinezyny.
Ultrawirowanie silników miozyny jest kolejnym krytycznym krokiem, ponieważ usuwa nieaktywne martwe głowice miozyny. Nieusunięcie enzymatycznie nieaktywnych monomerów powoduje bierne sieciowanie sieci aktynowej i utratę aktywności. Aby przedłużyć aktywność ATPazy silników, można włączyć system regeneracji ATP, taki jak fosforan kreatyny i fosfokinazakreatyny 64 .
Wreszcie, utrzymanie aktywności kompozytu wymaga zahamowania adsorpcji włókien i silników do ścianek komory próbki, co można osiągnąć poprzez pasywację szkiełek nakrywkowych i szkiełek mikroskopowych. Białka motoryczne są szczególnie podatne na adsorpcję, co powoduje, że kompozyt jest przyciągany do powierzchni komory próbki, przemieszcza się poza pole widzenia, zapada się do 2D i nie jest już poddawany aktywności. Silanizacja szkiełek nakrywkowych i szkiełek jest skutecznym sposobem pasywacji powierzchni i zapobiegania adsorpcji (patrz krok 1). Alternatywną metodą pasywacji stosowaną skutecznie w eksperymentach z cytoszkieletami in vitro jest pokrycie powierzchni dwuwarstwą lipidową, podobną do błony komórkowej18. Ta metoda jest korzystna, jeśli chce się przywiązać białka do powierzchni lub wprowadzić inne specyficzne interakcje białko-powierzchnia, ponieważ dwuwarstwa może być funkcjonalizowana. W przypadku eksperymentów z pęsetami optycznymi pasywacja mikrosfer jest również krytyczna i można ją osiągnąć poprzez pokrycie karboksylowanych mikrosfer BSA lub PEG za pomocą chemii sieciującej karbodimid48.
Istnieje kilka aspektów prezentowanych protokołów, które badacze mogą rozważyć zmianę w celu dostosowania do swoich potrzeb. Po pierwsze, naukowcy mogą zdecydować się na zastąpienie nienatywnych środków sieciujących biotynę-NA biologicznymi środkami sieciującymi, takimi jak alfa-aktynina lub MAP65, które sieciują odpowiednio aktynę i mikrotubule 28,65,66. Zastosowanie nienatywnych środków sieciujących w opisanych tutaj kompozytach jest motywowane ich zwiększoną odtwarzalnością, stabilnością i możliwością przestrajania w porównaniu z natywnymi sieciownikami. Ze względu na silne wiązanie biotyna-NA, można założyć, że środki sieciujące są trwałe, a nie większość natywnych środków sieciujących, które przejściowo wiążą się z szerokim zakresem rotacji. Dynamika przejściowego sieciowania komplikuje analizowanie wkładu środków sieciujących i silników w dynamikę. Co więcej, łączniki biotyna-NA mogą być wszechstronnie stosowane do sieciowania zarówno aktyny, jak i mikrotubul, a także sieciowania aktyny do mikrotubul. W ten sposób można dokonać jednoznacznego porównania między motywami sieciowania, zachowując wszystkie inne zmienne (np. rozmiar środka sieciującego, powinowactwo wiązania, stechiometrię itp.). Wreszcie, odczynniki potrzebne do włączenia łączników biotyna-NA są powszechnie dostępne na rynku, dobrze scharakteryzowane i powszechnie stosowane w wielu laboratoriach biofizycznych. Jednak jedną z kluczowych zalet opisanej tutaj platformy in vitro jest jej modułowość, więc naukowcy powinni być w stanie bezproblemowo zastąpić łączniki biotyna-NA natywnymi łącznikami, jeśli zechcą.
Po drugie, w obecnym protokole monomery aktyny i dimery tubuliny są polimeryzowane we włókna razem w probówce wirówkowej przed dodaniem do komory próbki. Przepuszczenie roztworu splątanych białek nitkowatych do komory próbki może spowodować wyrównanie przepływu, zwłaszcza mikrotubul, co powoduje zaburzenie pożądanej izotropii i jednorodności kompozytów. Rzeczywiście, dużym postępem we wcześniejszych pracach nad kompozytami aktynowo-mikrotubulowymi w stanie ustalonym była zdolność do kopolimeryzacji aktyny i mikrotubul in situ (w komorze próbki) w celu zapewnienia tworzenia izotropowych przenikających się sieci aktyny i mikrotubul 15,16,27. Jednak rozszerzenie tego podejścia na kompozyty aktywne wymagałoby dodania silników do próbki przed polimeryzacją aktyny i tubuliny oraz inkubacji całej próbki w temperaturze 37 °C przed eksperymentami. Testy tej odmiany protokołu wykazały zmniejszoną polimeryzację aktyny i brak dostrzegalnej aktywności motorycznej, prawdopodobnie z powodu konkurencyjnej aktywności ATPazy i przedłużonej inkubacji silników w temperaturze 37 °C. Na szczęście nie ma zauważalnego wyrównania przepływu kompozytów przy przestrzeganiu obecnych protokołów, co można zobaczyć na rysunku 2, rysunku 3 i rysunku 6. Niemniej jednak zachęca się naukowców do projektowania protokołów, które pozwalają na tworzenie aktywnych kompozytów in situ.
Kolejną kwestią do rozważenia jest schemat znakowania fluorescencji, który pociąga za sobą rzadkie znakowanie wszystkich filamentów aktynowych i mikrotubul w sieci. To podejście do etykietowania zostało zoptymalizowane pod kątem bezpośredniej wizualizacji struktury sieci, a nie wnioskowania o strukturze i dynamice za pomocą włókien znacznikowych lub mikrosfer. Jednak kompromis polega na tym, że poszczególne filamenty nie są jasno oznaczone i rozdzielcze. Jednym z podejść, które naukowcy mogą zastosować, aby zarówno rozdzielić pojedyncze włókna, jak i zobrazować strukturę sieci, jest domieszkowanie wstępnie uformowanych włókien znakowanych innym fluoroforem, dzięki czemu zarówno otaczająca sieć, jak i poszczególne włókna mogą być obrazowane jednocześnie. Jednak w przypadku stosowania więcej niż dwóch fluoroforów i kanałów wzbudzenia/emisji, przebijanie między kanałami jest często trudne do wyeliminowania, dlatego należy zachować ostrożność przy wyborze fluoroforów, filtrów i intensywności lasera.
Powiązanym ograniczeniem jest brak możliwości wizualizacji silników miozyny lub kinezyny w kompozytach. Zastosowane znakowane fluorescencyjnie monomery aktyny i dimery tubuliny są dostępne na rynku, podczas gdy wizualizacja miozyny lub kinezyny w kompozytach wymaga wewnętrznego znakowania. Zachęca się naukowców do podjęcia kolejnego kroku w celu oznaczenia silników, tak jak to zrobiono wcześniej18,67, aby móc jednoznacznie powiązać aktywność motoryczną i wiązanie z dynamiką i strukturami, które wykazują nasze kompozyty.
Na koniec należy zauważyć, że w obecnym protokole początek i czas trwania aktywności kinezyny nie jest kontrolowany. Ponieważ aktywność miozyny jest kontrolowana za pomocą fotodezaktywacji bróbstatyny, jak opisano powyżej, w celu wbudowania podobnej aktywacji świetlnej kinezyny, można włączyć aktywowane światłem ATP.
Aby zwiększyć złożoność opisanych tutaj projektów, aby lepiej naśladować warunki komórkowe i poszerzyć przestrzeń parametrów dynamiczno-struktura-funkcja, przyszłe prace skupią się na włączeniu włókien pośrednich, takich jak wimentyna68,69, a także innych silników, takich jak dyneina13,70. Żelsolina zostanie również włączona w różnych stężeniach w celu kontrolowania długości aktyny14, a także białka tau w celu kontrolowania sztywności mikrotubul.
Podsumowując, przedstawione protokoły opisują, w jaki sposób projektować, tworzyć i charakteryzować dynamikę, strukturę i mechanikę systemów materii aktywnej inspirowanych cytoszkieletem, które zawierają dwa oddzielne składniki generujące siłę czynną, które działają na różne podłoża w jednym systemie. Ta przestrajalna i modułowa platforma przybliża wysiłki związane z rekonstytucją o jeden ważny krok do naśladowania cytoszkieletu komórkowego i oferuje unikalną możliwość programowania jego właściwości w szerokiej przestrzeni fazowej poprzez niezależne włączanie, usuwanie i dostrajanie różnych komponentów. Co więcej, wszystkie komponenty tego wszechstronnego systemu są dostępne na rynku (patrz tabela materiałów), z wyjątkiem dimerów kinezynowych, które są oczyszczane w Ross Lab, jak opisano wcześniej50, i dostępne na życzenie. Wreszcie, cały kod analizy jest dostępny bezpłatnie za pośrednictwem GitHub49 i jest oparty na wolnych językach programowania i oprogramowaniu (Python i Fidżi). Miejmy nadzieję, że przejrzyste rozpowszechnianie protokołów do projektowania tych systemów sprawi, że platforma ta będzie bardziej dostępna dla zróżnicowanej grupy użytkowników o różnej wiedzy specjalistycznej, pochodzeniu, przynależności instytucjonalnej i celach badawczych.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Christopher Currie1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University
to:
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Maya Hendija1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

Cytoszkielet to dynamiczna sieć kompozytowa oddziałujących ze sobą biopolimerów, która zapewnia strukturalne i mechaniczne wsparcie komórkom. Powiązane silniki molekularne i białka wiążące restrukturyzują i dostosowują cytoszkielet, aby umożliwić komórkom wzrost, zmianę kształtu, sztywnienie, poruszanie się, a nawet samoleczenie, umożliwiając niezliczone procesy komórkowe, od migracji i podziału po mechanosensing1,2. Poza znaczeniem w biofizyce komórkowej, cytoszkielet jest również kwintesencją materii aktywnej z potencjalnymi zastosowaniami materiałowymi, od gojenia ran i dostarczania leków po filtrację i miękką robotykę1,3,4,5,6,7,8,9.
Dwie kluczowe cechy, które nadają cytoszkieletowi unikalną strukturalną i mechaniczną różnorodność oraz wielofunkcyjność, to: 1) jego kompozytowa natura, składająca się z wielu oddziałujących ze sobą filamentów białkowych, takich jak półelastyczne filamenty aktynowe i sztywne mikrotubule, a także związane z nimi białka wiążące i sieciujące3,5,10; oraz 2) jego zdolność do ciągłej restrukturyzacji, poruszania się, zgrubienia i wykonywania pracy za pomocą energochłonnych silników, takich jak miozyny i kinezyny, popychających i ciągnących białka nitkowate1,7,11,12,13. Podczas gdy ta elegancka złożoność umożliwia cytoszkieletowi pośredniczenie w procesach tak różnorodnych, jak ruchliwość komórek, cytokineza i gojenie się ran3,6,7,11, utrudnia to badaczom odtworzenie charakterystycznych cech cytoszkieletu in vivo w odtworzonych systemach in vitro.
Obecne wysiłki związane z rekonstytucją granic koncentrują się na kompozytach splątanych i usieciowanych włókien aktynowych oraz mikrotubul3,10,14,15,16,17, sieci aktomiozyny generujące siły2,8, 18,19,20,21, oraz aktywne nematyki sterowane interakcjami kinezyna-mikrotubula22,23,24,25,26. Wykazano, że kompozyty aktynowo-mikrotubule w stanie ustalonym wykazują powstańcze właściwości mechaniczne15,16,27, takie jak zwiększona mobilność włókien i zwiększona sztywność w porównaniu z systemami jednoskładnikowymi27. Badania nad układami aktomiozyny in vitro wykazały szeroki zakres właściwości strukturalnych i dynamicznych, które zależą od stężeń aktyny, miozyny i środków sieciujących28,29,30,31. Na przykład, przy wystarczającym usieciowaniu, sieci aktomiozyny ulegają dużemu skurczeniu i zgrubnieniu2,28,30,32,33,34,35,36, podczas gdy bez crosslinkerów sieci wyświetlają się szybko, destabilizujący przepływ i pękanie19,29. Doniesiono, że odtworzone aktywne nematyki oparte na mikrotubulach, które wykorzystują klastry silników kinezynowych do sieciowania i ciągnięcia wiązek mikrotubul, wykazują długotrwałe przepływy turbulentne, rozciąganie, wyboczenie, pękanie i gojenie12,22,23,24,25,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47.
Ostatnio wykazano, że kompozyty aktynowo-mikrotubulowe napędzane mini-włóknami miozyny II prowadzą do bardziej uporządkowanego skurczu i integralności sieci w porównaniu z nieuporządkowanym przepływem i pęknięciem sieci, które wykazują sieci aktomiozyny bez środków sieciujących17,26,48. Co więcej, połączenie wytrzymałości kompozytu i generowania siły jest zoptymalizowane, gdy aktyna i mikrotubule są obecne w porównywalnych stężeniach. Kluczowe cechy pojawiające się w tym obszarze przestrzeni formulacji obejmują zwiększoną wytrzymałość mechaniczną26, skoordynowany ruch aktyny i mikrotubul26, stały, utrzymujący się skurcz i restrukturyzację mezoskalową17.
Tutaj opisane są protokoły do inżynierii i dostrajania współsplątanych i usieciowanych kompozytów mikrotubul i włókien aktynowych, które są wypychane z równowagi przez mini-filamenty miozyny II i klastry kinezyny działające odpowiednio na filamenty aktynowe i mikrotubule (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dynamika, struktura i mechanika tej klasy kompozytów może być dostrojona przez względne stężenia włókien, silników i środków sieciujących, aby wykazać bogatą przestrzeń fazową przepływu adwekcyjnego i turbulentnego, skurczu izotropowego, przyspieszenia, opóźnienia, wymieszania, usztywnienia, relaksacji i pękania. Prace te koncentrują się na przygotowaniu i dostrojeniu tej klasy aktywnych kompozytów cytoszkieletu. Jednak, aby pomóc naukowcom w analizie porównawczej i charakterystyce opisywanych aktywnych kompozytów, szczegółowo opisano również skuteczne metody obrazowania wykorzystujące wielospektralną mikroskopię konfokalną. Na koniec przedstawiono wyniki kluczowych metod analizy obliczeniowej, które można wykorzystać do pomiaru dynamiki, struktury i mechaniki kompozytów. Zachęca się naukowców do stosowania tych metod - które obejmują różnicową mikroskopię dynamiczną (DDM), autokorelację obrazu przestrzennego (SIA) i prędkość obrazu cząstek (PIV) - ponieważ zostały one zoptymalizowane w celu scharakteryzowania złożonej dynamiki i różnorodności strukturalnej kompozytów17,26,49.
Kroki opisane poniżej skupiają się na przygotowaniu kompozytów i zobrazowaniu ich za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokoły opisujące analizę danych po akwizycji i pomiary pęsetą optyczną można znaleźć w poprzednich pracach 17,26,48,50, i dostarczane na życzenie. Wszystkie materiały są wymienione w dostarczonej tabeli materiałów.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin &nbsp; Skrót używany w papierze: blebbistatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0560</td><td>Stężenie w magazynie: 200 &mu; M w DMSO Storage: wysuszony, w DMSO, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: </mocny> rozpuścić 1 mg proszku do 200 &mu; M w DMSO Storage, handling, troubleshooting Uwagi: ograniczony okres przydatności do spożycia, zwykle przestaje działać niezawodnie po 3-4 miesiącach. Kupuj i przygotowuj nowe rozwiązanie co 3 miesiące.</td></tr><tr><td>1:20 488-tubulina: mieszanina tubuliny &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: 5-488-tubulina</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: jednorazowe podwielokrotności, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Przepisy na zapasy i eksperymenty:</mocny> mieszaj tubulinę i tubulinę 488 w stosunku 20:1, błyskawiczne zamrażanie z LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ordm; C, chronić przed światłem</td></tr><tr><td>1:20 R-tubulina: mieszanina tubuliny &nbsp; Skrót używany w papierze: 5-R-tubulina</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania < silny> Przepisy na zapasy i eksperymenty: < / silny> mieszaj tubulinę i tubulinę rodaminy w stosunku 20: 1, błyskawiczne zamrażanie z LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ordm; C, chronić przed lekką</td></tr><tr><td>aktyną (biotyną): mięśnie szkieletowe &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: cytoszkielet biotynowo-aktynowy</td><td></td><td>AB07</td><td>Stężenie zapasów: 1 mg / ml w buforze G Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść do 1 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: (1) bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 0,5 mg / ml w PEM, (2) po usunięciu z -80&ordm; C, sklep&nbsp; podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C przez okres do 1 tygodnia</td></tr><tr><td>aktyna (rodamina): mięśnie szkieletowe królika &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: < / silny></td><td>Cytoszkielet</td> R-aktyny <td>AR05</td><td><silny> Stężenie magazynowe: < / silny> 1,5 mg / ml w buforze G <silny> Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Przepisy na zapasy i eksperymenty: rozpuść do 1,5 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: po wyjęciu z -80&ordm; C, sklep&nbsp; podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C, może być stosowany przez okres do 1 tygodnia</td></tr><tr><td>adenozynotrifosforanu &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: ATP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048</td><td>Stężenie zapasów: 100 mM Przechowywanie: w roztworze (pH 7), -20&ordm; Przepisy na < / > i eksperymentalne: rozpamiętywać w DI H 20, doprowadzić pH do 7 za pomocą NaOH Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: rutynowo sprawdzaj pH i dostosuj w razie potrzeby, hydrolizuje z czasem, wymieniaj co ~ 6-12 miesięcy</td></tr><tr><td>AlexaFluor488 Phalloidin &nbsp; Skrót używany w papierze: 488-falloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Stężenie magazynu: 100 &mu; M DMSO < mocny> Przechowywanie: < / mocny> chroniony przed światłem, wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuszczone do 100 &mu; M z DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 20 &mu; M w PEM (1 &mu; L w 4 i mu; L PEM)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488&ndash; Oznaczone aktyną &nbsp; Skrót używany w papierze: 488-aktyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A12373</td><td>Stężenie zapasów: 1,5 mg / ml w buforze G Przechowywanie: podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: < / silny> rozpuść do 1,5 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: ten produkt został wycofany</td></tr><tr><td>Podstawowy środek do czyszczenia plazmowego &nbsp; Skrót używany w papierze: środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Bemis&nbsp; Laboratoryjna folia do owijania Parafilm M &nbsp; Skrót używany w papierze:</mocna> przezroczysta folia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-374-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza &nbsp; Skrót używany w papierze:&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1682836</td><td><silny>Stężenie zapasów: < / silny> 100x <silny>Przechowywanie: < / silny> przechowywać w stężeniu magazynowym (100x) lub 10x, wysuszony, w temperaturze -20&ordm; C Stock and Experiment Recipes: rozpuść proszek do 4,5 mg / ml w DI H20 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: końcowe stężenie w roztworze powinno 45 &mu; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Biotyna &nbsp; < silny> Skrót używany w papierze: < / mocny> biotyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td><silny> Stężenie zapasów: < / silny> 1,02 mM w PEM < silny> Przechowywanie: </mocny> suszony, 4&ordm; C</td></tr><tr><td>dejonizowana woda nanoczysta &nbsp; Skrót używany w papierze: DI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyldichlorosilane &nbsp; Skrót używany w papierze: silan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/3820/PB05</td><td>Stężenie zapasów: 2% rozpuszczone w Toulene</td></tr><tr><td>Dithiothreitol &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Stock Stężenie: 1 M w DMSO Storage: wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozcieńczyć do 2 mM w PEM bezpośrednio przed każdym eksperymentem</td></tr><tr><td>DMSO Bezwodny &nbsp; Skrót używany w papierze: DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>F-Buffer &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: F-buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stock Concentration: 10x Storage: wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: 10 mM Imidazol (pH 7,0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,2 mM ATP</td></tr><tr><td>G-Buffer &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: G-buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stock Concentration: 10x Storage: wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: 2,0 mM Tris (pH 8), 0,2 mM ATP, 0,5 mM DTT, 0,1 mM CaCl2. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe szklane &NBSP; Skrót używany w papierze: slajd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-310397</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa + katalaza + &beta;-merkaptoetanol &nbsp; Skrót używany w papierze: GOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133-250KU, C1345, 63689&nbsp;</td><td><silny> Stężenie zapasów: < / silny> 100x <silny>Przechowywanie: < / silny> przechowywać w stężeniu zapasowym (100x) lub 10x, wysuszony, w temperaturze -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: Dla 100x: 4,3 mg/ml oksydazy glukozowej, 0,7 mg/ml katalazy, 0,5% v/v&nbsp; &beta;-merkaptoetanol w DI H20 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: końcowe stężenie w roztworze powinno wynosić: 0,005% &beta;-merkaptoetanol, 43 &mu; g/ml oksydazy glukozowej, 7 &mu; g/ml katalazy</td></tr><tr><td>glu-GOC system oczyszczania tlenu &nbsp; < silny> Skrót używany w papierze: < / silny> glu-GOC</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>silny> Stężenie zapasów: < / mocny> 100x <silny> Przechowywanie: < / mocny> za każdym razem przygotuj świeży < silny> Przepisy na zapasy i eksperymenty: < / mocny> wymieszaj równe części Glu i GOC i dodaj w 1/100 końcowej objętości próbki bezpośrednio przed obrazowaniem Storage, Obsługa, uwagi dotyczące rozwiązywania problemów: przygotować z Glu i GOC bezpośrednio przed obrazowaniem</td></tr><tr><td>trifosforanu guanozyny &nbsp; < silny>Skrót używany w papierze: < / silny> GTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0461</td><td><silny> Stężenie magazynu: < / silny> 100 mM <silny> Przechowywanie: < / silny> 100 &mu; L podwielokrotności przy -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Instant Mix 1-minutowa żywica epoksydowa &nbsp; Skrót używany w papierze: epoksydowa</td><td>Loctite</td><td>1366072&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kinesin-1 401 BIO 6x HIS &nbsp; Skrót używany w papierze: kinezyna</td><td>Przygotowane w JL Ross Lab na Uniwersytecie w Syracuse</td><td>NA</td><<td>strong>Stężenie zapasów: 8,87 &mu; M w PEM Storage: jednorazowe podwielokrotności, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: </mocne> biotynylowane dimery tworzą klastry kinezyny, każda podwielokrotność może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ordm; C</td></tr><tr><td>NeutrAvidin &nbsp; Skrót używany w papierze: NA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Stężenie magazynowe: 5 mg / ml w PEM Przechowywanie: wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuścić proszek do 5 mg/ml w PEM</td></tr><tr><td>nr 1. Szkiełka nakrywkowe szklane (24 mm x 24 mm) &nbsp; Skrót używany w papierze: szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-CP</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel&nbsp; &nbsp; Skrót używany w papierze: Taxol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td>Stock Stężenie: 2 mM w DMSO Przechowywanie: chroniony przed światłem, wysuszony, -20&ordm; C Receptury magazynowe i eksperymentalne: rozpuścić do 2 mM za pomocą DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 200 &mu; M w DMSO (0,4 &mu; L w 3,6 i mu; L DMSO)</td></tr><tr><td>PEM-100 &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: PEM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stock Stężenie:< / mocny> 1x <silny>Przechowywanie:</mocny> temperatura pokojowa (RT) <silny>Receptury magazynowe i eksperymentalne:</mocny> 100 mM K-RURY (pH 6,8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: użyj KOH, aby dostosować pH do 6,8, często sprawdzaj pH i odpowiednio dostosuj</td></tr><tr><td>falloidynę Skrót używany w papierze: falloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3457</td><td>Stock Stężenie: </mocny> 100 &mu; M w DMSO Przechowywanie: </mocne> chronione przed światłem, wysuszone, -20&ordm; C, ściśle przestrzegaj warunków przechowywania / obchodzenia się < silny> Receptury magazynowe i eksperymentalne: < / silny> rozpuszczony do 100 &mu; M z DMSO Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: podatny na zanieczyszczenia podczas jego przygotowania i denaturacji, identyfikowalny jako duże amorficzne agregaty aktyny w próbkach</td></tr><tr><td>tubulina mózgu świni &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: < / silny> tubulinowy</td><td>cytoszkielet</td><td>T240</td><td>Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM <silny>Przechowywanie: </silny> jednorazowe podwielokrotności, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C</td></tr><tr><td>Chlorek potasu &nbsp; Skrót używany w papierze: KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td>Stock Stężenie: 4 M Przechowywanie: RT</td></tr><tr><td>Aktyna szkieletowa królika &nbsp; Skrót używany w papierze: < / silny> aktynowy</td><td>cytoszkielet</td><td>AKL99</td><td>Stężenie magazynowe: < / silny> 2 mg / ml w buforze G <silny> Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść do 2 mg / ml w buforze G, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Storage, handling, troubleshooting Uwagi: po wyjęciu z -80&ordm; C, sklep&nbsp; podwielokrotność na lodzie w 4&ORDM; C, może być stosowany przez okres do 1 tygodnia</td></tr><tr><td>Miozyna szkieletowa królika II &nbsp; <silny>Skrót używany w papierze: </silny> cytoszkielet miozyny</td><td></td><td>MY02</td><td><silny> Stężenie zapasów: < / silny> 10 mg / ml w PEM <silny>Przechowywanie:</silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: < / mocny> rozpuść proszek do 10 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: monomery </mocne> tworzą minifilamenty o niskim KCl, każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ordm; C</td></tr><tr><td>Tubulina (biotyna): mózg świni &nbsp; < silny>Skrót używany w papierze: < / silny> biotynowo-tubulinowy</td><td>cytoszkielet</td><td>T333P</td><td>Stężenie zapasów: < / silny> 5 mg / ml w PEM <silny>Przechowywanie:</mocny> jednorazowe podwielokrotności, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć do 0,5 mg / ml w tubulinie PEM</td></tr><tr><td>(fluorescencyjna HiLyte 488): Mózg świni &nbsp; Skrót używany w papierze: < / silny> cytoszkielet 488-tubulinowy</td><td></td><td>TL488M</td><td>Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM <silny> Przechowywanie: < / silny> jednorazowe porcje, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C, chronić przed lekką</td></tr><tr><td>tubuliną (rodaminą): mózg świni &nbsp; Skrót używany w papierze: < / silny></td><td>Cytoszkielet</td> R-tubulinowy <td>TL590M</td><td><silny>Stężenie magazynowe: < / silny> 5 mg / ml w PEM <silny> Przechowywanie: < / silny> podwielokrotności jednorazowego użytku, -80&ordm; C, unikaj cykli zamrażania i rozmrażania Stock i eksperymentuj Przepisy: rozpuść proszek do 5 mg / ml w PEM, błyskawiczne zamrażanie za pomocą LN2 Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi: każda porcja może być używana do 12 godzin przechowywana na lodzie w temperaturze 4&ORDM; C, chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Tween 20 &nbsp; Skrót używany w papierze: Tween20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605. AP</td><<td>strong>Stężenie zapasów: < / silny> 1% v / v w DI H20 <silny> Przechowywanie: < / mocny></td></tr><tr><td>Mikrorurki ultrawirówki RT &nbsp; Skrót używany w papierze: Beckman-Coulter Optima Max XP&nbsp;</td><td>Beckman Coultier</td><td>343776</td><td>Przechowywanie, obsługa, rozwiązywanie problemów Uwagi:</mocny> 8x34 mm PC</td></tr><tr><td>Klej utwardzany światłem UV &nbsp; Skrót używany w papierze: Klej UV</td><td>Pharda</td><td>SKG-2869</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

Cytoszkielet kompozytowy, składający się z oddziałujących ze sobą sieci półelastycznych włókien aktynowych i sztywnych mikrotubul, restrukturyzuje się i generuje siły, wykorzystując białka motoryczne, takie jak miozyna II i kinezyna, do kierowania kluczowymi procesami, takimi jak migracja, cytokineza, adhezja i mechanosensing. Podczas gdy interakcje aktyna-mikrotubule są kluczem do wszechstronności i zdolności adaptacyjnych cytoszkieletu, zrozumienie ich wzajemnego oddziaływania z aktywnością miozyny i kinezyny jest wciąż w powijakach. W tej pracy opisano, jak zaprojektować przestrajalne trójwymiarowe sieci kompozytowe współsplątanych włókien aktynowych i mikrotubul, które przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzane silnikami miozyny II i kinezyny i są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących. Szczegółowo opisano również protokoły znakowania fluorescencyjnego mikrotubul i filamentów aktynowych w celu jak najskuteczniejszej wizualizacji restrukturyzacji i ruchu kompozytu za pomocą wielospektralnego obrazowania konfokalnego. Na koniec przedstawiono wyniki metod analizy danych, które można wykorzystać do ilościowego scharakteryzowania struktury, dynamiki i mechaniki nierównowagowej. Odtworzenie i zbadanie tej przestrajalnej platformy biomimetycznej dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób sprzężona aktywność motoryczna, mechanika kompozytowa i dynamika włókien mogą prowadzić do niezliczonych procesów komórkowych, od mitozy, przez polaryzację, po mechano-czucie.

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Nasza praca przybliża wysiłki związane z rekonstytucją cytoszkieletu o ważny krok w kierunku naśladowania warunków komórkowych poprzez inżynierię kompozytów aktyny i mikrotubul, napędzanych silnikami kinezyny i miozyny w celu aktywnego dostrajania, restrukturyzacji i ruchu. Dynamikę i strukturę naszych kompozytów można precyzyjnie zaprogramować poprzez niezależne dodawanie, usuwanie i dostrajanie różnych składników, aby wykazywały bogatą bazę fazową skurczu, infekcji, zaniku, zgrubienia i pęknięcia. Nasze podejście ma szerokie zastosowanie w projektowaniu, tworzeniu i charakteryzowaniu platform materii aktywnej, które zawierają wiele komponentów generujących siłę, które działają na różne podłoża w jednym systemie.Procedurę zademonstrują Daisy Achiriloaie i Maya Hendija. Studenci studiów licencjackich z naszego laboratorium. Na początek dodaj odczynniki do sterylnej czarnej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek pipet, aby utworzyć klastry motoryczne kinezyny, które wiążą się i wywierają siły między parami mikrotubul.Delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Następnie inkubuj roztwór przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, chroń go przed światłem. Aby przygotować splątaną sieć kompozytową filamentów aktonowych i mikrotubul, ustaw blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza.Dodaj odczynniki do sterylnej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,6 mililitra. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 mikrolitrów. Delikatnie odpipetuj roztwór w górę i w dół, aby go wymieszać i umieść na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionym przed światłem przez godzinę.Następnie wyjmij probówkę z bloku grzewczego i za pomocą mikropipety delikatnie wymieszaj 0,84 mikrolitra 100 mikromolowej falloidyny. Inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Aby przygotować aktywne kompozyty do obrazowania koncentrycznego, dodaj odczynniki do roztworu i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół.Podzielić roztwór na trzy podwielokrotności po 10 mikrolitrów i oznaczyć je jako K, K plus M i kontrolę ujemną. Dodać 2,54 mikrolitra miozyny do podwielokrotności K plus M i 2,54 mikrolitra PEM do podwielokrotności K i kontroli ujemnej. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra klastrów Kinesin do porcji K i K plus M i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.Następnie dodaj 2,5 mikrolitra PEM do kontroli ujemnej przy użyciu tej samej techniki. Za pomocą mikropipety powoli przelej każdy roztwór do odpowiedniego kanału komory na próbki za pomocą działania kapilarnego. Bardzo powoli i delikatnie dociskaj pipetę, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kanału.Uszczelnij dwa otwarte końce każdego kanału za pomocą szybkoschnącego kleju epoksydowego lub utwardzanego promieniami UV. Gdy klej jest całkowicie suchy, umieść kanał na mikroskopie, aby zobrazować kompozyt jak najbardziej zbliżony do początkowego stanu nieaktywnego. Najpierw zobrazuj kanał K i kanały K plus M, a następnie kanał sterujący.Zwróć uwagę na czas, jaki upłynął między dodaniem klastrów Kinesin do podwielokrotności K i K plus M a rozpoczęciem pozyskiwania danych. Aby przygotować aktynę do aktyny lub środków sieciujących AA, dodaj Biotynę-Aktynę, NeutrAwidynę, Biotynę i PEM do mikroprobówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Podobnie, w przypadku mikrotubul do mikrotubul lub środków sieciujących MM, dodaj biotynę-tubulinę, NeutrAvidin, Biotynę i PEM do probówki mikrowirówki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.Owiń rurkę termoplastyczną folią sufitową, aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie i umieść je na tratwie flotacyjnej w wannie sonicater o kontrolowanej temperaturze, ustawionej na cztery stopnie Celsjusza na 90 minut. Aby włączyć kompleksy sieciujące A-A do próbek do obrazowania, dodaj odczynniki do probówki z mikrowirówką. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 mikrolitrów.Podobnie w przypadku kompleksów sieciujących M-M dodaj odczynniki pokazane na ekranie do mikroprobówki wirówkowej. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie umieść go na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionym przed światłem przez godzinę. Następnie wyjmij probówkę z bloku grzewczego i za pomocą mikropipety wymieszaj 0,84 mikrolitra 100 mikromolowej falloidyny.Inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem i powtórzyć procedurę pokazaną wcześniej, aby przygotować aktywne kompozyty do obrazowania konfokalnego. Monowłókna aktyny i dimery tubulinowe są kopolimeryzowane, tworząc splątane sieci włókien aktynowych i mikrotubul. Miozyna dwa mini filamenty i klastry kinezyny popychają i ciągną włókna, aby wyprowadzić kompozyty ze stanu ustalonego.Pasywne sieciowanie uzyskuje się za pomocą NeutrAwidyny w celu połączenia biotynylowanych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Dwa mini filamenty miozyny, klastry kinezyny lub oba silniki są wbudowane w kompozyty bez pasywnych usieciowań krzyżowych, wiązań krzyżowych aktyna-aktyna i wiązań krzyżowych mikrotubula-mikrotubula. Pokazano tutaj dwukolorowe obrazowanie konfokalne kompozytów cytoszkieletowych napędzanych miozyną o różnych stężeniach miozyny i molowych frakcjach aktyny.Prędkość obrazu cząstek pokazuje, że aktywność miozyny aktynowej wyzwala skoordynowaną dynamikę kurczliwości aktyny i mikrotubul w splątanych współkompozytach. W tym przypadku różne kolory strzałek odpowiadają różnym prędkościom, jak wskazano na skali kolorów po prawej stronie pól wektorowych. Dynamiczna mikroskopia różnicowo-czasowa jest wykonywana na kanałach mikrotubul i aktyny szeregów czasowych w celu określenia charakterystyki czasów rozpadu w funkcji liczby falowej zarówno dla aktyny, jak i mikrotubul.Prędkości skurczu są określane za pomocą krzywych czasu dopasowania do zaniku, uśrednionych dla wszystkich czasów opóźnienia dla całego czasu trwania każdego 45-minutowego szeregu czasowego. Dynamiczna mikroskopia różnicowo-czasowa określa ilościowo, w jaki sposób dynamika zmienia się w czasie, oceniając czasy rozpadu dla kolejnych sześciominutowych interwałów w ciągu 45-minutowego czasu aktywacji aktyny i mikrotubul. Czasowo-rozdzielcze prędkości skurczu dla filamentów aktynowych i mikrotubul są określane na podstawie dopasowań do odpowiednich krzywych czasu rozpadu.Analiza automatycznej korelacji obrazu przestrzennego określa ilościowo napędzaną motorycznie restrukturyzację aktywnych komponentów cytoszkieletu poprzez porównanie krzywych automatycznej korelacji dla różnych sieci na początku eksperymentu w porównaniu z końcem. Długości korelacji czasowo-rozdzielczej wyznaczone za pomocą wykładniczych pasowań krzywych automatycznej korelacji pokazują kompozyty, które nie ulegają restrukturyzacji, w porównaniu z tymi, które znacznie się restrukturyzują. Dwa kolorowe obrazy konfokalne kompozytów mikrotubul aktynowych napędzanych kinezyną pokazują restrukturyzację zależną od preparatu w czasie, bez usieciowania, kompozyty przekształcają się w luźno połączone klastry bogate w mikrotubule.Sieciowanie aktyna-aktyna wspiera kolokalizację mikrotubul aktyny, podczas gdy sieciowanie mikrotubul-mikrotubula poprawia mieszanie D. Różnicowa mikroskopia dynamiczna i analiza automatycznej korelacji obrazów przestrzennych pokazują wpływ sieciowania i konkurujących ze sobą silników mycyny i kinezyny na zmieniającą się w czasie dynamikę i strukturę kompozytów. Aby dokładniej naśladować warunki komórkowe, naukowcy mogą włączyć włókna pośrednie, inne silniki i białka wiążące, które kontrolują długość i sztywność włókien.Pęsety optyczne można również wykonywać pomiary metrologiczne w celu scharakteryzowania mechaniki kompozytów. Korzystając z naszego podejścia, naukowcy mogą precyzyjnie dostroić dynamikę i strukturę kompozytowej materii aktywnej inspirowanej cytoszkieletem w bezprecedensowej przestrzeni fazowej, aby emulować różnorodne procesy komórkowe i opracowywać rekonfigurowalne materiały programowalne.

reconstituting-characterizing-actin-microtubule-composites-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj metodę rekonstrukcji kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych kinezyną i miozyną do badania dynamiki cytoszkieletu. Technika ta umożliwia precyzyjne programowanie struktury i zachowań materii aktywnej.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Przeglądaj więcej filmów