Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Nasza praca przybliża wysiłki związane z rekonstytucją cytoszkieletu o ważny krok w kierunku naśladowania warunków komórkowych poprzez inżynierię kompozytów aktyny i mikrotubul, napędzanych silnikami kinezyny i miozyny w celu aktywnego dostrajania, restrukturyzacji i ruchu. Dynamikę i strukturę naszych kompozytów można precyzyjnie zaprogramować poprzez niezależne dodawanie, usuwanie i dostrajanie różnych składników, aby wykazywały bogatą bazę fazową skurczu, infekcji, zaniku, zgrubienia i pęknięcia. Nasze podejście ma szerokie zastosowanie w projektowaniu, tworzeniu i charakteryzowaniu platform materii aktywnej, które zawierają wiele komponentów generujących siłę, które działają na różne podłoża w jednym systemie.

Procedurę zademonstrują Daisy Achiriloaie i Maya Hendija. Studenci studiów licencjackich z naszego laboratorium. Na początek dodaj odczynniki do sterylnej czarnej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek pipet, aby utworzyć klastry motoryczne kinezyny, które wiążą się i wywierają siły między parami mikrotubul.

Delikatnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Następnie inkubuj roztwór przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, chroń go przed światłem. Aby przygotować splątaną sieć kompozytową filamentów aktonowych i mikrotubul, ustaw blok grzewczy na 37 stopni Celsjusza.

Dodaj odczynniki do sterylnej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,6 mililitra. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 mikrolitrów. Delikatnie odpipetuj roztwór w górę i w dół, aby go wymieszać i umieść na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionym przed światłem przez godzinę.

Następnie wyjmij probówkę z bloku grzewczego i za pomocą mikropipety delikatnie wymieszaj 0,84 mikrolitra 100 mikromolowej falloidyny. Inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Aby przygotować aktywne kompozyty do obrazowania koncentrycznego, dodaj odczynniki do roztworu i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół.

Podzielić roztwór na trzy podwielokrotności po 10 mikrolitrów i oznaczyć je jako K, K plus M i kontrolę ujemną. Dodać 2,54 mikrolitra miozyny do podwielokrotności K plus M i 2,54 mikrolitra PEM do podwielokrotności K i kontroli ujemnej. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra klastrów Kinesin do porcji K i K plus M i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.

Następnie dodaj 2,5 mikrolitra PEM do kontroli ujemnej przy użyciu tej samej techniki. Za pomocą mikropipety powoli przelej każdy roztwór do odpowiedniego kanału komory na próbki za pomocą działania kapilarnego. Bardzo powoli i delikatnie dociskaj pipetę, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kanału.

Uszczelnij dwa otwarte końce każdego kanału za pomocą szybkoschnącego kleju epoksydowego lub utwardzanego promieniami UV. Gdy klej jest całkowicie suchy, umieść kanał na mikroskopie, aby zobrazować kompozyt jak najbardziej zbliżony do początkowego stanu nieaktywnego. Najpierw zobrazuj kanał K i kanały K plus M, a następnie kanał sterujący.

Zwróć uwagę na czas, jaki upłynął między dodaniem klastrów Kinesin do podwielokrotności K i K plus M a rozpoczęciem pozyskiwania danych. Aby przygotować aktynę do aktyny lub środków sieciujących AA, dodaj Biotynę-Aktynę, NeutrAwidynę, Biotynę i PEM do mikroprobówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Podobnie, w przypadku mikrotubul do mikrotubul lub środków sieciujących MM, dodaj biotynę-tubulinę, NeutrAvidin, Biotynę i PEM do probówki mikrowirówki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Owiń rurkę termoplastyczną folią sufitową, aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie i umieść je na tratwie flotacyjnej w wannie sonicater o kontrolowanej temperaturze, ustawionej na cztery stopnie Celsjusza na 90 minut. Aby włączyć kompleksy sieciujące A-A do próbek do obrazowania, dodaj odczynniki do probówki z mikrowirówką. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 25 mikrolitrów.

Podobnie w przypadku kompleksów sieciujących M-M dodaj odczynniki pokazane na ekranie do mikroprobówki wirówkowej. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie umieść go na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionym przed światłem przez godzinę. Następnie wyjmij probówkę z bloku grzewczego i za pomocą mikropipety wymieszaj 0,84 mikrolitra 100 mikromolowej falloidyny.

Inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem i powtórzyć procedurę pokazaną wcześniej, aby przygotować aktywne kompozyty do obrazowania konfokalnego. Monowłókna aktyny i dimery tubulinowe są kopolimeryzowane, tworząc splątane sieci włókien aktynowych i mikrotubul. Miozyna dwa mini filamenty i klastry kinezyny popychają i ciągną włókna, aby wyprowadzić kompozyty ze stanu ustalonego.

Pasywne sieciowanie uzyskuje się za pomocą NeutrAwidyny w celu połączenia biotynylowanych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Dwa mini filamenty miozyny, klastry kinezyny lub oba silniki są wbudowane w kompozyty bez pasywnych usieciowań krzyżowych, wiązań krzyżowych aktyna-aktyna i wiązań krzyżowych mikrotubula-mikrotubula. Pokazano tutaj dwukolorowe obrazowanie konfokalne kompozytów cytoszkieletowych napędzanych miozyną o różnych stężeniach miozyny i molowych frakcjach aktyny.

Prędkość obrazu cząstek pokazuje, że aktywność miozyny aktynowej wyzwala skoordynowaną dynamikę kurczliwości aktyny i mikrotubul w splątanych współkompozytach. W tym przypadku różne kolory strzałek odpowiadają różnym prędkościom, jak wskazano na skali kolorów po prawej stronie pól wektorowych. Dynamiczna mikroskopia różnicowo-czasowa jest wykonywana na kanałach mikrotubul i aktyny szeregów czasowych w celu określenia charakterystyki czasów rozpadu w funkcji liczby falowej zarówno dla aktyny, jak i mikrotubul.

Prędkości skurczu są określane za pomocą krzywych czasu dopasowania do zaniku, uśrednionych dla wszystkich czasów opóźnienia dla całego czasu trwania każdego 45-minutowego szeregu czasowego. Dynamiczna mikroskopia różnicowo-czasowa określa ilościowo, w jaki sposób dynamika zmienia się w czasie, oceniając czasy rozpadu dla kolejnych sześciominutowych interwałów w ciągu 45-minutowego czasu aktywacji aktyny i mikrotubul. Czasowo-rozdzielcze prędkości skurczu dla filamentów aktynowych i mikrotubul są określane na podstawie dopasowań do odpowiednich krzywych czasu rozpadu.

Analiza automatycznej korelacji obrazu przestrzennego określa ilościowo napędzaną motorycznie restrukturyzację aktywnych komponentów cytoszkieletu poprzez porównanie krzywych automatycznej korelacji dla różnych sieci na początku eksperymentu w porównaniu z końcem. Długości korelacji czasowo-rozdzielczej wyznaczone za pomocą wykładniczych pasowań krzywych automatycznej korelacji pokazują kompozyty, które nie ulegają restrukturyzacji, w porównaniu z tymi, które znacznie się restrukturyzują. Dwa kolorowe obrazy konfokalne kompozytów mikrotubul aktynowych napędzanych kinezyną pokazują restrukturyzację zależną od preparatu w czasie, bez usieciowania, kompozyty przekształcają się w luźno połączone klastry bogate w mikrotubule.

Sieciowanie aktyna-aktyna wspiera kolokalizację mikrotubul aktyny, podczas gdy sieciowanie mikrotubul-mikrotubula poprawia mieszanie D. Różnicowa mikroskopia dynamiczna i analiza automatycznej korelacji obrazów przestrzennych pokazują wpływ sieciowania i konkurujących ze sobą silników mycyny i kinezyny na zmieniającą się w czasie dynamikę i strukturę kompozytów. Aby dokładniej naśladować warunki komórkowe, naukowcy mogą włączyć włókna pośrednie, inne silniki i białka wiążące, które kontrolują długość i sztywność włókien.

Pęsety optyczne można również wykonywać pomiary metrologiczne w celu scharakteryzowania mechaniki kompozytów. Korzystając z naszego podejścia, naukowcy mogą precyzyjnie dostroić dynamikę i strukturę kompozytowej materii aktywnej inspirowanej cytoszkieletem w bezprecedensowej przestrzeni fazowej, aby emulować różnorodne procesy komórkowe i opracowywać rekonfigurowalne materiały programowalne.