Name: Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę łączącą mikrofluidykę z mikroskopią fluorescencyjną do badania dynamiki pojedynczych filamentów aktyny. Technika umożliwia kontrolę warunków biochemicznych i mechanicznych oraz ilościową analizę reakcji białek wiążących aktynę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni B. Ladoux i R.-M. Mège lab za korzystanie z ich urządzeń do czyszczenia UV, a J. Heuvingh i 0. du Roure za wstępne szkolenie, które odbyliśmy w zakresie przygotowania form na płytkach krzemowych i udzielania wskazówek dotyczących mikrofluidyki. Potwierdzamy dofinansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych StG-679116 (dla A.J.) oraz Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin i Conformin (dla G.R.-L.).

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W porównaniu ze standardowymi metodami jednowłókienkowymi, w których filamenty aktynowe są zakotwiczone w powierzchni przez wiele punktów na swojej długości lub utrzymywane blisko niej przez czynnik stłoczenia, taki jak metyloceluloza, mikrofluidyka oferuje szereg korzyści. Ponieważ interakcje z powierzchnią są minimalne, unika się sztucznych przerw, które te interakcje mogą wywołać zarówno podczas wydłużania, jak i depolimeryzacji. Włókna są ustawiane przez przepływ, równolegle do siebie, co ułatwia ich monitorowanie i ...

Montaż i demontaż filamentów aktynowych oraz sieci filamentów aktynowych są kontrolowane przez kilka reakcji biochemicznych i zależą od kontekstu mechanicznego. Aby uzyskać wgląd w te złożone mechanizmy, nieoceniona jest możliwość obserwowania poszczególnych reakcji na poszczególnych włóknach (w odpowiednio dużej liczbie). W ciągu ostatnich dziesięcioleci obserwacja dynamicznych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, głównie przy użyciu mikroskopii fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), stała się kluczową techniką i dostarczyła imponującej listy wyników, których nie można było uzyskać za pomocą testów biochemicznych roztworów masowych1.
Aby to osiągnąć, należy utrzymywać znakowane fluorescencyjnie filamenty aktynowe blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu, jednocześnie wystawiając je na działanie roztworów białek wiążących aktynę (ABP), które mogą być również znakowane fluorescencyjnie. W ten sposób można monitorować zdarzenia zachodzące na poszczególnych włóknach w dobrze kontrolowanych warunkach biochemicznych, a tym samym określać ilościowo szybkość reakcji. Należy jednak wziąć pod uwagę szereg konkretnych ograniczeń. Sztuczne utrzymywanie włókien blisko powierzchni, często dzięki wielu punktom kotwiczenia lub przy użyciu środka spulchniającego, takiego jak metyloceluloza, może zmienić ich zachowanie (np. powodując przerwy w ich polimeryzacji i depolimeryzacji2). Śledzenie konturu każdego filamentu może być trudne, zwłaszcza jeśli nowe włókna lub fragmenty filamentu gromadzą się z czasem w polu widzenia. Reakcje zachodzą w skończonej objętości, w której stężenie monomerów aktyny i ABP może zmieniać się w czasie, co potencjalnie utrudnia wyznaczenie dokładnych stałych szybkości. Wreszcie, odnowienie lub zmiana roztworu ABP jest trudna do osiągnięcia w czasie krótszym niż 30 s i często prowadzi do niejednorodnej zawartości białka w próbce.
Nieco ponad 10 lat temu, zainspirowani tym, co już zrobiono w celu zbadania pojedynczych nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)3, wprowadziliśmy nową technikę opartą na mikrofluidyce do obserwacji i manipulowania pojedynczymi filamentami aktyny4. Pozwala to na obejście wspomnianych wcześniej ograniczeń klasycznych technik jednowłóknistych. W tych testach mikrofluidycznych włókna aktynowe są hodowane z nasion spektryny-aktyny zaadsorbowanych na szkiełku nakrywkowym. Włókna są w ten sposób zakotwiczone tylko jednym końcem na dnie komory mikroprzepływowej i wahają się nad powierzchnią bez przywierania. Włókna dopasowują się do przepływu napływających roztworów, ułatwiając w ten sposób monitorowanie ich długości konturu i utrzymując je w płytkim obszarze nad szkiełkiem nakrywkowym, w którym można zastosować TIRF. Różne roztwory są jednocześnie przepływane do komory bez mieszania, a włókna mogą być wystawione na ich działanie sekwencyjnie i szybko.
Tutaj proponujemy serię podstawowych protokołów do przeprowadzenia testów mikrofluidycznych z pojedynczym filamentem aktyny w laboratorium. Szkiełka nakrywkowe i komory mikrofluidyczne można przygotować z wyprzedzeniem (w pół dnia), a sam eksperyment, w którym można przetestować kilka warunków biochemicznych, odbywa się w mniej niż jeden dzień.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Kazeina</td><td>Merck</td><td>C6905</td><td>Stosowany w 8 mg / ml</td></tr><tr><td>Stempel do biopsji (z tłokiem)</td> <td>Ted Pella</td><td>15115-2</td><td>ID 0,75 mm, OD 1,07 mm</td></tr><tr><td>Biotyna-BSA</td><td>Merck</td><td>A8549</td><td>Używany w 1 mg / ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A8022</td><td>Używany w 50 mg / ml</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack Uchwyt teflonowy</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>dla 8 Szkiełka nakrywkowe Szkiełka</td></tr><tr><td>nakrywkowe 22x40mm Grubość #1.5</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>D27802</td><td>składnik w buforze f</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-D</td><td>składnik w buforze f</td></tr><tr><td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>Fluorofor do znakowania aktyny na Lys328.</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>Do biotynylacji aktyny na Lys328</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td>Detergent do czyszczenia szkła</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie open source</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>(próżnia końcowa: 240 mbar)</td></tr><tr><td>Magiczna niewidzialna taśma</td><td>Scotch</td><td>7100024666</td><td>standardowa przezroczysta taśma biurowa</td></tr><tr><td>Micrewtube</td><td>Simport</td><td>T341-6T</td><td>2 ml mikroprzepływowe rurki</td></tr> zbiornikowe <tr><td>Urządzenie mikroprzepływowe Część 1: Jednostka przepływu S</td><td>Fluigent</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>Przepływomierz</td></tr><tr><td>Urządzenie mikroprzepływowe Część 2: Fluiwell-4C-2 mL</td><td>Fluigent</td><td>14002001PCK</td><td>Uchwyt zbiornika</td></tr><tr><td>Urządzenie mikroprzepływowe Część 3: MFCS-EZ</td><td>Fluigent</td><td>EZ-11000001 EZ-00345001</td><td>Regulator ciśnienia</td></tr><tr><td>Model 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>Ultrafioletowy środek czyszczący</td></tr><tr><td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-805-488</td><td>ATP-ATTO używany do oznaczania aktyny</td></tr><tr><td>neutrawidyny</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>Stosować w dawce 1 mg/ml w PBS.</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Zawiera bazę PDMS i utwardzacz</td></tr><tr><td>Rurki z polieteroeteroketonu (PEEK)</td><td>Merck</td><td>Z226661</td><td>" Niebieski" : ID = 0,25 mm</td></tr><tr><td>Bezpieczny pistolet do przedmuchiwania</td><td>Wąż cewkowy Pneumatyka</td><td>700-S</td><td>filtrowane powietrze</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>podłączyć PEEK do złączki</td></tr><tr><td>Łącznik cewnika ze stali nierdzewnej</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>Wkładany do wlotów i wylotów PDMS do podłączenia do rurki PEEK</td></tr><tr><td>Folia termoplastyczna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>Standardowy "parafilm" </td></tr><tr><td>Ultraczysty etanol</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>Do przechowywania zlewek o pojemności 1 l</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td>do odgazowywania PDMS lub roztworów</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Aby rozszyfrować skomplikowane mechanizmy molekularne, które regulują składanie i rozkładanie filamentów aktynowych, bardzo przydatne jest monitorowanie poszczególnych reakcji na żywo w dobrze kontrolowanych warunkach. W tym celu w ciągu ostatnich 20 lat przeprowadzono eksperymenty na żywych pojedynczych włóknach, głównie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), które dostarczyły wielu kluczowych wyników. W 2011 roku, w celu dalszego rozszerzenia możliwości tych eksperymentów i uniknięcia powtarzających się problematycznych artefaktów, wprowadziliśmy do tych testów proste mikrofluidyki. Badanie to szczegółowo opisuje nasz podstawowy protokół, w którym poszczególne włókna aktyny są zakotwiczone jednym końcem w pasywowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego, dopasowują się do przepływu i mogą być kolejno wystawione na działanie różnych roztworów białkowych. Przedstawiamy również protokoły dla konkretnych zastosowań i wyjaśniamy, w jaki sposób można zastosować kontrolowane siły mechaniczne dzięki lepkiemu oporowi przepływającego roztworu. Zwracamy uwagę na techniczne zastrzeżenia tych eksperymentów i pokrótce przedstawiamy możliwe rozwiązania oparte na tej technice. Te protokoły i wyjaśnienia, wraz z dzisiejszą dostępnością łatwego w użyciu sprzętu mikrofluidycznego, powinny umożliwić osobom niebędącym specjalistami wdrożenie tego testu w swoich laboratoriach.

W przypadku wszystkich opisanych powyżej eksperymentów, fluorescencyjnie znakowane filamenty aktyny powinny być wyraźnie widoczne, z dobrym kontrastem, co świadczy o niskiej fluorescencji tła powierzchni (Rysunek 4, w celu rozwiązywania typowych problemów należy zapoznać się z Plikiem uzupełniającym 1). Filamenty aktyny nie powinny również przylegać do powierzchni: przy niskim dominującym przepływie, fluktuacje boczne filamentów aktyny powinny być zauważalne podczas obserwac...

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Łączymy mikroskopię fluorescencyjną z mikrofluidyką, aby zbadać, w jaki sposób białka wiążące aktynę regulują składanie i rozkładanie włókien aktynowych. Dzięki mikrofluidyce jesteśmy w stanie określić ilościowo reakcje zachodzące jednocześnie na dziesiątkach pojedynczych filamentów aktynowych, jednocześnie precyzyjnie kontrolując warunki biochemiczne i mechaniczne. Pamiętaj, że roztwory są najpierw wstrzykiwane równolegle, aż dotrą do komory, a następnie filamenty są kolejno wystawiane na działanie każdego roztworu poprzez zmianę ustawienia ciśnienia.Aby rozpocząć przygotowanie zespołu komory polidimetylosiloksanu lub PDMS, należy podgrzać płytę grzejną do 100 stopni Celsjusza. Wystawić jedną oczyszczoną komorę PDMS i jedno szklane szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego na działanie światła ultrafioletowego przez trzy do pięciu minut w głębokim czyszczeniu UV. Po zakończeniu umieść komorę PDMS nad szkiełkiem nakrywkowym tak, aby dwie powierzchnie bezpośrednio wystawione na działanie promieniowania UV stykały się ze sobą.Aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione na styku szkiełek nakrywkowych PDMS, delikatnie dociśnij powierzchnię komory palcem. Mocno dociśnij rogi i boki, upewniając się, że sufit komory nie styka się ze szklaną powierzchnią. Umieść komorę ze szklanym dnem skierowanym w stronę płyty grzejnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut.Następnie natychmiast użyj komory lub przechowuj ją na czystej szalce Petriego przez tydzień. Aby przepłukać rurkę wlotową i wylotową, napełnij jedną rurkę zbiornika o pojemności 2 mililitrów 300 mikrolitrami bufora F, przykręć ją do uchwytu mikroprzepływowego i ustaw ciśnienie na 300 milibarów. Pozwól, aby pięć do ośmiu kropli buforu F poszło na marne, a następnie ustaw ciśnienie na zero i powtórz procedurę dla każdego kanału.Następnie ustaw ciśnienie wylotu na rurze zbiornika od czterech do 50 milibarów, gdy kropla wydostanie się z końcówki rurki, podłącz rurkę do wylotu komory PDMS. Gdy ciecz wypełni komorę i wypłynie ze wszystkich wlotów, ustaw ciśnienie wylotowe na 20 milibarów. Później ustaw ciśnienie w rurze zbiornika na 1 do 50 milibarów.Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, upewnij się, że kropla wydostaje się z rurki i wlotu PDMS przed podłączeniem rurki do wlotu. Ustaw ciśnienie na wlocie na 30 milibarów. Po połączeniu wlotów drugiego i trzeciego, jak pokazano, ustaw ciśnienie wszystkich wlotów na 20 milibarów, a ciśnienie wylotowe na zero milibarów.Upewnij się, że natężenia przepływu na wlotach są mniej więcej równe. Podczas wymiany zbiornika należy ustawić wszystkie ciśnienia wlotowe na 12 milibarów, a ciśnienie wylotowe na 5 milibarów. Aby szybko wstrzyknąć roztwór, ustaw ciśnienie odpowiedniego wlotu na 150 milibarów i dostosuj ciśnienie w pozostałych wlotach do około 100 milibarów, tak aby wynikowe natężenie przepływu na wlotach wynosiło 500 nanolitrów na minutę.Aby zmienić roztwór, napełnij 200 do 300 mikrolitrów roztworu w nowej rurce zbiornika i ustaw ciśnienie na ustawienie zmiany. Następnie odkręć rurkę zbiornika wlotu. Gdy na końcówce rurki utworzy się mała kropelka, wkręć nową rurkę ze świeżym roztworem, zmień ustawienie ciśnienia na wysoki przepływ.W zależności od konfiguracji mikroprzepływowej i geometrii komory, odczekaj od trzech do pięciu minut, aż roztwór wypełni rurkę i dotrze do komory. Proces ten można śledzić, mierząc wzrost fluorescencji w czasie. W celu funkcjonalizacji powierzchni zmień roztwór od trzech do 200 mikrolitrów 50 nasion spektryny i aktyny pikomolarnej w buforze F i wstrzyknij roztwór na dwie minuty z wysokim przepływem trzy.W przypadku pasywacji powierzchniowej należy wymienić rurkę trzecią na 300 mikrolitrów 5% BSA w buforze F, a następnie wstrzykiwać przez pięć minut przy wysokim przepływie trzecim, a następnie przez pięć minut przy średnim przepływie trzecim, ze zmniejszonym ciśnieniem od siedmiu do ośmiu milibarów w kanałach pierwszym i drugim, aby uzyskać przeciwprąd 100 nanolitrów na minutę. Cała powierzchnia komory będzie pasywowana BSA. Zmień rurkę trzecią na bufor F, aby przepłukać kanał przez pięć minut przy wysokim przepływie trzecim.Później zmień probówki od jednej do trzech odpowiednio z jedną mikromolową aktyną profiliny, 0,15 mikromolową aktyną i buforem F, jak wyjaśniono w manuskrypcie, i wstrzyknij świeżo przygotowane roztwory, używając wysokiego przepływu ustawionego na trzy do czterech minut. Włącz mikroskop i dostosuj czas ekspozycji kamery do 100 do 200 milisekund, laser wzbudzający do 10 do 20% mocy i całkowitą fluorescencję odbicia wewnętrznego lub głębokość TIRF przy 200 do 300 nanometrach, aby uchwycić obrazy za pomocą obiektywu 60X. Następnie ustaw ciśnienie na średni przepływ jeden na 10 minut, aby rejestrować polimeryzację filamentu z szybkością jednej klatki co 20 sekund, a następnie średni przepływ dwa na 15 minut w celu starzenia filamentu.Przechwytuj depolimeryzację w trybie epifluorescencji przy jednej klatce co pięć sekund, po jednej do dwóch klatek przełącz się na trzeci przepływ w połowie przepływu, aby zarejestrować depolimeryzację włókien z prędkością około 10 podjednostek na sekundę. Aby zresetować eksperyment, rozbij wszystkie fluorescencyjnie znakowane włókna, wystawiając je w sposób ciągły na działanie lasera z maksymalną mocą przez dwie minuty. Przetestuj różne warunki, zmieniając roztwory jeden, dwa lub trzy i wstrzykując je przy wysokim przepływie przez trzy do czterech minut.Przedstawiono wyniki podstawowego eksperymentu polimeryzacji/depolimeryzacji tutaj. Uzyskane w ten sposób kimografy wykorzystano do ilościowego określenia szybkości polimeryzacji i depolimeryzacji. Kiedy wyhodowane włókna aktyny zostały wystawione na działanie znakowanego fluorescencyjnie roztworu kofiliny, klastry kofiliny zostały zarodkowane i rosły w kierunku spiczastych i kolczastych końców.Kiedy pojedyncze włókna są wystawione na działanie faszyny, tworzą wiązki, które wydają się jaśniejsze i nie są idealnie wyrównane z przepływem. Bardzo ważne jest, aby podczas wymiany rurek unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do układu i zwracać uwagę, aby nie dopuścić do opróżnienia rurek zbiornika. Technika ta miała kluczowe znaczenie dla zastosowania sił ciągnących na dziesiątkach pojedynczych włókien, przyjrzenia się wrażliwości mechanicznej forminy i kofiliny oraz rozgałęzieniu ARP2/3.

using-microfluidics-fluorescence-microscopy-to-study-assembly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Poznaj metodę łączącą mikrofluidykę z mikroskopią fluorescencyjną do badania dynamiki pojedynczych filamentów aktyny. Technika umożliwia kontrolę warunków biochemicznych i mechanicznych oraz ilościową analizę reakcji białek wiążących aktynę.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Przeglądaj więcej filmów