Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Łączymy mikroskopię fluorescencyjną z mikrofluidyką, aby zbadać, w jaki sposób białka wiążące aktynę regulują składanie i rozkładanie włókien aktynowych. Dzięki mikrofluidyce jesteśmy w stanie określić ilościowo reakcje zachodzące jednocześnie na dziesiątkach pojedynczych filamentów aktynowych, jednocześnie precyzyjnie kontrolując warunki biochemiczne i mechaniczne. Pamiętaj, że roztwory są najpierw wstrzykiwane równolegle, aż dotrą do komory, a następnie filamenty są kolejno wystawiane na działanie każdego roztworu poprzez zmianę ustawienia ciśnienia.

Aby rozpocząć przygotowanie zespołu komory polidimetylosiloksanu lub PDMS, należy podgrzać płytę grzejną do 100 stopni Celsjusza. Wystawić jedną oczyszczoną komorę PDMS i jedno szklane szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego na działanie światła ultrafioletowego przez trzy do pięciu minut w głębokim czyszczeniu UV. Po zakończeniu umieść komorę PDMS nad szkiełkiem nakrywkowym tak, aby dwie powierzchnie bezpośrednio wystawione na działanie promieniowania UV stykały się ze sobą.

Aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione na styku szkiełek nakrywkowych PDMS, delikatnie dociśnij powierzchnię komory palcem. Mocno dociśnij rogi i boki, upewniając się, że sufit komory nie styka się ze szklaną powierzchnią. Umieść komorę ze szklanym dnem skierowanym w stronę płyty grzejnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut.

Następnie natychmiast użyj komory lub przechowuj ją na czystej szalce Petriego przez tydzień. Aby przepłukać rurkę wlotową i wylotową, napełnij jedną rurkę zbiornika o pojemności 2 mililitrów 300 mikrolitrami bufora F, przykręć ją do uchwytu mikroprzepływowego i ustaw ciśnienie na 300 milibarów. Pozwól, aby pięć do ośmiu kropli buforu F poszło na marne, a następnie ustaw ciśnienie na zero i powtórz procedurę dla każdego kanału.

Następnie ustaw ciśnienie wylotu na rurze zbiornika od czterech do 50 milibarów, gdy kropla wydostanie się z końcówki rurki, podłącz rurkę do wylotu komory PDMS. Gdy ciecz wypełni komorę i wypłynie ze wszystkich wlotów, ustaw ciśnienie wylotowe na 20 milibarów. Później ustaw ciśnienie w rurze zbiornika na 1 do 50 milibarów.

Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, upewnij się, że kropla wydostaje się z rurki i wlotu PDMS przed podłączeniem rurki do wlotu. Ustaw ciśnienie na wlocie na 30 milibarów. Po połączeniu wlotów drugiego i trzeciego, jak pokazano, ustaw ciśnienie wszystkich wlotów na 20 milibarów, a ciśnienie wylotowe na zero milibarów.

Upewnij się, że natężenia przepływu na wlotach są mniej więcej równe. Podczas wymiany zbiornika należy ustawić wszystkie ciśnienia wlotowe na 12 milibarów, a ciśnienie wylotowe na 5 milibarów. Aby szybko wstrzyknąć roztwór, ustaw ciśnienie odpowiedniego wlotu na 150 milibarów i dostosuj ciśnienie w pozostałych wlotach do około 100 milibarów, tak aby wynikowe natężenie przepływu na wlotach wynosiło 500 nanolitrów na minutę.

Aby zmienić roztwór, napełnij 200 do 300 mikrolitrów roztworu w nowej rurce zbiornika i ustaw ciśnienie na ustawienie zmiany. Następnie odkręć rurkę zbiornika wlotu. Gdy na końcówce rurki utworzy się mała kropelka, wkręć nową rurkę ze świeżym roztworem, zmień ustawienie ciśnienia na wysoki przepływ.

W zależności od konfiguracji mikroprzepływowej i geometrii komory, odczekaj od trzech do pięciu minut, aż roztwór wypełni rurkę i dotrze do komory. Proces ten można śledzić, mierząc wzrost fluorescencji w czasie. W celu funkcjonalizacji powierzchni zmień roztwór od trzech do 200 mikrolitrów 50 nasion spektryny i aktyny pikomolarnej w buforze F i wstrzyknij roztwór na dwie minuty z wysokim przepływem trzy.

W przypadku pasywacji powierzchniowej należy wymienić rurkę trzecią na 300 mikrolitrów 5% BSA w buforze F, a następnie wstrzykiwać przez pięć minut przy wysokim przepływie trzecim, a następnie przez pięć minut przy średnim przepływie trzecim, ze zmniejszonym ciśnieniem od siedmiu do ośmiu milibarów w kanałach pierwszym i drugim, aby uzyskać przeciwprąd 100 nanolitrów na minutę. Cała powierzchnia komory będzie pasywowana BSA. Zmień rurkę trzecią na bufor F, aby przepłukać kanał przez pięć minut przy wysokim przepływie trzecim.

Później zmień probówki od jednej do trzech odpowiednio z jedną mikromolową aktyną profiliny, 0,15 mikromolową aktyną i buforem F, jak wyjaśniono w manuskrypcie, i wstrzyknij świeżo przygotowane roztwory, używając wysokiego przepływu ustawionego na trzy do czterech minut. Włącz mikroskop i dostosuj czas ekspozycji kamery do 100 do 200 milisekund, laser wzbudzający do 10 do 20% mocy i całkowitą fluorescencję odbicia wewnętrznego lub głębokość TIRF przy 200 do 300 nanometrach, aby uchwycić obrazy za pomocą obiektywu 60X. Następnie ustaw ciśnienie na średni przepływ jeden na 10 minut, aby rejestrować polimeryzację filamentu z szybkością jednej klatki co 20 sekund, a następnie średni przepływ dwa na 15 minut w celu starzenia filamentu.

Przechwytuj depolimeryzację w trybie epifluorescencji przy jednej klatce co pięć sekund, po jednej do dwóch klatek przełącz się na trzeci przepływ w połowie przepływu, aby zarejestrować depolimeryzację włókien z prędkością około 10 podjednostek na sekundę. Aby zresetować eksperyment, rozbij wszystkie fluorescencyjnie znakowane włókna, wystawiając je w sposób ciągły na działanie lasera z maksymalną mocą przez dwie minuty. Przetestuj różne warunki, zmieniając roztwory jeden, dwa lub trzy i wstrzykując je przy wysokim przepływie przez trzy do czterech minut.

Przedstawiono wyniki podstawowego eksperymentu polimeryzacji/depolimeryzacji tutaj. Uzyskane w ten sposób kimografy wykorzystano do ilościowego określenia szybkości polimeryzacji i depolimeryzacji. Kiedy wyhodowane włókna aktyny zostały wystawione na działanie znakowanego fluorescencyjnie roztworu kofiliny, klastry kofiliny zostały zarodkowane i rosły w kierunku spiczastych i kolczastych końców.

Kiedy pojedyncze włókna są wystawione na działanie faszyny, tworzą wiązki, które wydają się jaśniejsze i nie są idealnie wyrównane z przepływem. Bardzo ważne jest, aby podczas wymiany rurek unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do układu i zwracać uwagę, aby nie dopuścić do opróżnienia rurek zbiornika. Technika ta miała kluczowe znaczenie dla zastosowania sił ciągnących na dziesiątkach pojedynczych włókien, przyjrzenia się wrażliwości mechanicznej forminy i kofiliny oraz rozgałęzieniu ARP2/3.