Name: Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę przygotowania i ograniczania aktywnych nematyków opartych na mikrotubulach i kinezynach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki materii aktywnej w mikroskali z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Narodowej Fundacji Nauki (NSF) za hojne finansowanie. Projekt był również wspierany przez NSF za pośrednictwem Centrum Doskonałości Badawczej w Nauce i Technologii: Centrum Maszyn Komórkowych i Biomolekularnych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Merced (HRD-1547848) oraz Centrum Badań Materiałowych i Inżynierii Brandeis Biomaterials Facility (DMR-2011846). Chcielibyśmy podziękować dr Bin Liu z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Merced za pomoc w drukowaniu 3D formy oraz dr Jordi Ignes za porady naukowe podczas opracowywania metody eksperymentu odwróconego.

1. Przygotowanie materiału aktywnego
UWAGA: Aktywny nematyka 2D jest montowany w trzyetapowym procesie. Najpierw przygotowuje się dwa oddzielne roztwory: a) spolimeryzowane, stabilizowane mikrotubule i b) MIX (roztwór zawierający silniki kinezynowe). Są one łączone, a aktywność rozpoczyna się po dodaniu trifosforanu adenozyny (ATP). Materiał jest następnie zamykany w odpowiedniej geometrii, tak aby jego gęstość była wystarczająco wysoka, aby wyłonił się porządek nematyczny. Dołączone są protokoły dotyczące przygotowania wszystkich niezbędnych komponentów i sposobu montażu fazy aktywnej.
<ol>
	<li>Przygotowanie klastra białek motorycznych kinezyny
	<ol>
		<li>Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanych białek motorycznych K401-BIO (silników K401) z Escherichia coli zgodnie z protokołem Edgara C. Younga20. 
		UWAGA: Białka motoryczne K401-BIO są dimeryczne i składają się z dwóch główek połączonych spiralną łodygą. Silniki zostały dostarczone przez Brandeis Biomaterials Facility i używane zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16. W celu utworzenia aktywnego nematyki, cząsteczki kinezyny są biotynylowane, a następnie łączone za pomocą wiązania streptawidyny, tworząc klastry kinezyny składające się z maksymalnie czterech silników13,15,21,22. Pomocne jest wyrażanie kinezyny za pomocą znacznika białka zielonej fluorescencji (GFP).</li>
		<li>Po oczyszczeniu i inkubacji streptawidyny i silników na lodzie przez 40 minut, błyskawicznie zamrozić silniki K401 w ciekłym azocie w podwielokrotnościach 5 μl o końcowym stężeniu 0,7 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. W razie potrzeby delikatnie rozmrozić kinezynę i nie zamrażać ponownie.</li>
		<li>Przygotować klastry kinezyny znakowanej biotyną (KSA) przez zmieszanie 24% obj. silników K401 0,7 mg/mL, 27% obj. 0,325 mg/ml streptawidyny i 3% obj. 5 mM ditiotreitolu (DTT) (w celu zapobieżenia agregacji) w temperaturze 4 °C w buforze M2B o stężeniu 46 mM (80 mM RURY [kwas 1,4-piperazynodienosulfonowy, pH 6,8], 2 mM MgCl2 i 1 mM EGTA [eter bis(β-aminoetylowy)-N, Kwas N,N′,N′-tetraoctowy]). Pozwól KSA inkubować na lodzie przez 40 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu mikrotubul 
	UWAGA: Trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP) jest wolno hydrolizowalnym analogiem trifosforanu guanozyny (GTP), a mikrotubule powstałe w obecności GMPCPP są trzykrotnie sztywniejsze niż mikrotubule GTP23 i krótsze. Zastosowanie krótkich, sztywnych mikrotubul jest korzystne dla tworzenia aktywnej fazy nematycznej, ponieważ czynniki te łączą się, aby promować uporządkowanie ciekłokrystaliczne.
	<ol>
		<li>Polimeryzować nieznakowaną tubulinę cykliczną (99%, patrz tabela materiałów) przy użyciu 0,6 mM GMPCPP przy stężeniu tubuliny 6 mg/mL. 
		UWAGA: Wysokiej jakości tubulinę można również oczyścić z mózgu bydlęcego lub świńskiego zgodnie z ustalonymi protokołami lub uzyskać z innego wiarygodnego źródła, takiego jak Brandeis Biomaterials Facility, gdzie materiały mogą być wysyłane zamrożone, aby zapobiec uszkodzeniom. Aby uzyskać informacje na temat oczyszczania tubuliny z mózgu bydła, zapoznaj się z opublikowanym protokołem Bate et al.24. Aby uzyskać informacje na temat oczyszczania tubuliny z mózgu świni, zapoznaj się z opublikowanymi protokołami z Castoldi et al.25 i Tayar et al.26.</li>
		<li>Przygotowując się do polimeryzacji, przygotować łaźnię cieplną w temperaturze 37 °C i wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Połączyć nieznakowany roztwór tubuliny w buforze M2B (krok 1.1.3) w probówce ultrawirówki o pojemności 500 μl z tubuliną znakowaną rodaminą o stężeniu 4% molowym (patrz tabela materiałów), aby po polimeryzacji otrzymać 4% znakowane mikrotubule.</li>
		<li>Sprawdź stężenie tubuliny za pomocą testu Bradforda27. Całkowite stężenie tubuliny w probówce wirówkowej powinno wynosić 6,5-6,9 mg/ml.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę tubuliny na lodzie przez 10 minut i ultrawirować przez 10 minut w temperaturze 352,700 x g w temperaturze 4 °C. Ten krok usuwa dysfunkcyjną tubulinę, która będzie znajdować się w granulce.</li>
		<li>Za pomocą pipety ostrożnie wyekstrahować supernatant zawierający funkcjonalną tubulinę do probówki do mikrowirówki. Dodać GMPCPP do końcowego stężenia 0,6 mM w celu indukowania polimeryzacji tubuliny i DTT do końcowego stężenia 1 mM, aby zapobiec agregacji białek.</li>
		<li>Mieszaninę inkubować w łaźni grzewczej w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie ponownie odwirowywać przez 10 minut przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant, a następnie rozcieńczyć osad buforem M2B, aby osiągnąć końcowe stężenie mikrotubul 6 mg/ml. 
		UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy mikrotubule pomyślnie spolimeryzowały, rozcieńczyć 1 μl roztworu mikrotubul w stosunku 100:1 buforem M2B i pipetą na szkiełku mikroskopowym. Okładka z szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) z soczewką obiektywową 40x. 
		UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji są dobierane zgodnie z oznaczeniem fluorescencyjnym stosowanym na mikrotubulach. W tym protokole stosuje się znakowanie rodaminą (patrz krok 1.2.2), więc obrazowanie odbywa się przy użyciu pasma wzbudzenia 515-560 nm i filtra długoprzepustowego 590 nm. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywny przykład.</li>
		<li>Po zakończeniu polimeryzacji mikrotubule należy zamrozić kroplowo w postaci 2 μl podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C (jeśli jest to wymagane).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie MIX 
	UWAGA: MIX jest roztworem wodnym, który zawiera klastry kinezyna-streptawidyna (KSA). Przygotowany MIX należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 4 μl porcji przed rozpoczęciem doświadczenia. Gdy MIX jest połączony z ATP i roztworem mikrotubul opisanym w kroku 1.2 w temperaturze pokojowej, rozpoczyna się aktywność. MIX przygotowuje się w następujący sposób13,19.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zapobiegający blaknięciu fluorescencji (ANTIFADE), mieszając dwa roztwory przeciwutleniaczy. Połącz AO1 (250 mM DTT, 65 mM katalazy) i AO2 (750 μM katalazy, 3 mM oksydazy glukozowej) w stosunku objętościowym 1:1. Zawiera 20 mM Trolox, inny przeciwutleniacz stosowany w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych mikroskopią fluorescencyjną.</li>
		<li>Przygotować MIX, sporządzając roztwór KSA (opisany w kroku 1.1.3), który zawiera 6 % wag. 20 kDa glikolu polietylenowego (PEG) w celu wywołania wiązania mikrotubul, 3% obj. ANTIFADE i 5% obj. kinazy pirogronianowej/dehydrogenazy mlekowej (PKLDH) w stężeniu 70 mg/ml do regeneracji ATP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie aktywnego nematyka
UWAGA: Aktywność w materiale jest inicjowana przez dodanie ATP. Sieć aktywna jest przygotowywana na świeżo dla każdego eksperymentu poprzez dodanie ATP w stężeniu wystarczająco wysokim, aby wywołać aktywność motoryczną. Aby utworzyć jednolitą, w pełni rozwiniętą aktywną fazę nematyczną, mikrotubule muszą mieć wystarczająco dużą gęstość. Można to osiągnąć poprzez zamknięcie mikrotubul pomiędzy dwoma niemieszającymi się płynami w celu utworzenia dwuwymiarowej (2D) aktywnej warstwy nematycznej. Metoda ta została pierwotnie opracowana na Uniwersytecie Brandeis13 i pozostaje popularną techniką wytwarzania jednorodnej, wysokiej jakości, aktywnej fazy nematycznej.
<ol>
	<li>Metoda komórkowa przepływowa do aktywnego tworzenia nematycznego
	<ol>
		<li>Przygotuj hydrofilowe szkiełka nakrywkowe z powłoką akrylową.
		<ol>
			<li>Dokładnie wyczyść szkiełka nakrywkowe wodą z mydłem, etanolem i 0,1 M NaOH z naprzemiennym płukaniem wodą nanoczystą. Po spłukaniu pokryj szkiełka nakrywkowe roztworem silanu złożonym ze 100 ml etanolu, 1 ml kwasu octowego i 500 μl 3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu przez 15 minut, a następnie spłukuj wodą nanoczystą.</li>
			<li>Przygotować roztwór akrylamidu z 95 ml wody nanoczystej i 5 ml 40% wag. akrylamidu, a następnie odgazowywać roztwór przez 30 minut w piecu próżniowym.</li>
			<li>Dodać 35 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do uzyskania końcowego stężenia 2,3 mM, a następnie 0,07 g nadsiarczanu amonu. Wlać roztwór akrylamidu na szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do góry i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj hydrofobowe szkiełka mikroskopowe. Pobrać pipetą 100 μl roztworu hydrofobowego (patrz tabela materiałów) na czyste szklane szkiełko mikroskopowe, a następnie umieścić na nim kolejne czyste szkiełko podstawowe. Zapewnia to równomierne pokrycie roztworu hydrofobowego na powierzchni, na której się znajduje, przez 2 minuty. Po 2 minutach zdejmij drugie szkiełko i dokładnie spłucz pierwsze szkiełko nanoczystą wodą, a następnie osusz gazowym azotem. Delikatnie wyczyść obszar, w którym taśma zostanie umieszczona (wokół wzoru) acetonem, aby upewnić się, że roztwór hydrofobowy nie zapobiega przyleganiu do szkła.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę oleju inżynieryjnego, która zawiera 1,8% (v/v) 008-FluoroSurfaktant (patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Zamontuj szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z hydrofobowym szkiełkiem podstawowym na spodzie komory przepływowej i hydrofilowym szkiełkiem nakrywkowym jako górną powierzchnią w geometrii warstwowej za pomocą dwustronnych przekładek klejących 40 μm. Umieść przekładki w odległości 1.5 mm od siebie na szkiełku mikroskopu hydrofobowego. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe pokryte akrylamidem na podkładkach dystansowych stroną do dołu, aby przylegało. Upewnij się, że przyczepność jest pełna przy nacisku przedmiotu. 
		UWAGA: Celem jest zmontowanie komory przepływowej z płaskim interfejsem olej/woda wewnątrz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). W tym miejscu utworzy się warstwa aktywna. Alternatywne taśmy dystansowe i folie mogą być również używane do produkcji o podobnej grubości komórek.</li>
		<li>Po zbudowaniu komory przepływowej należy natychmiast odpipetować mieszaninę oleju do komory przepływowej, wypełniając zamkniętą przestrzeń.</li>
		<li>Za pomocą pipety, w osobnej fiolce delikatnie wymieszaj 6 μl substancji aktywnej z 3,73 μl MIX, 1 μl roztworu mikrotubul, 0,6 μl roztworu ATP (stężenie można zmieniać w celu zmiany prędkości mikrotubul) i 0,67 μl buforu M2B.</li>
		<li>Odpipetować świeżo wymieszany materiał aktywny do jednego otwartego końca komory przepływowej, objętości będą się różnić, ale powinny przekraczać objętość komory przepływowej (około 3-6 μl). Część oleju zostanie wyparta przez roztwór wodny podczas wstrzykiwania go do kanału; może on zostać przesiąknięty na przeciwległym końcu kanału przepływowego za pomocą małego kawałka bibuły.</li>
		<li>Po napełnieniu uszczelnij obie strony komory przepływowej klejem epoksydowym (patrz tabela materiałów), który twardnieje pod wpływem światła UV przez 20 s. 
		UWAGA: W tym momencie materiał aktywny tworzy sieć 3D, która pozostaje zawieszona w warstwie wody.</li>
		<li>Aby ograniczyć warstwę czynną między dwoma niemieszającymi się płynami w warstwie quasi-2D, umieść komórkę przepływową w wirówce kubełkowej wahadłowej (patrz Tabela materiałów) z fazą wodną na górze i gęstszą warstwą oleju pod spodem. Wirować przy 212 x g przez 10 min. Po zakończeniu tego kroku komórkę przepływową można przenieść do mikroskopu epifluorescencyjnego w celu obrazowania z obiektywem o powiększeniu 10x lub 20x. Rysunek 2C,D pokazuje typowe obrazy przed i po tym kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrócona metoda aktywnego tworzenia nematyki 
	UWAGA: Alternatywną metodą do opisanej w kroku 2.1 jest złożenie aktywnej warstwy nematycznej pod grubą warstwą oleju ograniczoną do głębokiego odwiertu PDMS28. Ta metoda daje podobne wyniki i jest nieco łatwiejsza do opanowania; Jednak jakość obrazu przy użyciu tej metody zwykle nie jest tak dobra, jak w przypadku metody z komórką przepływową.
	<ol>
		<li>Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS) przy użyciu utwardzacza elastomerowego i bazy elastomerowej (patrz tabela materiałów). Wymieszaj oba składniki w stosunku 1:10 za pomocą metalowej szpatułki. Podczas mieszania pojawiają się drobne bąbelki, które są trudne do usunięcia, a mieszanina wydaje się mleczna. Aby usunąć te pęcherzyki, umieść mieszaninę pod próżnią w celu odgazowania przez 1 godzinę, po czym nieutwardzony PDMS powinien wydawać się przezroczysty. 
		UWAGA: PDMS jest teraz gotowy do formowania dowolnego kształtu za pomocą formy lub może utwardzić się w pojemniku, a następnie zostać wycięty lub wykrawany w żądany wzór.</li>
		<li>Wlać PDMS do odpowiedniej formy i pozostawić na noc do utwardzenia w temperaturze 60 °C. 
		UWAGA: Nieobrobiona powierzchnia utwardzonego PDMS jest hydrofobowa, ale dzięki obróbce powierzchniowej może być hydrofilowa.</li>
		<li>Aby przygotować hydrofilową powierzchnię PDMS, pokryj PDMS szczotką z polimeru akrylowego29. Ten krok zapobiega również przywieraniu białek do powierzchni.
		<ol>
			<li>Zacznij od czyszczenia PDMS przez 10 minut zarówno etanolem, jak i izopropanolem, a następnie dokładnie spłucz wodą dejonizowaną 3x i wysusz. Użyj myjki plazmowej przez 5 minut, aby wyczyścić suchy, utwardzony PDMS. Ten krok sprawia, że powierzchnia jest bardziej hydrofilowa.</li>
			<li>Następnie należy przygotować roztwór silanu (98,5% wag. etanolu, 1% wag. kwasu octowego i 0,5% wag. metakrylanu trimetoksysililopropylu) i zanurzyć podłoże w tym roztworze na 15 minut, aby przygotować się do powłoki akrylowej. Dokładnie spłukać podłoże wodą dejonizowaną i zanurzyć w roztworze akrylamidu (2% wag. roztwór akrylamidu/bis, 2,3 mM TEMED i 3 mM nadsiarczan amonu). 
			UWAGA: Podłoża te mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej pokrytej roztworem akrylamidu na szklanej szalce Petriego i powinny być zużyte w ciągu 2 tygodni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Gdy jest gotowy do użycia, spłucz powierzchnię wodą dejonizowaną i osusz azotem do natychmiastowego użycia. Dodać aktywną mieszaninę (opisaną w kroku 2.1.6) do studzienek i natychmiast dodać olej silikonowy na wierzch do grubości około 2 mm. 
		UWAGA: Na tym etapie aktywna mieszanina zostanie umieszczona między olejem a powłoką hydrofilową na PDMS, ale nadal będzie nieco trójwymiarowa.</li>
		<li>Aby wepchnąć materiał głębiej w warstwę 2D, przyklej urządzenie PDMS do szkiełka podstawowego, umieść je w wirówce z wahadłowym wiadrem i wiruj przez 12 minut przy 212 x g. Urządzenie będzie musiało być ustawione w taki sposób, aby olej silikonowy znajdował się na wierzchu warstwy wodnej. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie aktywnych nematyków w ograniczonych geometriach
UWAGA: Aktywne nematyki, takie jak ten quasi-dwuwymiarowy system, mogą być trudne do ograniczenia do małych geometrii mikroprzepływowych, takich jak studnie lub kanały. W tym miejscu opisano niezawodną metodę ograniczania materiału do studzienek PDMS o różnych kształtach.
<ol>
	<li>Najpierw zaprojektuj główną formę dla PDMS. Można to osiągnąć poprzez drukowanie 3D filarów na podłożu. Po wydrukowaniu 3D formy głównej żywicy, oczyść ją izopropanolem, a następnie utwardź formę pod lampą UV przez 45 minut i w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 2 godziny (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4). 
	UWAGA: Utwardzanie w promieniowaniu UV i termiczne utwardzanie poprawia jakość replikacji w PDMS poprzez usunięcie monomerów i pozostałości fotoinhibitorów z żywicy30.</li>
	<li>Użyj formy wzorcowej, aby utworzyć studnie z PDMS. Przygotuj PDMS zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Zanurz formę wzorcową w nieutwardzonym PDMS i utwardź przez noc w piekarniku w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu utwardzania PDMS ostrożnie wyjmij formę wzorcową i przytnij PDMS zgodnie z potrzebami, aby pracować ze studzienkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Powierzchnię PDMS należy traktować zgodnie z opisem w kroku 2.2.3. Przed eksperymentem powierzchnię można przymocować do szkiełka za pomocą kleju epoksydowego, aby ułatwić obrazowanie.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl aktywnej mieszaniny opisanej w kroku 2.1.6 na podłoże PDMS i natychmiast dodać olej silikonowy o lepkości 100-1000 cSt 28 na kroplę aktywnej sieci. Aktywna sieć zostanie przeniesiona do studni; proces ten trwa do 60 minut (Rysunek 4). Jak opisano w kroku 2.2.5, sieć 2D można rozszerzyć, obracając dobrze PDMS w wirówce kubełkowej wahadłowej przez 12 minut przy 212 x g.</li>
</ol>

<ol><li>Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+dependence+of+the+collective+dynamics+of+swimming+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria.</a> Physics Review Letters. 98 (15), 158102(2007).</li>
<li>Saw, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+in+epithelia+govern+cell+death+and+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion.</a> Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).</li>
<li>Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+control+collective+dynamics+in+neural+progenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures.</a> Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).</li>
<li>Toner, J., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+order+in+a+two-dimensional+dynamical+XY+model%3A+how+birds+fly+together%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together.</a> Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).</li>
<li>Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+the+structure+and+dynamics+of+interactions+in+schooling+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).</li>
<li>Needleman, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+matter+at+the+interface+between+materials+science+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Active matter at the interface between materials science and cell biology.</a> Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048(2017).</li>
<li>Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Memarian, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nematic+order+and+dynamic+lane+formation+of+microtubules+driven+by+membrane-bound+diffusing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).</li>
<li>Bausch, A., Sciortino, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+polarity+sorting+of+driven+actin+filaments+on+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).</li>
<li>Maroudas-Sacks, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+in+the+nematic+order+of+actin+fibres+as+organization+centres+of+Hydra+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis.</a> Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+braiding+and+virtual+particles+on+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Topological braiding and virtual particles on the cell membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).</li>
<li>Hirst, L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHirst%2C+LS+%22Fundamentals+of+Soft+Matter+Science+2nd+ed%22">Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed</a>. , CRC Press. (2019).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+active+turbulence+with+patterned+soft+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Taming active turbulence with patterned soft interfaces.</a> Nature Communications. 8, 564(2017).</li>
<li>Thijssen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submersed+micropatterned+structures+control+active+nematic+flow%2C+topology%2C+and+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).</li>
<li>Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dancing+disclinations+in+confined+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Dancing disclinations in confined active nematics.</a> Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).</li>
<li>Giomi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+topology+of+turbulence+in+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+X%22%5BJournal%5D)">Geometry and topology of turbulence in active nematics.</a> Physical Review X. 5 (3), 031003(2015).</li>
<li>Tan, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+chaos+in+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Topological chaos in active nematics.</a> Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).</li>
<li>Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+dimeric+kinesin+heavy+chain+derivatives+that+lack+the+kinesin+rod%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).</li>
<li>Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+the+Drosophila+kinesin+motor+domain+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli.</a> Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).</li>
<li>Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuznetsov%2C+SA+%22Kinesin+Protocol%22">Kinesin Protocol</a>. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).</li>
<li>Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+doubly+stabilized+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments.</a> Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).</li>
<li>Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+flow+speeds+of+microtubule-based+3D+active+fluids+using+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60484(2019).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTayar%2C+AM+%22Microtubules%22">Microtubules</a>. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+shear+viscosity+of+an+active+nematic+film%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Probing the shear viscosity of an active nematic film.</a> Physical Review E. 94 (6), 060602(2016).</li>
<li>Rudy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubricous+hydrogel+surface+coatings+on+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tribology+Letters%22%5BJournal%5D)">Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS).</a> Tribology Letters. 65, 3(2017).</li>
<li>Venzac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+curing+inhibition+on+3D-printed+molds%3A+Why%3F+Also%2C+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it.</a> Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).</li>
<li>Khaladj, D. A., Hirst, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+curved+fluid+boundaries+to+confine+active+nematic+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows.</a> Frontiers of Physics. 10, 880941(2022).</li>
</ol>

Niektóre materiały użyte w tej pracy zostały dostarczone bezpłatnie przez Cytoskeleton Inc. (Denver, USA).

W protokołach jest kilka punktów, w których eksperymentator może dokonać kilku ważnych kontroli. Przed napełnieniem któregokolwiek z urządzeń materiałem aktywnym należy zastosować mikroskopię fluorescencyjną (patrz rysunek 1) w celu sprawdzenia, czy mikrotubule są spolimeryzowane i najlepiej mają długość ~2-3 μm. Jeśli mikrotubule nie są widoczne pod mikroskopem, mogły ulec depolimeryzacji i nie utworzy się aktywna nematyka. Ponieważ pojedyncze mikrotubule są bardzo małe, obserwowanie ich bezpośrednio przez mikroskop może być trudne. W tym badaniu wykorzystano wysokiej jakości kamerę fluorescencyjną przeznaczoną do trudnych zastosowań przy słabym oświetleniu wraz z powiązanym oprogramowaniem w celu weryfikacji wzrostu filamentu. Na tym etapie nie powinno być obecnych znaczących agregatów fluorescencyjnych, ponieważ może to wskazywać na depolimeryzację lub obecność zdenaturowanego białka. Dobrym pomysłem jest również wykonanie prostego szkiełka testowego mikroskopu poprzez połączenie mikrotubul, MIX i ATP w tych samych proporcjach, jak opisano w protokołach. Aktywność powinna rozpocząć się od połączenia składników, a materiał powinien wyglądać podobnie do tego pokazanego na rysunku 2C , z obecnymi wiązkami i zauważalnymi ruchami włókien widocznymi w całym tekście.
W przypadku stosowania metody komory przepływowej czas wirowania i orientacja komory przepływowej są ważne dla utworzenia jednolitej warstwy aktywnej. Ten krok może wymagać pewnego dostrojenia w zależności od używanego typu wirówki. Odwirowanie komory przepływowej z aktywną płaszczyzną zorientowaną prostopadle do płaszczyzny obrotu daje najlepsze wyniki, ponieważ materiał może być równomiernie wpychany na granicę faz płynu. Dokładnie sprawdź, czy komórka przepływowa jest starannie uszczelniona przed odwirowaniem.
W przypadku stosowania metody odwróconej do wytwarzania ograniczonych aktywnych nematyków istnieje kilka kroków do optymalizacji. Po pierwsze, ważne jest, aby zastosować metodę druku 3D, która pozwala na tworzenie struktur o wysokiej rozdzielczości. Nierówne ścianki boczne mogą powodować wyłapywanie mikrotubul, co zakłóci przepływy. Studnie nie powinny być zbyt głębokie (w pracy wykorzystano studnie o głębokości 150-200 μm z warstwą ropy o grubości 2 mm). Eksperymentatorzy mogą być zmuszeni do niewielkiego dostosowania tych parametrów metodą prób i błędów, aby uzyskać najlepszy wynik.
Metoda komórek przepływowych i metoda odwrócona były używane przez różnych autorów do przyjrzenia się różnorodnym efektom, które wpływają na aktywne przepływy, w tym różnym olejom12 i zanurzonym strukturom13. Wybór metody zależy od celu eksperymentu. W przypadku metody komórek przepływowych obrazowanie optyczne znad warstwy aktywnej jest wyraźniejsze niż w przypadku metody odwróconej ze względu na różne płyny leżące powyżej. W metodzie z komórką przepływową obrazowanie odbywa się przez szklane szkiełko nakrywkowe i cienką warstwę wody, podczas gdy metoda odwrócona jest zaprojektowana tak, aby warstwa oleju znajdowała się na wierzchu. Oznacza to, że do metody odwróconej potrzebny jest obiektyw o dużej odległości roboczej, a jakość obrazu ulega pogorszeniu. Różnice w jakości obrazu można zobaczyć, porównując odpowiednio rysunek 2D (metoda z komórką przepływową) i rysunek 3 (metoda odwrócona) oraz film 1 i film 2. Do wykonania rysunku 3 wymagana była soczewka o mniejszym powiększeniu i większej odległości roboczej niż ta użyta na rysunku 2. Tych niedogodności związanych z obrazowaniem w przypadku metody odwróconej można uniknąć, jeśli dostępny jest odpowiedni mikroskop odwrócony w połączeniu z obiektywami o odpowiedniej odległości roboczej dla substratów szkiełek mikroskopowych. Cieńsze szkło może być używane jako podłoże, aby umożliwić stosowanie standardowych obiektywów o zasięgu roboczym.
Zaletą odwróconej geometrii jest to, że pozwala na stosowanie szerszego zakresu lepkości oleju, niekoniecznie wymaga wirowania w wiadrze wahadłowym (jeśli nie jest ono dostępne), a przygotowanie układu jest stosunkowo łatwiejsze po przygotowaniu formy. Jednak w przypadku zamknięcia w studniach przy użyciu metody odwróconej może być ważne odwirowanie, aby materiał znalazł się w dobrze zdefiniowanej warstwie 2D.
Metoda ogniw przepływowych jest ostatnio z powodzeniem stosowana w eksperymentach, w których wymagana jest ciągła warstwa aktywna. Nasze ostatnie prace dotyczyły dynamiki defektów topologicznych w warstwie aktywnej, w przypadku których ważna jest wysoka jakość obrazowania i analiza tekstury19. Ponadto metoda ogniw przepływowych została wykorzystana do zbadania wpływu mikrostruktur zanurzonych w ropie na przepływy aktywne16 oraz filary do wychwytywania defektów w przepływach aktywnych31. Ta metoda bardzo dobrze sprawdza się w tworzeniu ciągłej warstwy aktywnej, a jakość obrazu jest doskonała. Jednak etap wirowania stosowany do wytworzenia końcowej warstwy aktywnej 2D może być trudny do przeprowadzenia, a komórki przepływowe są podatne na wycieki i pęcherzyki powietrza. Metoda odwrócona jest bardzo przydatną alternatywą o wysokim wskaźniku sukcesu, jest łatwa do skonstruowania i może być stosowana do dowolnego wzoru lub geometrii podłoża, pod warunkiem, że można utworzyć drukowaną w 3D formę wzorcową o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest również przydatna do badania wpływu ograniczenia geometrycznego na aktywną dynamikę nematykę, ponieważ sprawia, że napełnianie studni jest stosunkowo proste.
W artykule opisano dwa sposoby tworzenia aktywnej nematyki z mikrotubul i silników kinezynowych, a także technikę ograniczania materiałów w studniach. Prezentowany system stanowi najczystszy przykład aktywnej fazy nematycznej obecnie w literaturze i został odtworzony przez kilka grup na całym świecie. Znaczenie tego materiału polega nie tylko na biologicznym pochodzeniu jego składników, ale także na tym, że otwiera on zupełnie nowy kierunek w aktywnych uporządkowanych płynach. Pracując z tym systemem i wyjaśniając jego podstawowe właściwości, naukowcy mogą przejść do projektowania w pełni syntetycznych faz aktywnych.
Eksperymenty skoncentrowane na wpływie uwięzienia na aktywną nematykę mogą potencjalnie odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące zachowania aktywnych przepływów i dynamiki defektów topologicznych w zamknięciu topologicznym. Przedstawiona tutaj metoda pomoże w przeprowadzaniu różnorodnych eksperymentów skoncentrowanych na geometrii i ich analizie, w tym mikrofluidyki i aktywnego mieszania.

Aktywne płyny składają się z napędzanych energią cząstek lub pierwiastków, które czerpią paliwo ze swojego lokalnego środowiska. W odpowiednich warunkach te ruchliwe elementy aktywne mogą działać wspólnie, tworząc wyłaniającą się dynamikę płynów w długich skalach. W literaturze istnieje wiele przykładów takiego zachowania fazowego poza równowagą, a fazy aktywne można znaleźć w całym spektrum systemów żywych. Niektóre godne uwagi przykłady to kolonie bakterii1, arkusze komórek2,3, oraz stado lub rój organizmów4,5. Fazy aktywne były również szeroko badane w skondensowanych fazach włókien cytoszkieletu, zarówno jako część cell6, jak i w systemach syntetycznych zaprojektowanych do wykorzystania biologicznie ekstrahowanych składników7,8,9. Uporządkowanie ciekłokrystaliczne i powstawanie defektów topologicznych zarówno w systemach występujących naturalnie, jak i syntetycznych składanych z ekstraktów biologicznych jest przedmiotem szczególnego zainteresowania społeczności naukowej. W ostatnich latach grupy badawcze badały takie systemy, ich podstawowe właściwości fizyczne i ich znaczenie dla biologii2,3,10,11.
Ten artykuł skupia się na tworzeniu aktywnego stanu nematycznego z połączenia mikrotubul i białek motorycznych kinezyny. Tradycyjny nematyczny ciekły kryształ jest fazą równowagi materii, w której cząsteczki składowe wykazują uporządkowanie orientacyjne. Na przykład płyn składający się ze stosunkowo sztywnych cząsteczek przypominających pręty może wykazywać zarówno fazę nematyczną, jak i, w wyższych temperaturach, niezorientowaną izotropową fazę płynu12. Pierwszy eksperymentalny przykład aktywnej fazy nematycznej został opracowany przez Sancheza i wsp.13, adaptując wcześniejszy eksperyment in vitro14, w którym klastry białek motorycznych zostały użyte do wytworzenia ruchu ścinającego między sąsiednimi wiązkami mikrotubul. Kiedy ten system mikrotubul został ograniczony do cienkiej warstwy, pojawiło się spontaniczne uporządkowanie nematyczne. W ostatnich latach aktywny stan nematyczny był intensywnie badany przez kilka eksperymentalnych15,16 i theoretical17,18 grup badawczych, koncentrujących się na zjawiskach takich jak aktywna turbulencja — stan, w którym płyn wytwarza samonapędzające się przepływy chaotyczne19— i ruchomych wad topologicznych. W artykule opisano metody otrzymywania i tworzenia aktywnego stanu nematycznego z mikrotubul i silników kinezynowych w różnych geometriach eksperymentalnych. W pierwszej kolejności opisano metody przygotowania różnych roztworów składowych, a następnie metody tworzenia aktywnej nematyki przy użyciu dwóch różnych geometrii komory przepływowej. Przedstawiono typowe wyniki obrazowania. Na koniec opisano metody ograniczania aktywnej nematyki w studniach i kanałach.

<table><tbody><tr><td>20 kD PEG (glikol polietylenowy))</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1419109</td><td>Środek zubożający Numer CAS: 125061-88-3</td></tr><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514-50ML</td><td>Numer CAS: 2530-85-0</td></tr><tr><td>Drukarka 3D i Żywica</td><td>Phrozen</td><td></td><td>Ultradźwiękowa mini drukarka 3D 8K - Aqua Grey Żywica 8K</td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Numer CAS: 7732-18-5, 79-06-1</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher</td><td></td><td>Numer CAS: 64-19-7</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Numer CAS: 67-64-1</td></tr><tr><td>Arkusze samoprzylepne (UWAGA: "Parafilm" jest alternatywą)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>620001</td><td>SecureSeal</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Numer CAS: 7727-54-0</td></tr><tr><td>Aquapel (UWAGA: "RainX" jest alternatywą)</td><td>Aquapel Glass Treatment</td><td></td><td>hydrofobowa obróbka szkła</td></tr><tr><td>ATP (trifosforan adenozyny)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1852</td><td>Numer CAS: 34369-07-8</td></tr><tr><td>Zlewki</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9322</td><td>Numer CAS: "9001-05-2"</td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Bel-art</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA - Flash4.0 LT+</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>Numer CAS: "3483-12-3"</td></tr><tr><td>EGTA (kwas 3,12-bis(karboksymetylo)-6,9-dioksa-3,12-diazatetradekan-1,14-dioinowy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00004291</td><td>Numer CAS: 67-42-5</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Numer CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM 2500P</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td> podstawowe <td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>Numer CAS: 50-99-7</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>345386</td><td>Numer CAS: 9001-37-0</td></tr><tr><td>GMPCPP (5'-&alfa,&beta;-metylenodifosfonian guanylylu)</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405S</td><td>Numer CAS: 14997-54-7</td></tr><tr><td>HFE7500 Olej</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific</td><td>Thermix model płyty grzejnej 100M</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorek potasu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>Numer CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Numer CAS: 67-56-1</td></tr><tr><td>MgCl2 (chlorek magnezu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Numer CAS: 7786-30-3</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf - Thermo Fisher</td><td>1,5 ml</td><td></td></tr><tr><td>Nanoczysty oczyszczacz</td> <td>wodySartorius</td><td>arium mini</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (wodorotlenek sodu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SX0603</td><td>Numer CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td> Miernik pH <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientist</td><td>Orion 3 STAR</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenol-pirogronian (PEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00044476</td><td>Numer CAS: 4265-07-0</td></tr><tr><td>RURY (kwas 1,4-piperazynodietaniosulfonowy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Numer CAS: 5625-37-6</td></tr><tr><td>Pipety (0,2 - 1000 &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>RAN Surfaktant (UWAGA: "FluoSurf" firmy Emulso jest alternatywą)</td> Olej silikonowy <td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>(100mpa s-1000 mpa s)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Numer CAS: 63148-52-7</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofisher</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa wahadłowa</td><td>Thermo Scientist</td><td>Sorvall legend RT+</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Baza elastomerowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Utwardzacz</td> World <td>Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>MiniSpin Plus</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetrametyloetylenodiamina)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610800</td><td>Numer CAS: 110-18-9</td></tr><tr><td>Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00006846</td><td>Numer CAS: 53188-07-1</td></tr><tr><td>Cytoszkielet</td><td>tubulinowy</td><td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina (oznaczona rodaminą)</td><td>Cytoszkielet</td><td>TL590M-A</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>Optima Max-TL</td><td></td></tr><tr><td>Klej utwardzany promieniami UV UV Light RapidFix</td><td></td> (UWAGA: "Norland NO81" jest alternatywą)RapidFix <td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Thelco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Bibuła filtracyjna</td><td>Sigma</td><td>Aldrich WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Forming, Confining, and Observing Microtubule-Based Active Nematics

Tworzenie aktywnych faz na bazie biopolimerów stało się ważną techniką dla badaczy zainteresowanych badaniem powstającej dziedziny aktywnych ciekłych kryształów i ich możliwych ról w biologii komórki. Te nowatorskie systemy składają się z samonapędzających się podjednostek, które zużywają energię lokalnie, wytwarzając niezrównoważony płyn dynamiczny. Aby utworzyć aktywną fazę ciekłokrystaliczną opisaną w tym raporcie, oczyszczone składniki białkowe, w tym biopolimery i silniki molekularne, są łączone, a aktywna faza nematyczna spontanicznie tworzy się w obecności adenozynotrójfosforanu (ATP). Aby zaobserwować stan nematyczny, materiał musi być zamknięty w odpowiedniej geometrii do mikroskopii o wystarczająco dużej gęstości. W artykule opisano dwie różne metody tworzenia aktywnej fazy nematycznej za pomocą mikrotubul i silników kinezynowych: montaż dwuwymiarowej warstwy aktywnej na granicy faz oleju i wody oraz montaż pod warstwą oleju za pomocą studzienki elastomerowej. Opisano również techniki wprowadzania materiału aktywnego do małych studzienek o różnych kształtach.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny obraz pojedynczych mikrotubul przygotowanych z tubuliny GMPCPP. Obraz ukazuje krótkie mikrotubule o podobnych długościach (z pewnym stopniem rozproszenia). Odpowiednie rozcieńczenie roztworu mikrotubul powinno pozwolić na uzyskanie obrazu dobrze odseparowanych mikrotubul w celu weryfikacji ich długości. Obrazowanie poszczególnych mikrotubul może być utrudnione ze względu na ich mały rozmiar. Do tej aplikacji najlepiej zastosować kamerę o wysokiej czułości, przeznaczoną do mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają przykładowe obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej z udanych eksperymentów przeprowadzonych odpowiednio metodą komory przepływowej (sekcja 2.1) oraz metodą odwróconą (sekcja 2.2). Dobrze uformowana aktywna warstwa nematyczna jest jednorodna pod względem tekstury, bez znaczących obszarów pustych, z obecnymi ruchomymi defektami topologicznymi. Należy jednak zauważyć, że w rdzeniach defektów mogą występować dopuszczalne małe pustki. Oprócz przykładów pokazanych na Rysunku 2 i Rysunku 3, dołączono trzy dodatkowe filmy (Film 1, Film 2 oraz Film 3), aby zademonstrować, jak powinien wyglądać aktywny nematyk w udanym eksperymencie. Wszystkie filmy pokazują płynny, ciągły ruch aktywnej fazy nematycznej. Po osiągnięciu stanu stacjonarnego przez materiał nie są widoczne żadne zmiany w stężeniu mikrotubul. Dopóki w układzie znajduje się wystarczająca ilość ATP, materiał będzie poruszał się jednorodnie.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający analizę rozkładu i gęstości komórek bakteryjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający mikrotubule GMPCPP. Mikrotubule GMPCPP oznakowano w stężeniu 4% tubuliną z rodamyną i polimeryzowano przez 20 min w 37 °C. Obrazowanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu mikrofluidycznego do separacji cieczy; obrazy mikroskopowe sieci włókien; A-B: układ, C-D: włókna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Nematyki mikrotubul w komorze przepływowej. (A) Schemat przekroju poprzecznego komory przepływowej o geometrii 1 mm x 18 mm. (B) Schemat komory przepływowej widziany z góry. (C) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający typowy wygląd roztworu aktywnego przed montażem na granicy faz olej/woda. (D) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej aktywnej fazy nematycznej zgromadzonej na granicy faz olej/woda wewnątrz komory przepływowej. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy tkanki mózgowej pokazujący strukturę komórkową; pasek skali jako punkt odniesienia pomiaru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający aktywny nematyk przygotowany metodą odwróconą. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Równowaga statyczna; układ powlekania PDMS i akrylamidem; mikroskopia fluorescencyjna; nematyki oparte na MT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Schemat blokowy ilustrujący metodę ograniczania aktywnych nematyków w studzience z PDMS, obejmujący wykonanie formy oraz modyfikację powierzchni. Pasek skali na prawym obrazie (ograniczony materiał aktywny) = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film 1: Reprezentatywny wynik dla aktywnego nematyka przygotowanego metodą celi przepływowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE1_JOVE.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Reprezentatywny wynik dla aktywnego nematyka przygotowanego metodą odwróconą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE2_JOVE.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 3: Reprezentatywny wynik dla aktywnego nematyka przygotowanego metodą odwróconą i ograniczonego do eliptycznego wgłębienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE3_JOVE.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

The formation of biopolymer-based active phases has become an important technique for researchers interested in exploring the emerging field of active ...

Aktywna nematyka stała się ekscytującym tematem badawczym, który rozszerza dziedziny dynamiki nieliniowej i ciekłych kryształów. Istnieją złożone płyny, które wykazują śmiertelne defekty topologiczne i chaotyczną dynamikę. W literaturze przedmiotu znajduje się wiele najnowszych badań teoretycznych poświęconych ograniczonej nematyce aktywnej.Jednak dla eksperymentatorów wyzwaniem było ograniczenie materiału do geometrii w mikroskali. Nasza technika sprawia, że konfiguracja eksperymentalna jest prostsza, dzięki czemu nowe grupy mogą wejść w teren i wypróbować te ekscytujące materiały. Techniki te mogą być stosowane w innych systemach materii aktywnej EQUIS, na przykład w celu utworzenia kompozycji fazowej efektów, a ponieważ w przyszłości opracowywane są bardziej aktywne fazy, eksperymentatorzy muszą znaleźć sposoby na ograniczenie materiału za pomocą podobnych nematyki.Procedurę zademonstrują Derek Hammar i Fereshteh Memarian, doktoranci z mojego laboratorium. Aby przygotować hydrofilowe szkiełka nakrywkowe z powłoką akrylową, należy rozpocząć od dokładnego oczyszczenia szkiełek nakrywkowych wodą z mydłem, etanolem i 0,1 molowym wodorotlenkiem sodu z naprzemiennym płukaniem przy użyciu wody o czystości nano. Po spłukaniu pokryć okładkę roztworem silanu składającym się ze 100 mililitrów etanolu, jednego mililitra kwasu ascetycznego i 500 mikrolitrów metakrylanu trimetoksysililopropylu a przez 15 minut.Następnie spłucz nano czystą wodą. Przygotuj roztwór akrylamidu z 95 mililitrów nano czystej wody i pięciu mililitrów 40-procentowego akryloamidu. Następnie odgazowywać roztwór przez 30 minut w piecu próżniowym, dodać 0,07 grama amonu na siarczyn i 35 mikrolitrów tetrametyloetylenodiaminy, aby uzyskać końcowe stężenie 2,3 milimola.Wlać roztwór akrylamidu na szkiełka nakrywkowe skierowanymi do góry i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Aby przygotować hydrofobowe szkiełka mikroskopowe, należy odpipetować 100 mikrolitrów roztworu hydrofobowego na czyste szklane szkiełko mikroskopowe. Następnie umieść na wierzchu kolejne czyste szkiełko podstawowe.Zapewnia to równomierne pokrycie roztworu hydrofobowego na powierzchni, na której się znajduje przez dwie minuty. Wyjmij drugie szkiełko podstawowe i dokładnie spłucz pierwsze szkiełko wodą o czystości nano. Następnie wysuszyć gazowym azotem.Przygotuj mieszaninę oleju inżynieryjnego, która zawiera 1,8% fluorowego środka powierzchniowo czynnego. Zamontuj szkiełko i szkiełko nakrywkowe za pomocą dwustronnych przekładek samoprzylepnych o długości 40 mikrometrów. Umieść przekładki w odległości 1.5 milimetra od siebie na hydrofobowym szkiełku mikroskopowym.Następnie umieść szkiełko nakrywkowe pokryte akrylamidem na podkładkach dystansowych stroną zaimpregnowaną do dołu, aby przylegało. Po zbudowaniu komory przepływowej natychmiast odpipetować mieszaninę oleju do komory przepływowej, wypełniając zamkniętą przestrzeń za pomocą pipety w osobnej fiolce, delikatnie wymieszać sześć mikrolitrów materiału aktywnego z 3,73 mikrolitra mieszanki. Jeden mikrolitr roztworu mikrotubul, 0,6 mikrolitra roztworu ATP i 0,67 mikrolitra pipety buforowej M two B wypełnia sześć mikrolitrów świeżo zmieszanego materiału aktywnego do jednego otwartego końca komory przepływowej.Część oleju zostanie wyparta przez roztwór wodny, gdy zostanie on wstrzyknięty do kanału. Można to usunąć na przeciwległym końcu kanału przepływowego za pomocą małego kawałka bibuły. Po napełnieniu uszczelnij obie strony komory przepływowej klejem epoksydowym, który twardnieje pod wpływem światła UV przez 20 sekund.Ograniczenie warstwy czynnej między dwoma dopuszczalnymi płynami w warstwie quasi-2D. Umieścić komórkę przepływową w wirówce z odchylanym wiadrem z fazą wodną na górze i gęstszą warstwą oleju pod spodem, odwirować pod ciśnieniem 212 G na 10 minut. Po zakończeniu tego kroku komórkę przepływową można przenieść do mikroskopu epifluorescencyjnego w celu zobrazowania z obiektywem o powiększeniu 10 x lub 20 x.Najpierw zaprojektuj główną formę dla PDMS. Można to osiągnąć poprzez drukowanie 3D filarów na podłożu. Po wydrukowaniu 3D formy głównej żywicy, wyczyść ją izopropanolem, a następnie utwardź formę pod lampą UV przez 45 minut i w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez dwie godziny, przygotuj poli barwnik metylowocyjan za pomocą utwardzacza elastomerowego i bazy elastomerowej.Wymieszaj oba składniki w stosunku 1 do 10 za pomocą metalowej szpatułki. Aby usunąć te pęcherzyki, umieść mieszaninę w próżni w celu odgazowania na jedną godzinę, po czym nieutwardzony PDMS powinien wydawać się przezroczysty. Wlej PDMS do odpowiedniej formy i pozostaw na noc do utwardzenia w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Aby przygotować hydrofilową powierzchnię PDMS, wyczyść PDMS przez 10 minut zarówno etanolem, jak i izopropanolem, a następnie dokładnie spłucz trzykrotnie wodą dejonizowaną i wysusz. Użyj myjki plazmowej przez pięć minut, aby wyczyścić utwardzony na sucho PDMS. To sprawia, że powierzchnia jest bardziej hydrofilowa.Następnie należy przygotować roztwór silanu i zanurzyć podłoże w tym roztworze na 15 minut w celu przygotowania powłoki akrylowej, dokładnie spłukać podłoże wodą dejonizowaną i zanurzyć w roztworze akrylamidu. Gdy jest gotowy do użycia, spłucz powierzchnię wodą dejonizowaną i osusz azotem do natychmiastowego użycia. Przymocuj PDMS do szkiełka za pomocą kleju epoksydowego, odpipetuj jeden mikrolitr mieszaniny aktywnej na podłoże PDM i natychmiast dodaj olej silikonowy na kroplę aktywnej sieci.Aktywna sieć przeniesie się do studni. Ten proces trwa do 60 minut. Umieść urządzenie PDMS w wirówce z odchylanym wiadrem z warstwą oleju nad warstwą wody i wiruj przez 12 minut w temperaturze 212 G. Po zakończeniu tego kroku zabierz materiał do mikroskopu w celu zobrazowania, aby zarejestrować postęp materiału.Gdy się równoważy. Reprezentatywny obraz przedstawia krótkie mikrotubule o podobnej długości. Poszczególne mikrotubule mogą być trudne do zobrazowania ze względu na ich mały rozmiar.Do tego zastosowania najlepiej nadaje się kamera o wysokiej czułości przeznaczona do mikroskopii fluorescencyjnej. Dobrze uformowana aktywna warstwa pneumatyczna ma jednorodną teksturę, bez znaczących pustych przestrzeni i ruchomych wad topologicznych. Należy jednak pamiętać, że w uszkodzonych rdzeniach mogą występować pewne dopuszczalne małe puste przestrzenie.Właściwa obróbka powierzchni, aby uzyskać powierzchnię hydrofilową lub hydrofobową. Dzięki tej metodzie można łatwo omówić geometrię walcowania, a aktywną strukturę można kontrolować, zmieniając tylko fizyczne unieruchomienie.

forming-confining-and-observing-microtubule-based-active-nematics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj metodę przygotowania i ograniczania aktywnych nematyków opartych na mikrotubulach i kinezynach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki materii aktywnej w mikroskali z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Przeglądaj więcej filmów