Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Projektujemy wszechstronne systemy fermentacji w stanie stałym, babki lancetowatej, produkcji enzymów przez grzyby. Badanie, w jaki sposób różne induktory, typy inokularne i systemy obrotowe poprawiają skalowalność i żel.

Zwiększenie skali obrotowych systemów fermentacji w stanie stałym przy jednoczesnym utrzymaniu jednorodnych warunków, transferu tlenu i stałej wydajności enzymów pozostaje kluczowym wyzwaniem eksperymentalnym.

Wykazaliśmy, że obrotowe systemy fermentacji w stanie stałym dają od czterech do sześciu razy wyższą wydajność przy tej samej wydajności niż fermentacja zanurzeniowa, co pokazuje ich wszechstronność i skalowalność dla wielu enzymów.

Nasz protokół integruje mieszanie rotacyjne, różne typy protokołów i różnorodność specyficznych induktorów, zapewniając wysokiej klasy żele enzymatyczne, jednorodny wzrost i możliwość zastosowania w wielu systemach enzymatycznych.

Skupimy się na zwiększeniu skali rotacyjnego systemu fermentacji w stanie stałym, aby zbadać ich zastosowanie do produkcji nowych enzymów w sektorach żywności, bioenergii i środowiska.

[Narrator] Na początek umyj otręby pszenne trzy razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości materii organicznej, zanieczyszczenia i kurz. Umyte otręby pszenne rozłóż na aluminiowej blasze i susz w piekarniku nastawionym na 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby przygotować zawiesinę zarodników, przenieś tarczę ślimaka o średnicy pięciu milimetrów nasączoną grzybnią na płytkę ślimaka ze świeżej dekstrozy ziemniaczanej. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni lub do momentu, gdy grzybnia nasyci podłoże. Następnie dodaj pięć mililitrów sterylnej wody destylowanej do płytki i za pomocą sterylnej pętli oderwij zarodniki od powierzchni. Teraz przygotuj rozcieńczenie zawiesiny zarodników w proporcji od 1 do 100, używając sterylnej wody destylowanej. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny do komory Neubauera i policzyć zarodniki za pomocą mikroskopu. W przypadku hodowli płynnej użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść nasyconą grzybnią tarczę ślimaka na płytkę ślimaka ze świeżej dekstrozy ziemniaczanej. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż podłoże będzie w pełni nasycone. Przygotować 25 mililitrów bulionu z dekstrozy ziemniaczanej w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mililitrów i autoklawować kolbę w celu sterylizacji pożywki. Następnie przenieś pięciomilimetrowy krążek grzybni z nasyconej płytki PDA do sterylnego bulionu. Inkubować kolbę na wytrząsarce z prędkością 125 obr./min przez 24 do 48 godzin, dostosowując czas w zależności od szczepu grzyba. Zebrać dwa mililitry bulionu hodowlanego do przygotowania inokulum i kolejne dwa mililitry do oznaczenia suchej masy. W celu bezpośredniego zaszczepienia krążków grzybni, umieścić nasycony grzybnią krążek ślimakowy na świeżej płytce ślimaka z dekstrozą ziemniaczaną i inkubować ją w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż pożywka będzie w pełni nasycona. Przygotuj probówkę z substratem z pięcioma gramami otrębów pszennych, 0,5 grama induktora i 5,5 mililitra wody i autoklawuj probówkę w temperaturze 15 funtów na cal kwadratowy przez 15 minut. Po schłodzeniu włóż sondę elektrody bezpośrednio do reaktora na różnych głębokościach, aby zmierzyć wilgotność względną za pomocą higrometru opartego na elektrodach. Zaszczep substrat jednym mililitrem zawiesiny zarodników, zawierającej 10 do mocy sześciu do 10 do mocy siedmiu zarodników na mililitr. Wiruj rurki z maksymalną prędkością przez pięć minut w jednominutowych cyklach, aby uniknąć zbrylania się podłoża. Następnie umieść rurki w mieszalniku obrotowym z osią poziomą. Mieszalnik obrotowy należy inkubować w inkubatorze ustawionym na optymalną temperaturę wzrostu mikroorganizmu. W celu ekstrakcji enzymatycznej ponownie zawiesić substrat w 20 mililitrach wstępnie schłodzonego buforu po pożądanym okresie fermentacji. Wiruj rurki w cyklach trwających jedną minutę z maksymalną prędkością, a następnie jedną minutę na lodzie. Przefiltrować zawiesinę za pomocą filtrów papierowych i nacisnąć, aby mechanicznie usunąć supernatant. Na koniec odwirować supernatant o sile 3000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu sklarowania cieczy. Po sześciu dniach fermentacji w stanie stałym, substrat wykazywał widoczną kolonizację grzybów z włóknistą siecią grzybni pokrywającą powierzchnię. Tworzenie glukozaminy poprzez hydrolizę chitozanu było znacznie wyższe w Trichoderma harzianum podczas fermentacji w stanie stałym, co wskazuje, że aktywność chitynazy w tym przypadku była znacznie wyższa niż w fermentacji zanurzeniowej. Podobnie, aktywność amylazy przez aspergillus lentulus była znacznie zwiększona w fermentacji w stanie stałym w porównaniu z fermentacją zanurzoną.