Name: Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę fermentacji w stanie stałym do produkcji enzymów hydrolitycznych z wykorzystaniem otrąb pszennych i grzybów strzępkowych. To podejście zwiększa wydajność enzymów cztero- do sześciokrotnie w porównaniu z fermentacją zanurzeniową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Secretaría de Investigación y Posgrado Instituto Politécnico Nacional (SIP-IPN) poprzez granty/projekty o numerach 20220487, 20230676, 20240793 i 20251269 przyznane GGS oraz 20220492, 20230427, 20240335 i 20251139 przyznane DROH. Autorzy pragną wyrazić wdzięczność ENCB-IPN, Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México (Secihti), wcześniej znanej jako Consejo Nacional de Ciencia, Humanidades y Tecnología (CONAHCyT) i BEIFI-program, a także Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías z Instituto Politécnico Nacional za ich nieocenione wsparcie. López-García dziękuje Secihti (wcześniej CONAHCyT) za stypendium magisterskie, a także IPN za stypendium SIP-BEIFI. Legorreta-Castañeda jest stypendystką stażu podoktorskiego w ramach programu "Estancias Posdoctorales por México" w Secihti, znanego wcześniej jako CONAHCyT.

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie podłoża
UWAGA: Używaj komercyjnej marki otrębów pszennych, aby zminimalizować znaczące różnice w charakterystyce podłoża. Każda partia otrębów pszennych różni się pod wpływem wielu czynników, co sprawia, że jest to materiał niejednorodny, który jest trudny do standaryzacji, co prowadzi do wahań zawartości jego składników. Jeśli wymagany jest znormalizowany materiał, wybierz alternatywną matrycę lub wykonaj przybliżoną analizę chemiczną każdej partii otrębów pszennych, aby dostosować ją do potrzeb.
<ol>
	<li>Umyj otręby pszenne trzy razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości materii organicznej, zanieczyszczenia i kurz. Usuwa to również cukry proste, które mogłyby zakłócać fermentację.</li>
	<li>Umyte otręby rozłóż na aluminiowej blasze i susz w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Po wysuszeniu umieść otręby pszenne w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum
UWAGA: Protokół ten opisuje trzy metody przygotowania inokulum: zawiesinę zarodników, bezpośrednią inokulację krążkami grzybni i zawiesinę komórkową. Ustal początkowe stężenie inokulum i określ ilościowo poziomy białka, aby uzyskać dokładne obliczenia plonów.
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny zarodników<ol>
		<li>Przenieść krążek agarowy o średnicy 5 mm nasycony grzybnią na płytkę agarową ze świeżym dekstrozą ziemniaczaną. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 5-7 dni lub do momentu, gdy grzybnia nasyci pożywkę. Niektóre grzyby mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji.</li>
		<li>Dodać 5 ml sterylnej wody destylowanej do płytki i mechanicznie odłączyć zarodniki za pomocą sterylnej pętli.</li>
		<li>Przygotować zawiesinę zarodników w stosunku 1:100. Umieść 10 μl na środku komory Neubauera i policz zarodniki pod mikroskopem. Obliczyć stężenie zarodników (zarodniki/ml) na podstawie współczynnika komory i rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa grzybni w płynnym podłożu<ol>
		<li>Przenieść 5-milimetrowy krążek agarowy nasycony grzybnią na świeżą płytkę z agarem ziemniaczano-dekstrozowym i inkubować w temperaturze 28 °C aż do nasycenia.</li>
		<li>Przygotować 25 ml bulionu ziemniaczano-dekstrozowego w sterylnej kolbie o pojemności 125 ml i autoklawie.</li>
		<li>Przenieść 5 mm krążek grzybni z nasyconej płytki do sterylnego bulionu.</li>
		<li>Inkubować kolbę na wytrząsarce z prędkością 125 obr./min przez 24-48 godzin, w zależności od szczepu grzyba. Wydłuż czas inkubacji wolno rosnących grzybów.</li>
		<li>Zebrać 2 ml do inokulum i 2 ml do oznaczenia suchej masy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednia inokulacja krążków grzybni<ol>
		<li>Umieścić 5 mm krążek agarowy nasycony grzybnią na świeżej płytce z agarem ziemniaczano-dekstrozowym. Inkubować w temperaturze 28 °C aż do nasycenia.</li>
		<li>Użyj jednego krążka grzybni jako inokulum, a drugiego do określenia suchej masy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie systemu SSF
UWAGA: Induktory mogą być naturalne lub komercyjne. Oczyszczone induktory komercyjne są preferowane w celu zminimalizowania zanieczyszczeń, które mogłyby zmienić wydajność fermentacji. Dostosuj dodatki wody, aby utrzymać wilgotność względną co najmniej 90%.
<ol>
	<li>Połącz następujące składniki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 5 g suchych otrębów pszennych; 0,2 g induktora (np. chityny handlowej); 5,5 ml wody (dostosować w zależności od zdolności wchłaniania wody przez induktor); 5 ml sterylnego roztworu soli zawierającego 16 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 4 g/l siarczanu sodu, 2 g/l chlorku potasu, 1 g/l chlorku wapnia, 400 mg/l chlorku, 60 mg/l kwasu borowego, 40 mg/l molibdenianu sodu, 150 mg/l chlorku magnezu, 100 mg/l chlorku żelaza i 400 mg/l siarczanu miedzi.</li>
	<li>Zmierz wilgotność względną za pomocą higrometru opartego na elektrodzie, zapewniając wilgotność co najmniej 90%. Włóż sondę elektrody bezpośrednio do reaktora na różnych głębokościach, aby uzyskać reprezentatywny pomiar rozkładu wilgoci.<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby dostosować wilgotność, jeśli jest poniżej 90%:<ol>
			<li>Stopniowo dodawać sterylną wodę destylowaną w odstępach co 1 ml na 10 g substratu. Po każdym dodaniu dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wilgoci.</li>
			<li>Pozostaw podłoże do wyrównania przez 10-15 minut. Ponownie zmierz poziom wilgotności.</li>
			<li>Powtarzaj powyższe kroki, aż do osiągnięcia docelowej wilgotności 90%. Unikaj nadmiernego zwilżania podłoża przez cały proces.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby dostosować wilgotność, jeśli przekracza 90%:<ol>
			<li>Rozprowadzić cienko podłoże w sterylnym środowisku. Nadmiar wilgoci usunąć poprzez (1) wystawienie podłoża na laminarny przepływ powietrza lub (2) umieszczenie go w komorze suszącej w temperaturze 30 °C na 10-15 minut.</li>
			<li>Alternatywnie, delikatnie wymieszaj podłoże, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wilgoci. Po zabiegu ponownie oceń poziom wilgotności.</li>
			<li>W razie potrzeby powtórz etap suszenia lub mieszania, aż wilgotność osiągnie 90%. Kontynuuj fermentację dopiero po osiągnięciu docelowej wilgotności.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Autoklawuj rurkę pod ciśnieniem 15 psi przez 15 minut.</li>
	<li>Po schłodzeniu zaszczepić substrat jednym z poniższych: 1 ml zawiesiny zarodników (1 x 106-1 x 107 zarodników/ml), 2 ml zawiesiny komórkowej lub jednym 5 mm krążkiem grzybni.</li>
</ol>
4. Procedura fermentacji w stanie stałym (SSF)
UWAGA: W przypadku badań kinetycznych lub ocen parametrów w różnym czasie, należy przygotować osobne probówki dla każdego punktu czasowego, aby zapewnić reprezentatywność.
<ol>
	<li>Unikaj zbrylania się podłoża, wirując rurki z maksymalną prędkością przez 5 minut w cyklach 1-minutowych.</li>
	<li>Umieść rurki w mieszalniku obrotowym z osią poziomą. Upewnij się, że podłoże swobodnie porusza się wewnątrz rurek. Ustaw mikser tak, aby działał z prędkością 10 obr./min.</li>
	<li>Inkubować mieszalnik w inkubatorze w optymalnej temperaturze wzrostu mikroorganizmu. Utrzymuj podawaną temperaturę, aby uzyskać optymalną aktywność enzymatyczną podczas stosowania induktorów wrażliwych na ciepło.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja enzymów
UWAGA: Podstawy ekstrakcji opierają się na rozpuszczalności i maksymalnej aktywności pH enzymu zewnątrzkomórkowego. Ponieważ SSF unika środowiska wodnego, enzym zewnątrzkomórkowy jest zaangażowany w wodę otaczającą stałą matrycę, co oznacza, że stężenie jest wyższe niż w SmF. W tym kontekście wybór najlepszego bufora ekstrakcyjnego zależy od wiedzy na temat pożądanej aktywności. Optymalizacja ekstrakcji zależy od końcowego stężenia enzymu i rodzaju zastosowanego buforu ekstrakcyjnego.
<ol>
	<li>Po pożądanym okresie fermentacji ponownie zawiesić substrat w 20 ml wstępnie schłodzonego buforu. Przykłady obejmują: 0,1 M bufor octanowy, pH 5,6, do ekstrakcji chitynazy; 0,02 M bufor fosforanowy, pH 6,9, do ekstrakcji amylazy.</li>
	<li>Wiruj rurki w cyklach: 1 minuta z maksymalną prędkością, a następnie 1 minuta na lodzie. Powtórz 10 razy.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę za pomocą filtrów bibułowych i mechanicznie wyekstrahować supernatant przez prasowanie.</li>
	<li>Klarować sklarowany sklarowany składnik osadu przez odwirowanie w stężeniu 3000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ekstrakt surowy należy stosować bezpośrednio lub dalej oczyszczać enzym za pomocą chromatografii kolumnowej lub filtrów odśrodkowych. Zaleca się również badania kinetyczne w celu wyznaczenia stałej Michaelisa (Km) i maksymalnej szybkości przemian enzymatycznych (Vmax)12.</li>
</ol>
6. Proces optymalizacji
UWAGA: Zoptymalizuj ten protokół, oceniając i dostosowując jakość i stężenie induktorów, a także rodzaj i stężenie inokulum.
<ol>
	<li>Określ idealny czas fermentacji i udoskonal etapy ekstrakcji, aby poprawić wydajność.</li>
	<li>Kontroluj i dostrajaj warunki środowiskowe, w tym temperaturę, pH i napowietrzanie.</li>
	<li>Przetestuj różne i warunki ekstrakcji, aby zwiększyć wydajność i stabilność enzymów.</li>
	<li>Wykonuj analizy statystyczne, takie jak metodologia powierzchni odpowiedzi, w celu zidentyfikowania najbardziej wpływowych zmiennych i osiągnięcia optymalnej produkcji enzymów.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+solid-state+fermentation+of+crops+and+their+by-products+to+obtain+protein+resources%3A+The+next+frontier+of+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Fungal solid-state fermentation of crops and their by-products to obtain protein resources: The next frontier of food industry.</a> Trends Food Sci Technol. 138, 628-644 (2023).</li>
<li>López-García, C. L., Guerra-Sánchez, G., Santoyo-Tepole, F., Olicón-Hernández, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+induction+in+Trichoderma+harzianum%3A+A+solid-state+fermentation+approach+using+shrimp+waste+and+wheat+bran%2Fcommercial+chitin+for+chitooligosaccharides+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chitinase induction in Trichoderma harzianum: A solid-state fermentation approach using shrimp waste and wheat bran/commercial chitin for chitooligosaccharides synthesis.</a> Prep Biochem Biotechnol. 54 (8), 1040-1050 (2024).</li>
<li>Sadh, P. K., Duhan, S., Duhan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agro-industrial+wastes+and+their+utilization+using+solid+state+fermentation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22BIOB%22%5BJournal%5D)">Agro-industrial wastes and their utilization using solid state fermentation: A review.</a> BIOB. 5 (1), 1(2018).</li>
<li>Viniegra-González, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+fungal+enzyme+production+in+solid+state+over+liquid+fermentation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems.</a> Biochem Eng J. 13 (2), 157-167 (2003).</li>
<li>Olicón-Hernández, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+chitosan-oligosaccharides+by+the+chitin-hydrolytic+system+of+Trichoderma+harzianum+and+their+antimicrobial+and+anticancer+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Production of chitosan-oligosaccharides by the chitin-hydrolytic system of Trichoderma harzianum and their antimicrobial and anticancer effects.</a> Carbohydr Res. 486, 107836(2019).</li>
<li>Leite, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+production+of+lignocellulolytic+enzymes+by+solid-state+fermentation+of+agro-industrial+wastes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Green+Sustain+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in production of lignocellulolytic enzymes by solid-state fermentation of agro-industrial wastes.</a> Curr Opin Green Sustain Chem. 27, 100407(2021).</li>
<li>Chmelová, D., Legerská, B., Kunstová, J., Ondrejovič, M., Miertuš, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+laccases+by+white-rot+fungi+under+solid-state+fermentation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The production of laccases by white-rot fungi under solid-state fermentation conditions.</a> World J Microbiol Biotechnol. 38 (2), 21(2022).</li>
<li>López-Gómez, J. P., Venus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+sequential+solid-state+and+submerged-liquid+fermentations+in+a+circular+bioeconomy%5BTitle%5D)+AND+%22Fermentation%22%5BJournal%5D)">Potential role of sequential solid-state and submerged-liquid fermentations in a circular bioeconomy.</a> Fermentation. 7 (2), 76(2021).</li>
<li>Molelekoa, T. B., Regnier, T., Da Silva, L. S., Augustyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pigments+by+filamentous+fungi+cultured+on+agro-industrial+by-products+using+submerged+and+solid-state+fermentation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Fermentation%22%5BJournal%5D)">Production of pigments by filamentous fungi cultured on agro-industrial by-products using submerged and solid-state fermentation methods.</a> Fermentation. 7 (4), 295(2021).</li>
<li>Rodrigues, E. M., Karp, S. G., Malucelli, L. C., Helm, C. V., Alvarez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laccase+production+by+Ganoderma+lucidum+in+submerged+and+solid-state+fermentation+using+different+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Basic+Microbio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laccase production by Ganoderma lucidum in submerged and solid-state fermentation using different inducers.</a> J Basic Microbio. 59 (8), 784-791 (2019).</li>
<li>Soccol, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+and+innovations+in+solid-state+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Res+Innov%22%5BJournal%5D)">Recent developments and innovations in solid-state fermentation.</a> Biotechnol Res Innov. 1 (1), 52-71 (2017).</li>
<li>Silverstein, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+both+Km+and+Vmax+are+altered%2C+is+the+enzyme+inhibited+or+activated%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Edu%22%5BJournal%5D)">When both Km and Vmax are altered, is the enzyme inhibited or activated.</a> Biochem Mol Biol Edu. 47 (4), 446-449 (2019).</li>
<li>Suresh, P. V., Anil Kumar, P. K., Sachindra, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoactive+%CE%B2-n-acetylhexosaminidase+production+by+a+soil+isolate+of+Penicillium+monoverticillium+CFR+2+under+solid+state+fermentation%3A+Parameter+optimization+and+application+for+n-acetyl+chitooligosaccharides+preparation+from+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Thermoactive β-n-acetylhexosaminidase production by a soil isolate of Penicillium monoverticillium CFR 2 under solid state fermentation: Parameter optimization and application for n-acetyl chitooligosaccharides preparation from chitin.</a> World J Microbiol Biotechnol. 27 (6), 1435-1447 (2011).</li>
<li>Rahardjo, Y. S. P., Sie, S., Weber, F. J., Tramper, J., Rinzema, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+oxygen+concentrations+on+growth+and+%CE%B1-amylase+production+of+Aspergillus+oryzae+in+model+solid-state+fermentation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of low oxygen concentrations on growth and α-amylase production of Aspergillus oryzae in model solid-state fermentation systems.</a> Biomol Eng. 21 (6), 163-172 (2005).</li>
<li>Singhania, R. R., Patel, A. K., Thomas, L., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSinghania%2C+RR+%22Solid-State+Fermentation+in+Industrial+Biotechnology+-+Products+and+Processes%22">Solid-State Fermentation in Industrial Biotechnology - Products and Processes</a>. Wittmann, C., Liao, J. C. 4, 187-204 (2017).</li>
<li>Sala, A., Barrena, R., Artola, A., Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+the+production+of+fungal+biological+control+agents+by+solid-state+fermentation+using+organic+solid+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Current developments in the production of fungal biological control agents by solid-state fermentation using organic solid waste.</a> Crit Rev Environ Sci Technol. 49 (8), 655-694 (2019).</li>
<li>Steudler, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteudler%2C+S+%22Better+one-eyed+than+blind-Challenges+and+opportunities+of+biomass+measurement+during+solid-state+fermentation+of+basidiomycetes+in+Filaments+in+bioprocesses%22">Better one-eyed than blind-Challenges and opportunities of biomass measurement during solid-state fermentation of basidiomycetes in Filaments in bioprocesses</a>. Krull, R., Bley, T. , Springer International Publishing. Cham. 223-252 (2015).</li>
<li>Farinas, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+solid-state+fermentation+for+the+production+of+biomass-degrading+enzymes+for+the+bioenergy+sector%5BTitle%5D)+AND+%22Renew+Sustain+Energy+Rev%22%5BJournal%5D)">Developments in solid-state fermentation for the production of biomass-degrading enzymes for the bioenergy sector.</a> Renew Sustain Energy Rev. 52, 179-188 (2015).</li>
<li>Marques, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+xylanases+production+by+endophytic+fungi+by+solid+state+fermentation+using+lignocellulosic+substrates+and+enzymatic+saccharification+of+pretreated+sugarcane+bagasse%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Cellulases and xylanases production by endophytic fungi by solid state fermentation using lignocellulosic substrates and enzymatic saccharification of pretreated sugarcane bagasse.</a> Ind Crops Prod. 122, 66-75 (2018).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valorization+of+wheat+bran+by+three+fungi+solid-state+fermentation%3A+Physicochemical+properties%2C+antioxidant+activity%2C+and+flavor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Valorization of wheat bran by three fungi solid-state fermentation: Physicochemical properties, antioxidant activity, and flavor characteristics.</a> Foods. 11 (12), 1722(2022).</li>
<li>Mitchell, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitchell%2C+DA+%22Solid+state+fermentation%3A+Research+and+industrial+applications%22">Solid state fermentation: Research and industrial applications</a>. Steudler, S., Werner, A., Cheng, J. J. , Springer International Publishing. Cham. 27-50 (2019).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+H+%22Modern+Solid+State+Fermentation%3A+Theory+and+Practice%22">Modern Solid State Fermentation: Theory and Practice</a>. Chen, H. , Springer Dordrecht. 1-324 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W badaniu tym przedstawiono odpowiedni protokół optymalizacji produkcji enzymów za pomocą systemów fermentacji w stanie stałym (SSF), zaprojektowanych specjalnie dla grzybów strzępkowych. Poniżej omówiono krytyczne aspekty metodologii, wraz z jej znaczeniem, ograniczeniami i potencjalnymi zastosowaniami.
Powodzenie protokołu w dużym stopniu zależy od kluczowych etapów, takich jak przygotowanie substratu i inokulum. Właściwe mycie i suszenie otrębów pszennych jest niezbędne do wyeliminowania za...

Fermentacja w stanie stałym (SSF) stała się obiecującą i zrównoważoną technologią biokonwersji do produkcji wysokowartościowych enzymów, związków bioaktywnych i metabolitów wtórnych. Technika ta polega na wzroście mikroorganizmów na podłożach stałych z minimalną ilością wolnej wody, symulując ich naturalne środowisko i umożliwiając wydajną aktywność metaboliczną1. Głównym celem tego protokołu jest optymalizacja produkcji enzymów poprzez obrotowy system SSF, który zapewnia zwiększone wykorzystanie substratu, dyfuzję tlenu i skalowalność procesu. Wykorzystanie otrębów pszennych, obfitego produktu ubocznego rolno-przemysłowego, jako substratu bazowego, przyczynia się do waloryzacji odpadów rolniczych i promuje praktyki biogospodarki o obiegu zamkniętym2.
SSF ma znaczące zalety w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF), w tym mniejsze zużycie energii i wody, wyższe stężenie produktu i kompatybilność z szeroką gamą niedrogich pozostałości rolniczych, takich jak otręby pszenne, łuski ryżowe i wytłoki z trzciny cukrowej3. W przeciwieństwie do SmF, który wymaga dużych ilości wody i drogich pożywek, systemy SSF wykorzystują stałe matryce, które służą nie tylko jako powierzchnie wzrostu drobnoustrojów, ale także dostarczają składników odżywczych niezbędnych do aktywności mikrobiologicznej. Dodatkowo, ograniczona ilość wolnej wody w SSF minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia, dzięki czemu jest to bardziej niezawodna opcja do produkcji enzymów w warunkach przemysłowych4. Oprócz zalet operacyjnych,SSF przedstawia znaczące korzyści środowiskowe i ekonomiczne w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF). Badania wykazały, że SSF zmniejsza zużycie wody o 50%-70% i obniża koszty energii o ponad 30% ze względu na brak dużych ilości wody wymagających ciągłego mieszania i napowietrzania. Ponadto wykorzystanie pozostałości rolno-przemysłowych jako substratów minimalizuje koszty surowców i promuje praktyki gospodarki o obiegu zamkniętym poprzez zmianę przeznaczenia produktów ubocznych rolnictwa 2,4.
SSFzostał szeroko zweryfikowany pod kątem swojej wydajności i skalowalności. Na przykład badania wykazały 4-6-krotny wzrost aktywności enzymatycznej przy użyciu SSF w porównaniu z SmF, podkreślając ekonomiczne i środowiskowe zalety tej techniki 2,5. Ponadto dalszy proces jest uproszczony, ponieważ ekstrakcja enzymatyczna zazwyczaj wymaga mniej wody i mniej etapów oczyszczania. To sprawia, że SSF jest szczególnie atrakcyjny dla branż dążących do zmniejszenia kosztów operacyjnych i wpływu na środowisko6.
Obrotowy system SSF opisany w tym protokole oferuje kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi statycznymi metodami SSF. Podczas gdy systemy statyczne często napotykają wyzwania, takie jak nierównomierna kolonizacja substratu i ograniczenie tlenu, konfiguracja obrotowa zapewnia dokładne mieszanie i napowietrzanie, sprzyjając równomiernemu wzrostowi drobnoustrojów 7,8,9. Na przykład system ten został z powodzeniem wykorzystany do produkcji enzymów hydrolitycznych, takich jak chitynazy, amylazy i proteazy, przy użyciu gatunków grzybów, takich jak Aspergillus i Trichoderma2.
Kluczową cechą tego systemu SSF jest jego zdolność adaptacji. Wykorzystanie otrębów pszennych jako substratu bazowego świadczy o potencjale pozostałości rolno-przemysłowych w zakresie opłacalnej biokonwersji3. Co więcej, suplementacja substratu induktorami, takimi jak chityna, chitozan i skrobia, dodatkowo zwiększa syntezę enzymów poprzez stymulację określonych szlaków metabolicznych 2,10. System jest również kompatybilny z różnymi formami grzybów, w tym zarodnikami, grzybnią i granulkami, co pozwala użytkownikom dostosować proces do ich konkretnych wymagań2.
SSF oferuje szeroki potencjał zastosowania w różnych dziedzinach, takich jak biotechnologia żywności, produkcja biopaliw i remediacja środowiska11. Integracja opłacalnych substratów, wyjątkowa wydajność enzymów i wysoka elastyczność procesu sprawiają, że SSF jest niezbędnym podejściem do innowacji biotechnologicznych na skalę przemysłową.

<table><tbody><tr><td>Kolba Erlenmeyera o pojemności 125 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431684</td><td>Do hodowli grzybni w płynnym podłożu.</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430921</td><td>Do przechowywania i przygotowywania substratów i inokulum.</td></tr><tr><td>Bufor octanowy, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320866</td><td>Do ekstrakcji chitynazy.</td></tr><tr><td>Filtry Centricon</td><td>Milipory</td><td>UFC905024</td><td>Do dalszego oczyszczania enzymów.</td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Służy do liczenia zarodników pod mikroskopem.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td>Do filtrowania ekstraktu enzymatycznego.</td></tr><tr><td>Wilgotnościomierz</td><td>Todomicro powiedział:</td><td>-</td><td>Do pomiaru wilgotności względnej podłoża.</td></tr><tr><td>Induktor (np. chityna handlowa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał C9752</td><td>Służy do zwiększenia produkcji enzymów podczas fermentacji.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P5379 TGL</td><td>Do ekstrakcji amylazy.</td></tr><tr><td>Agar ziemniaczano-dekstrozowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P2182</td><td>Pożywka hodowlana do uprawy grzybni.</td></tr><tr><td>Rosół ziemniaczany z dekstrozą</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P6685 powiedział:</td><td>Płynna pożywka hodowlana do uprawy grzybni.</td></tr><tr><td>Mieszalnik obrotowy</td><td>Thermo-Fisher Naukowy</td><td>88-861-051</td><td>Aby utrzymać substrat w ruchu podczas fermentacji.</td></tr><tr><td>Składniki roztworu soli (np. KH2PO4, Na2SO4, KCl itp.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Wielokrotny</td><td>Aby przygotować sterylny roztwór soli, zobacz szczegółowy przepis w protokole.</td></tr><tr><td>Otręby pszenne</td><td>Rynek komercyjny&nbsp;</td><td>-</td><td>Substrat do fermentacji w stanie stałym.</td></tr></tbody></table>

projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Design of Solid-State Fermentation Systems for Polymer Hydrolytic Extracellular Enzyme Production by Filamentous Fungi

Fermentacja w stanie stałym (SSF) to proces biokonwersji, w którym wykorzystuje się stały substrat, który nie rozpuszcza się w środowisku wodnym. Mikroorganizmy rosną na powierzchni podłoża i wnikają w jego stałą matrycę, aby wydobyć składniki odżywcze niezbędne do ich rozwoju. SSF charakteryzuje się minimalną ilością wolnej wody, przy wilgotności podłoża utrzymywanej powyżej 70% i składa się z trzech połączonych ze sobą faz - gazowej, ciekłej i stałej. Protokół ten opisuje wykorzystanie otrębów pszennych, agroprzemysłowego produktu ubocznego, jako podstawowego substratu do produkcji enzymów w systemie rotacyjnym. Substrat jest uzupełniany induktorem, takim jak chityna, chitozan, skrobia lub celuloza, w celu pobudzenia syntezy białek hydrolitycznych. System jest wysoce elastyczny, co pozwala na stosowanie różnych form grzybów, w tym grzybni, zarodników lub granulek. W opisanej metodologii induktor i substrat są mieszane w stosunku 1:100 (w/w), sterylizowane w autoklawie i dostosowywane do pożądanego poziomu wilgotności sterylną wodą. Następnie dodaje się inokulum grzybów, a system obrotowy działa z prędkością 10 obr./min, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie i natlenienie. System jest inkubowany przez 6-8 dni w optymalnych warunkach wzrostu dla grzybów mezofilnych lub ciepłolubnych/termotolerancyjnych, co zwiększa jego wszechstronność. Po inkubacji enzym jest łatwo ekstrahowany przy użyciu odpowiedniego zimnego buforu (np. octanu, cytrynianu lub fosforanu), w zależności od rodzaju enzymu. Ekstrakt klaruje się przez odwirowanie i filtrację w celu uzyskania bezkomórkowego supernatantu. Enzym może być następnie dalej zagęszczony lub oczyszczony w zależności od potrzeb. Wyniki wykazały 4-6-krotny wzrost aktywności enzymu w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF), co podkreśla skuteczność systemu. Jego zdolność adaptacji do różnych substratów, induktorów i gatunków grzybów sprawia, że jest cennym narzędziem do różnych zastosowań biotechnologicznych.

Rycina 1A przedstawia schematyczną reprezentację mieszadła rotacyjnego użytego w tym systemie, które posiada pojemność dla sześciu probówek stożkowych o objętości 50 mL. Rycina 2B ilustruje zmiany zachodzące w otrębach pszennych podczas kondycjonowania przed rozpoczęciem procesu fermentacji w stanie stałym. Jak widać, nie zaobserwowano istotnych zmian strukturalnych.
Rycina 2 przedstawia nasycenie otrąb p...

Protokół ten wykorzystuje otręby pszenne w obrotowym systemie fermentacji w stanie stałym w celu zwiększenia produkcji enzymów. Podłoże, uzupełnione o induktory, takie jak chityna, wspomaga wzrost grzybów w kontrolowanych warunkach. Wyniki pokazują, że wydajność enzymów jest 4-6 razy wyższa w porównaniu z fermentacją zanurzeniową, co pokazuje zdolność adaptacyjną i skuteczność metody w różnych zastosowaniach biotechnologicznych.

Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Solid-state fermentation (SSF) is a bioconversion process that utilizes a solid substrate that does not dissolve in an aqueous medium. Microorganisms grow ...

Projektujemy wszechstronne systemy fermentacji w stanie stałym, babki lancetowatej, produkcji enzymów przez grzyby. Badanie, w jaki sposób różne induktory, typy inokularne i systemy obrotowe poprawiają skalowalność i żel.Zwiększenie skali obrotowych systemów fermentacji w stanie stałym przy jednoczesnym utrzymaniu jednorodnych warunków, transferu tlenu i stałej wydajności enzymów pozostaje kluczowym wyzwaniem eksperymentalnym.Wykazaliśmy, że obrotowe systemy fermentacji w stanie stałym dają od czterech do sześciu razy wyższą wydajność przy tej samej wydajności niż fermentacja zanurzeniowa, co pokazuje ich wszechstronność i skalowalność dla wielu enzymów.Nasz protokół integruje mieszanie rotacyjne, różne typy protokołów i różnorodność specyficznych induktorów, zapewniając wysokiej klasy żele enzymatyczne, jednorodny wzrost i możliwość zastosowania w wielu systemach enzymatycznych.Skupimy się na zwiększeniu skali rotacyjnego systemu fermentacji w stanie stałym, aby zbadać ich zastosowanie do produkcji nowych enzymów w sektorach żywności, bioenergii i środowiska.[Narrator] Na początek umyj otręby pszenne trzy razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości materii organicznej, zanieczyszczenia i kurz. Umyte otręby pszenne rozłóż na aluminiowej blasze i susz w piekarniku nastawionym na 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby przygotować zawiesinę zarodników, przenieś tarczę ślimaka o średnicy pięciu milimetrów nasączoną grzybnią na płytkę ślimaka ze świeżej dekstrozy ziemniaczanej. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni lub do momentu, gdy grzybnia nasyci podłoże. Następnie dodaj pięć mililitrów sterylnej wody destylowanej do płytki i za pomocą sterylnej pętli oderwij zarodniki od powierzchni. Teraz przygotuj rozcieńczenie zawiesiny zarodników w proporcji od 1 do 100, używając sterylnej wody destylowanej. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny do komory Neubauera i policzyć zarodniki za pomocą mikroskopu. W przypadku hodowli płynnej użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść nasyconą grzybnią tarczę ślimaka na płytkę ślimaka ze świeżej dekstrozy ziemniaczanej. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż podłoże będzie w pełni nasycone. Przygotować 25 mililitrów bulionu z dekstrozy ziemniaczanej w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mililitrów i autoklawować kolbę w celu sterylizacji pożywki. Następnie przenieś pięciomilimetrowy krążek grzybni z nasyconej płytki PDA do sterylnego bulionu. Inkubować kolbę na wytrząsarce z prędkością 125 obr./min przez 24 do 48 godzin, dostosowując czas w zależności od szczepu grzyba. Zebrać dwa mililitry bulionu hodowlanego do przygotowania inokulum i kolejne dwa mililitry do oznaczenia suchej masy. W celu bezpośredniego zaszczepienia krążków grzybni, umieścić nasycony grzybnią krążek ślimakowy na świeżej płytce ślimaka z dekstrozą ziemniaczaną i inkubować ją w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż pożywka będzie w pełni nasycona. Przygotuj probówkę z substratem z pięcioma gramami otrębów pszennych, 0,5 grama induktora i 5,5 mililitra wody i autoklawuj probówkę w temperaturze 15 funtów na cal kwadratowy przez 15 minut. Po schłodzeniu włóż sondę elektrody bezpośrednio do reaktora na różnych głębokościach, aby zmierzyć wilgotność względną za pomocą higrometru opartego na elektrodach. Zaszczep substrat jednym mililitrem zawiesiny zarodników, zawierającej 10 do mocy sześciu do 10 do mocy siedmiu zarodników na mililitr. Wiruj rurki z maksymalną prędkością przez pięć minut w jednominutowych cyklach, aby uniknąć zbrylania się podłoża. Następnie umieść rurki w mieszalniku obrotowym z osią poziomą. Mieszalnik obrotowy należy inkubować w inkubatorze ustawionym na optymalną temperaturę wzrostu mikroorganizmu. W celu ekstrakcji enzymatycznej ponownie zawiesić substrat w 20 mililitrach wstępnie schłodzonego buforu po pożądanym okresie fermentacji. Wiruj rurki w cyklach trwających jedną minutę z maksymalną prędkością, a następnie jedną minutę na lodzie. Przefiltrować zawiesinę za pomocą filtrów papierowych i nacisnąć, aby mechanicznie usunąć supernatant. Na koniec odwirować supernatant o sile 3000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu sklarowania cieczy. Po sześciu dniach fermentacji w stanie stałym, substrat wykazywał widoczną kolonizację grzybów z włóknistą siecią grzybni pokrywającą powierzchnię. Tworzenie glukozaminy poprzez hydrolizę chitozanu było znacznie wyższe w Trichoderma harzianum podczas fermentacji w stanie stałym, co wskazuje, że aktywność chitynazy w tym przypadku była znacznie wyższa niż w fermentacji zanurzeniowej. Podobnie, aktywność amylazy przez aspergillus lentulus była znacznie zwiększona w fermentacji w stanie stałym w porównaniu z fermentacją zanurzoną.

design-solid-state-fermentation-systems-for-polymer-hydrolytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Funkcjonalne zachowanie komórek w hodowli można poprawić poprzez hodowlę w bardziej podobnych do in vivo 3-wymiarowych środowiskach hodowli16-21. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i działanie systemu bioreaktora z pustymi włóknami do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo.

Bioreaktory z pustych włókien do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo

Techniki adaptacyjnej ewolucji i izolacji są opisane i zademonstrowane, aby uzyskać pochodne szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie szybko zużywać mieszaninę cukrów heksozowych i pentozowych w enzymatycznych scukrzanych niedetoksykowanych hydrolizatach i gromadzić ponad 40 g/L etanolu.

Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

System ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE) z membranami kapilarnymi został opracowany do ciągłego i selektywnego wydobywania średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych (MCFA) z bulionu fermentacyjnego. System LLE osiąga wysoką specyficzność MCFA z bulionów zawierających krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe i alkohole. Ponadto MCFA są skoncentrowane w roztworze do usuwania powłok, aby ułatwić odzyskiwanie produktu.

Ciągła ekstrakcja ciecz-ciecz średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych z bulionu fermentacyjnego przy użyciu membran z pustych włókien

Protokół ten przedstawia skalowalną metodę przekształcania odpadów spożywczych w biodegradowalne biotworzywa polihydroksyalkanianowe (PHA). Wykorzystuje zatrzymaną fermentację beztlenową do wstępnej obróbki odpadów spożywczych, halofilową fermentację mikrobiologiczną do biosyntezy PHA oraz wolny od chemikaliów proces dalszy do odzyskiwania PHA.

Skalowalne podejście krok po kroku do zrównoważonej produkcji bioplastiku z odpadów spożywczych

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Elektrody jonoselektywne (ASSISE) w całości w stanie stałym, zbudowane z przetwornika z polimeru przewodzącego (CP), zapewniają kilka miesięcy funkcjonalnego życia w płynnych mediach. W tym miejscu opisujemy proces produkcji i kalibracji ASSISE w formacie lab-on-a-chip. Wykazano, że ASSISE zachował profil nachylenia zbliżony do nernstiańskiego po długotrwałym przechowywaniu w złożonych pożywkach biologicznych.

Biochip z wieloma analitami (MAB) oparty na elektrodach jonoselektywnych w stanie stałym (ASSISE) do badań fizjologicznych

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Poznaj metodę fermentacji w stanie stałym do produkcji enzymów hydrolitycznych z wykorzystaniem otrąb pszennych i grzybów strzępkowych. To podejście zwiększa wydajność enzymów cztero- do sześciokrotnie w porównaniu z fermentacją zanurzeniową.

Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe (Wideo) | JoVE Journal

Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Przeglądaj więcej filmów