Name: Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: Poznaj metodę Design of Experiments do modelowania przejściowej ekspresji białek w liściach tytoniu. Technika ta pozwala zidentyfikować kluczowe parametry wpływające na akumulację białek i optymalizować produkcję przeciwciał monoklonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Thomasowi Rademacherowi za dostarczenie wektora ekspresji roślin pPAM oraz Ibrahimowi Al Amedi za uprawę roślin tytoniu użytych w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować dr Richardowi M. Twymanowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach zaawansowanego grantu "Future-Pharma", numer wniosku 269110 oraz Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fundację Fraunhofera Przyszłości).

<ol><li>Fischer, R., Emans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+farming+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+research%22%5BJournal%5D)">Molecular farming of pharmaceutical proteins.</a> Transgenic research. 9, 277-299 (2000).</li>
<li>Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosafety+of+molecular+farming+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22AgBiotechNet%22%5BJournal%5D)">The biosafety of molecular farming in plants.</a> AgBiotechNet. 5, 9 (2003).</li>
<li>Shoji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant-based+system+for+rapid+production+of+influenza+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Resp%22%5BJournal%5D)">A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens.</a> Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+Its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Berg, R. H., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+applications+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein applications in plants.</a> Method Cell Biol. 85, 153 (2008).</li>
<li>Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+is+not+alone%3A+gene+transfer+to+plants+by+viruses+and+other+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria.</a> Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).</li>
<li>Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transient+Agrobacterium-mediated+gene+expression+system+in+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana.</a> Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+heterogeneous+biomass%3A+Overcoming+the+hurdles+in+model+building%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building.</a> Bioengineered. 4, (2013).</li>
<li>Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP+issues+for+recombinant+plant-derived+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins.</a> Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).</li>
<li>Daniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-at-a-time+plans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">One-at-a-time plans.</a> Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Factor-at-a-Time+versus+Designed+Experiments+The+American+Statistician%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician.</a> 53, 6 (1999).</li>
<li>Anderson, M. J., Kraber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keys+to+successful+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ASQ+-+The+global+voice+of+quality%22%5BJournal%5D)">Keys to successful designed experiments.</a> ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).</li>
<li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontgomery%2C+DC+%22Design+and+Analysis+of+Experiments%22">Design and Analysis of Experiments</a>. , John Wiley & Sons Inc. (2007).</li>
<li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+RH+%22Response+Surface+Methodology%3A+Process+and+Product+Optimization+Using+Designed+Experiments%22">Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments</a>. , Wiley. (2009).</li>
<li>Piepel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programs+for+generating+extreme+vertices+and+centroids+of+linearly+constrained+experimental+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Qual+Technol%22%5BJournal%5D)">Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions.</a> J Qual Technol. 20, 15 (1988).</li>
<li>FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).</li>
<li>Shivhare, M., McCreath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Considerations+for+DoE+Implementation+in+Quality+By+Design%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design.</a> BioProcess International. 8, 9 (2010).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+%28Nicotiana+tabacum+L.%29+can+optimize+process+time%2C+yield%2C+and+downstream+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , Productivity Inc. (2000).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22Response+Surface+Methods+Simplified%22">Response Surface Methods Simplified</a>. , Productivity Press. (2005).</li>
<li>De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+correct+intervals+for+prediction%3A+A+tutorial+on+tolerance+intervals+for+ordinary+least-squares+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometr+Intell+Lab%22%5BJournal%5D)">Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression.</a> Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).</li>
<li> Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li> PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li>Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transformation+of+Escherichia-Coli+with+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+protocols+for+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation protocols for Agrobacterium.</a> Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).</li>
<li>Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+immobilization+of+an+antibody+fragment+to+a+carboxymethylated+dextran-linked+biosensor+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface.</a> J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).</li>
<li>Newcombe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+biosensor+assay+to+quantify+polyclonal+IgG+in+ovine+serum+used+for+the+production+of+biotherapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments.</a> Process Biochem. 41, 842-847 (2006).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+Variable+Selection+in+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 41, 311-313 (1987).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Property+of+Well-Formulated+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 44, 26-30 (1990).</li>
<li>Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cauliflower+mosaic+virus+35S+and+nopaline+synthase+promoters+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants.</a> Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).</li>
<li>Ma, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Assembly+of+Secretory+Antibodies+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants.</a> Science. 268, 716-719 (1995).</li>
<li>Wycoff, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+antibodies+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA antibodies from plants.</a> Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).</li>
</ol>

Opłata za publikację została częściowo ufundowana przez firmy Statease, Inc. (USA) i Statcon (Niemcy), które nie były zaangażowane w przygotowanie manuskryptu ani nie były odpowiedzialne za żadną z jego treści.

Każdy eksperyment wymaga starannego planowania, ponieważ zasoby są często rzadkie i drogie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku strategii DoE, ponieważ błędy w fazie planowania (np . wybór modelu podstawowego, który nie obejmuje wszystkich interakcji między istotnymi czynnikami) mogą znacznie zmniejszyć moc predykcyjną powstałych modeli, a tym samym zdewaluować cały eksperyment. Jednak tych błędów można łatwo uniknąć, postępując zgodnie z podstawowymi procedurami.
Zagadnienia do ro...

Produkcja białek biofarmaceutycznych w roślinach jest korzystna, ponieważ rośliny są tanie w uprawie, platformę można skalować poprzez zwiększenie liczby roślin, a patogeny ludzkie nie są w stanie w nich replikować 1,2. Strategie ekspresji przejściowej oparte na przykład na infiltracji liści za pomocą Agrobacterium tumefaciens zapewniają dodatkowe korzyści, ponieważ czas między dostarczeniem DNA a otrzymaniem oczyszczonego produktu skraca się z lat do mniej niż 2 miesięcy 3. Ekspresja przejściowa jest również stosowana w analizach funkcjonalnych, np. w celu testowania zdolności genów do komplementacji mutantów z utratą funkcji lub badania oddziaływań białkowych 4-6. Jednak poziomy ekspresji przejściowej wykazują tendencję do większej zmienności między partiami niż poziomy ekspresji w roślinach transgenicznych 7-9. Zmniejsza to prawdopodobieństwo, że procesy wytwarzania biofarmaceutyków oparte na ekspresji przejściowej zostaną zatwierdzone w ramach dobrej praktyki wytwarzania (GMP), ponieważ powtarzalność jest krytycznym atrybutem jakości i podlega ocenie ryzyka 10. Taka zmienność może również maskować oddziaływania, które badacze zamierzają przeanalizować. W związku z tym podjęliśmy próbę zidentyfikowania głównych czynników wpływających na poziomy ekspresji przejściowej w roślinach oraz zbudowania wysokiej jakości ilościowego modelu predykcyjnego.
Podejście polegające na zmianie jednego czynnika naraz (OFAT) jest często stosowane w celu określenia wpływu (efektu) określonych parametrów (czynników) na wynik (odpowiedź) eksperymentu 11. Jest ono jednak nieoptymalne, ponieważ poszczególne testy (próby) w ramach badania (eksperymentu) będą rozmieszczone liniowo w potencjalnym obszarze obejmowanym przez testowane czynniki (przestrzeń projektowa). Pokrycie przestrzeni projektowej, a co za tym idzie stopień informacji uzyskanych z eksperymentu, jest niskie, co przedstawiono na Ryc. 1A 12. Ponadto zależności między różnymi czynnikami (interakcje czynników) mogą pozostać niewykryte, co prowadzi do powstania niedoskonałych modeli i/lub przewidywania fałszywych optimów, jak pokazano na Ryc. 1B 13.
Opisane powyżej wady można wyeliminować, stosując podejście oparte na planowaniu eksperymentów (DoE), w którym serie doświadczalne są rozłożone bardziej równomiernie w przestrzeni projektowej, co oznacza, że między dwiema seriami zmienia się więcej niż jeden czynnik 14. Istnieją wyspecjalizowane schematy dla mieszanin, przesiewania czynników (planowanie czynnikowe) oraz ilościowego określania wpływu czynników na odpowiedzi (metody powierzchni odpowiedzi, RSM) 15. Co więcej, RSM mogą być realizowane jako plany centralne kompozytowe, ale można je również skutecznie osiągnąć za pomocą specjalistycznego oprogramowania, które stosuje różne kryteria wyboru serii. Na przykład tzw. kryterium D-optymalności wybiera serie w taki sposób, aby zminimalizować błąd współczynników wynikającego modelu, podczas gdy kryterium IV-optymalności wybiera serie, które zapewniają najniższą wariancję prognozy w całej przestrzeni projektowej 15,16. Opisana tutaj metoda RSM pozwala na precyzyjne ilościowe określenie przejściowej ekspresji białek w roślinach, ale można ją łatwo przenieść do dowolnego systemu obejmującego kilka (~5-8) czynników numerycznych (np. temperatura, czas, stężenie) i kilka (~2-4) czynników kategorycznych (np. promotor, kolor), w których opis mechanistyczny jest niedostępny lub zbyt złożony do zamodelowania.
Podejście DoE wywodzi się z nauk rolniczych, ale rozprzestrzeniło się na inne dziedziny, ponieważ można je zastosować w każdej sytuacji, w której pożądane jest zmniejszenie liczby prób niezbędnych do uzyskania wiarygodnych danych i wygenerowania modeli opisowych dla złożonych procesów. Doprowadziło to z kolei do włączenia DoE do dokumentu „Guidance for Industry, Q8(R2) Pharmaceutical Development” opublikowanego przez Międzynarodową Konferencję ds. Harmonizacji Wymogów Technicznych dotyczących Rejestracji Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ICH) 17. DoE jest obecnie szeroko stosowane w badaniach naukowych i przemyśle 18. Należy jednak zachować ostrożność podczas planowania i przeprowadzania eksperymentu, ponieważ wybór niewłaściwego stopnia wielomianu dla modelu regresji liniowej wielokrotnej (modelu bazowego) może wymusić przeprowadzenie dodatkowych prób w celu prawidłowego zamodelowania wszystkich efektów czynników. Co więcej, uszkodzone lub brakujące dane prowadzą do powstania błędnych modeli i wadliwych przewidywań, a nawet mogą uniemożliwić jakąkolwiek próbę budowy modelu, co opisano w sekcjach protokołu i dyskusji 18. W sekcji protokołu przedstawimy wstępnie najważniejsze kroki planowania eksperymentu opartego na RSM, a następnie wyjaśnimy projektowanie z wykorzystaniem oprogramowania DoE DesignExpert v8.1. Podobne projekty można jednak stworzyć za pomocą innego oprogramowania, w tym JMP, Modde oraz STATISTICA. Procedurom eksperymentalnym towarzyszą instrukcje dotyczące analizy i oceny danych.
<img alt="Diagram PCA i powierzchni odpowiedzi, czynniki A, B, C; analiza wielowymiarowa, model statystyczny." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Porównanie metod OFAT i DoE. A. Sekwencyjna zmiana jednego czynnika na raz (OFAT) w eksperymencie (czarne, czerwone i niebieskie okręgi) zapewnia niskie pokrycie przestrzeni projektowej (obszary kreskowane). W przeciwieństwie do tego, jednoczesna zmiana więcej niż jednego czynnika z wykorzystaniem strategii planowania eksperymentów (DoE) (zielone okręgi) zwiększa pokrycie, a tym samym precyzję wynikających z niej modeli. B. Obciążone pokrycie przestrzeni projektowej oznacza, że eksperymenty OFAT (czarne okręgi) mogą nie zidentyfikować optymalnych obszarów operacyjnych (czerwone) i mogą przewidzieć rozwiązania suboptymalne (duży czarny okrąg), podczas gdy strategie DoE (czarne gwiazdki) z większym prawdopodobieństwem identyfikują preferowane warunki (duża czarna gwiazdka).

<table><tbody><tr><td>Ekspert ds. projektowania(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>Oprogramowanie n.a.DoE</td><td></td></tr> <tr><td>Trypton</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Escherichia coli K12 DH5a</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td>Mikroorganizm</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>Wektor klonowania/ekspresji; &nbsp;</td></tr><tr><td>Plazmid NucleoSpin&nbsp;</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>Zestaw do izolacji plazmidowego DNA</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel i PCR Clean-up</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>Zestaw do oczyszczania plazmidowego DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.Spektrofotometr</td><td></td></tr> <tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193L</td><td>Ograniczenieendonukleaza</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Nowa Anglia Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>Ograniczenieendonukleaza</td></tr><tr><td>AscI</td><td>Nowa Anglia Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td>Ograniczenieendonukleaza</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B7004S</td><td>Restrykcyjny bufor endonukleazy</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Tetraboran disodowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>Wskaźnik koloru</td></tr><tr><td>Czylenu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>Wskaźnik koloru</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>Komora do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens szczep GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>Mikroorganizm</td></tr><tr><td>Elektroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>Ekstrakt z wołowiny</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6344.2</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T832.3</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk FWD podkład</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCT</td> <td>CAG GAA GAG CAA TAC</td></tr><tr><td>REV starter</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCA</td> <td>AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 Termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>RNAfold webserver</td><td>Uniwersytet Wiedeński</td><td>n.a.Software</td><td></td></tr> <tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Nawóz</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm</td><td>Grodan</td><td>n.a.Rockwool</td> <td>block</td></tr><tr><td>Szklarnia</td><td>n.a.n.a.Do</td><td></td> <td>uprawy roślin</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Do</td> <td>uprawy roślin</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td>6064204</td><td>Strzykawka</td></tr><tr><td>Sole Murashige i Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Analogon</td></tr> <tr><td>fitohormonu&nbsp; BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>6132 000.008</td><td>Fotometr</td></tr><tr><td>Osram zimna biel 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Źródło światła</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>Wirówka 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Forma -86C Zamrażarka ULT</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Zamrażarka</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.SPR</td><td></td></tr> <tr><td>urządzenie Białko A</td><td>Life Technologies</td><td>10-1006</td><td>Białko wiążące przeciwciało</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Przeciwciało 2G12</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Przeciwciało referencyjne</td></tr></tbody></table>

charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia design of experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Rośliny zapewniają wiele korzyści dla produkcji biofarmaceutyków, w tym niskie koszty, skalowalność i bezpieczeństwo. Ekspresja przejściowa oferuje dodatkową zaletę w postaci krótkich czasów rozwoju i produkcji, ale poziomy ekspresji mogą się znacznie różnić w zależności od partii, co rodzi obawy regulacyjne w kontekście dobrej praktyki wytwarzania. Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów (DoE) w celu określenia wpływu głównych czynników, takich jak elementy regulatorowe w konstrukcie ekspresji, parametry wzrostu i rozwoju roślin oraz warunki inkubacji podczas ekspresji, na zmienność ekspresji między partiami. Przetestowaliśmy rośliny wykazujące ekspresję modelowego przeciwciała monoklonalnego anty-HIV (2G12) i fluorescencyjnego białka markerowego (DsRed). Omawiamy przesłanki wyboru określonych właściwości modelu i identyfikujemy jego potencjalne ograniczenia. Ogólne podejście można łatwo przenieść na inne problemy, ponieważ zasady modelu mają szerokie zastosowanie: wybór parametrów w oparciu o wiedzę, redukcja złożoności poprzez podzielenie początkowego problemu na mniejsze moduły, sterowana programowo konfiguracja optymalnych kombinacji eksperymentów i stopniowe rozszerzanie projektu. W związku z tym metodologia ta jest przydatna nie tylko do charakteryzowania ekspresji białek w roślinach, ale także do badania innych złożonych systemów, które nie mają opisu mechanistycznego. Równania predykcyjne opisujące wzajemne powiązania między parametrami mogą być wykorzystane do ustanowienia modeli mechanistycznych dla innych złożonych systemów.

Model opisowy akumulacji DsRed podczas ekspresji przejściowej z wykorzystaniem różnych promotorów i 5'UTR
Fluorescencja DsRed w ekstraktach z liści została wykorzystana do określenia poziomu ekspresji białka rekombinowanego, a tym samym służyła jako zmienna odpowiedzi w strategii DoE. Minimalna wykrywalna różnica uznana za istotną wynosiła 20 μg/ml, a szacowane odchylenie standardowe układu na podstawie wstępnych eksperymentów wynosiło 8 μg/ml. Czynniki uwzględnione w modelu e...

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie modeli predykcyjnych dla przejściowej ekspresji białek w liściach roślin. Osiąga się to poprzez opracowanie projektu eksperymentalnego w celu zidentyfikowania najważniejszych parametrów ekspresji przejściowej i ilościowego określenia ich wpływu na akumulację białka. W drugim etapie geny są klonowane i przenoszone do agrobakterii, które są następnie wstrzykiwane do liści, co powoduje przejściową ekspresję białka.Następnie próbki liści są analizowane w celu określenia poziomu ekspresji białka. Uzyskano wyniki, które pokazują wzorzec przejściowych poziomów ekspresji białek w liściach w różnym wieku i dla różnych warunków inkubacji w oparciu o projekt oceny modelu eksperymentalnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pojedynczy czynnik na raz, jest to, że interakcje między różnymi parametrami, takimi jak wiek liścia lub ułożenie liścia, mogą być wykrywane i określane ilościowo.Podejście "jeden czynnik na raz", które jest często używane do scharakteryzowania wpływu pewnych czynników na wynik eksperymentu, jest nieoptymalne, ponieważ poszczególne przebiegi podczas eksperymentu będą wyrównane jak perły na sznurku, osiągając w ten sposób niskie pokrycie przestrzeni projektowej. W przeciwieństwie do projektowania eksperymentów w ramach strategii DOE, zmienność więcej niż jednego czynnika na raz zwiększa pokrycie, a tym samym precyzję uzyskanych modeli. Co więcej, tendencyjne pokrycie przestrzeni projektowej w jednym czynniku na raz.Eksperymenty mogą również nie być w stanie zidentyfikować optymalnych regionów operacyjnych i przewidzieć nieoptymalnych rozwiązań, podczas gdy strategie DOE z większym prawdopodobieństwem określą preferowane warunki. Ten schemat blokowy ilustruje proces planowania strategii DOE. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie odpowiednich czynników i odpowiedzi, które należy uwzględnić w projekcie.W tej demonstracji poziomy ekspresji modelowego przeciwciała monoklonalnego anty HIV dwóch G 12 i markera fluorescencyjnego, białka DS red zostaną zmierzone na podstawie poprzednich eksperymentów. Minimalna wykrywalna różnica uznawana za istotną wynosi 10 mikrogramów na mililitr dla dwóch G 12 i 20 mikrogramów na mililitr dla DS red. Ponadto przybliżone wartości szacowanego odchylenia standardowego systemu dla dwóch G 12 i DS red wynoszą odpowiednio cztery i osiem mikrogramów na mililitr.Pozostałe kroki planowania tej strategii DOE nie będą tutaj omawiane, ale szczegóły można znaleźć w dołączonym manuskrypcie. Dwa G 12 i DS red będą przejściowo wyrażane w roślinach tytoniu. Aby rozpocząć procedurę uprawy roślin, przygotuj bloki skalne o wymiarach 10 na 10 na osiem centymetrów, obficie je przepłukując wodą dejonizowaną w celu usunięcia pozostałości chemikaliów.Następnie zrównoważ bloki ze świeżo przygotowanym roztworem roślin tytoniu z nasion nawozu, umieszczając od jednego do dwóch nasion tytoniu na każdym bloku ściany skalnej, a następnie krótko spłukując nawozem. Uważaj, aby nie zmyć nasion, kiełkować i uprawiać rośliny tytoniu przez 42 dni w szklarni w odpowiednich warunkach. Przygotuj AUM FASS, hodując kulturę do OD 600 nanometrów 5.0.Rozcieńczyć kulturę wodą i dwukrotnym podłożem infiltracyjnym, aby dopasować do OD 600 nanometrów wymaganych do wstrzyknięcia przed wstrzyknięciem. Potwierdź OD 600 nanometrów atum zawiesiny fasion, aby przygotować liście do wstrzyknięcia. Delikatnie podrapać naskórek w miejscu wstrzyknięcia końcówką pipety, aby ułatwić napływ roztworu AUM Fasion.Unikaj przy tym pęknięcia blaszki liściowej. Trzymać strzykawkę zawierającą zawieszenie fazji AUM prostopadle do blaszki liściowej, dotykając lufy polem międzyżebrowym, które ma być leczone, delikatnie popchnąć wylot na dolną stronę liścia. W tym samym czasie delikatnie dociśnij górną stronę liścia, aby zapobiec przesuwaniu się lub pękaniu blaszki liściowej.Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki. Roztwór mody AUM dostanie się do przestrzeni międzykomórkowych w blaszce liściowej, na co wskazują obszary poddane zabiegowi, które wydają się ciemniejsze, zielone i wilgotne. Podczas wstrzykiwania należy upewnić się, że strzykawka pozostaje prostopadła do liścia.W przeciwnym razie zawiesina bakteryjna może wydostać się pod wysokim ciśnieniem. Powtórz tę procedurę w kilku pozycjach, aż całe pole międzyżebrowe zostanie nacieknięte aum, aum, fass. Następnie kontynuuj z następnym polem międzyżebrowym po wstrzyknięciu, inkubuj rośliny w warunkach określonych przez DOE po zakończeniu okresu inkubacji.Rozpocznij pobieranie próbek. Ustabilizuj liść za pomocą ręcznego ręcznika papierowego i użyj pożyczkobiorcy korkowego, aby usunąć cztery do pięciu krążków liściowych z traktowanych pól międzyżebrowych w miejscach i czasach wskazanych przez DOE. Nie należy usuwać całego liścia z rośliny podczas pobierania próbek.Określ masę każdej próbki i umieść ją w 1,5-mililitrowej plastikowej probówce reakcyjnej oznaczonej nazwą próbki i masą. Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza lub ujemnej 80 stopni Celsjusza przed oznaczaniem ilościowym białka. Na tym etapie proces może zostać wstrzymany na kilka miesięcy, w zależności od stabilności próbki i temperatury przechowywania w celu ekstrakcji białek z próbek krążków liściowych.Dodać trzy mililitry buforu ekstrakcyjnego na miligram masy próbki i zmielić krążki liściowe w probówce reakcyjnej za pomocą tłuczka elektrycznego, aż nie pozostaną żadne duże fragmenty. Aby uniknąć przegrzania próbki, należy umieścić probówkę na lodzie, gdy probówka jest ciepła po odwirowaniu. Aby usunąć zdyspergowane ciała stałe, przenieś supernatant do czystej 1,5 milimetrowej probówki reakcyjnej.Zmierz czerwoną fluorescencję DS dwa razy po kolei. W 96 dobrze granym czytniku wyposażonym w 530 25 nanometrowych filtrów wzbudzenia i 590 35 nanometrowych filtrów emisyjnych dla każdej próbki. Uśrednić fluorescencję z dwóch odczytów i trzech kontrprób technicznych i odjąć wartość zarejestrowaną dla ślepej próby kontrolnej zawierającej zero mikrogramów na mililitr DS czerwony.Należy również odjąć tę wartość od stroików standardowych rozcieńczeń i użyć tych ślepych skorygowanych wartości do regresji liniowej, co daje krzywą odniesienia. Nachylenie krzywej odniesienia jest następnie wykorzystywane do przeliczenia fluorescencji zmierzonej dla próbek na stężenia czerwieni DS. Procedura oznaczania stężenia dwóch przeciwciał G 12 nie zostanie tutaj przedstawiona, ale jest szczegółowo opisana w dołączonym manuskrypcie.Oprogramowanie Design Expert służy do analizy i oceny danych w węźle analizy. Wybierz odpowiedź, która ma być analizowana, i początkowo wybierz pozycję brak na karcie transformacji. Przejdź do karty podsumowania dopasowania, która zawiera ogólne informacje o czynnikach ważnych dla badanego systemu.Oprogramowanie zasugeruje początkowy model na podstawie jego znaczenia w zakładce modelu. Początkowy model jest wstępnie wybierany na podstawie wyników podsumowania dopasowania. Użyj trybu automatycznego, aby edytować ten model w zakładce Innova.Zbadaj sugerowany model i uwzględnione czynniki, jeśli to konieczne. Ręcznie usuń wszystkie czynniki z wartościami P powyżej wstępnie zdefiniowanego progu lub te, które są mało prawdopodobne na podstawie rozważań mechanistycznych, przełączając się z powrotem do karty modelu, zmieniając wybór na ręczny i eliminując odpowiednie czynniki z modelu. Przejdź do karty diagnostyki, aby potwierdzić jakość modelu i wykryć potencjalne wartości odstające w zestawie danych, które mają silny wpływ na model.Sprawdzając wszystkie zakładki w narzędziu diagnostycznym, dostosuj typ transformacji w zakładce według, jeśli jest to sugerowane przez wykres Coxa i uruchom ponownie procedurę analizy na karcie wykresów modelu. Wizualizuj oceniany model dla ograniczonej liczby czynników liczbowych, takich jak trzy. Reprezentacja powierzchni odpowiedzi jest przydatna do oceny optymalnych charakterystyk.Powierzchnie odpowiedzi ręcznej ilustrują tylko wpływ dwóch czynników na badaną odpowiedź. Wpływ dowolnego dodatkowego czynnika na odpowiedź jest ujawniany poprzez zmianę jego wartości lub poziomu w oknie narzędzia czynników. Alternatywnie, czynniki można przypisać do osi wykresu, klikając je prawym przyciskiem myszy w oknie narzędzia czynników i wybierając żądaną oś zmiennej niezależnej.Manipuluj poziomami czynników i przypisz je do współrzędnych wykresu za pomocą narzędzia czynników. Eksportuj wykresy za pomocą polecenia eksportuj wykres do pliku na karcie plik. Użyj numerycznego węzła podrzędnego w węźle optymalizacji, aby zoptymalizować żądaną odpowiedź numerycznie, w zależności od czynników modelu, do których z kolei można zastosować pewne ograniczenia za pomocą karty kryteriów.Obliczaj i analizuj rozwiązania numeryczne na karcie rozwiązań na podstawie danych wejściowych podanych na karcie kryteriów. Eksportuj te rozwiązania do innego oprogramowania, takiego jak arkusz kalkulacyjny, w celu dalszej analizy, ujawniając ustawienia czynników związane z wysokimi lub niskimi wartościami odpowiedzi. Jest to pomocne, jeśli bada się więcej niż trzy czynniki liczbowe, a reprezentacja 3D jest trudna w tym reprezentatywnym badaniu.Strategia DOE została wykorzystana do zbadania wpływu różnych promotorów i pięciu pierwszych RS na przejściową ekspresję ds. W poniższej tabeli przedstawiono czynniki czerwone zawarte w modelu ekspresji przejściowej oraz badane zakresy. Czynniki zaznaczone pogrubioną czcionką są unikatowe dla tego eksperymentu.Czynniki zaznaczone kursywą odnoszą się do innego eksperymentu, który zostanie opisany później. Wybrano co najmniej trzy poziomy dla wszystkich dyskretnych czynników liczbowych, aby umożliwić obliczenie kwadratowego modelu bazowego. Do wyboru przebiegów DOE wybrano algorytm wyboru optymalnego, aby uzyskać najdokładniejsze oszacowania współczynników modelu regresji.Projekt początkowo zaproponowany przez eksperta projektowego składał się z 90 serii, ale FDS był niewystarczający, aby osiągnąć 1% standardowy błąd przewidywania. Optymalne rozszerzenie projektu do łącznej liczby 210 przebiegów rozwiązało ten problem i zaowocowało FDS na poziomie 100% z bardziej jednolitą dokładnością przewidywania w całej przestrzeni projektowej wskazanej przez płaską krzywą, stężenia czerwieni DS określono dla wszystkich 210 przebiegów, a dane przekształcono logarytmem 10. Współczynniki modelu zostały wybrane przez automatyczny wybór wsteczny z modelu sześciennego o poziomie alfa 0,100.W rezultacie powstał istotny model z nieznacznym brakiem dopasowania i wysokimi wartościami wielu współczynników korelacji. Wartość P wszystkich współczynników modelu była mniejsza niż 0,05, a zatem nie była wymagana dalsza ręczna manipulacja modelem. Model zawierał trzy interakcje czynnikowe wyróżnione pogrubioną czcionką, które nie były częścią początkowej ponownej oceny kwadratowego modelu bazowego wykresu FDS.Wykorzystanie wszystkich czynników zawartych w końcowym modelu predykcyjnym ujawniło, że FDS dla standardowego błędu przewidywania nie zmniejszył się znacząco po uwzględnieniu dodatkowych interakcji trzech czynników. Narzędzia diagnostyczne jakości modelu w ekspertyzie ds. projektowania wskazały, że transformacja danych była przydatna i nie brakowało żadnych czynników w modelu, ponieważ normalny wykres reszt wykazywał zachowanie liniowe i nie zaobserwowano określonego wzorca na wykresie reszt w porównaniu z przewidywanym. W trakcie trwania eksperymentu nie zaobserwowano również trendu, który wskazywałby na ukrytą zmienną zależną od czasu.Zamiast tego przewidywania modelu były bardzo dobrze zgodne z obserwowaną czerwoną fluorescencją Diaza, ponieważ wszystkie punkty leżą blisko przekątnej. W związku z tym założono, że wybrany model jest przydatny do przewidywania przejściowej ekspresji czerwieni DS w liściach tytoniu bez ołowiu pochodzących z różnych kombinacji promotorów pięciu głównych UTR podczas okresu inkubacji po infiltracji trwającego osiem dni, a model sztucznej regresji liniowej bez transformacji danych został również wybrany w celu zilustrowania konsekwencji niewłaściwej selekcji i transformacji czynnika. Jak wyraźnie widać tutaj, normalny wykres reszt odbiega od oczekiwanego zachowania liniowego, a na wykresie reszt w stosunku do przewidywanych występuje wzór w kształcie litery V zamiast losowego rozproszenia.Ponadto wykres reszt w funkcji przebiegu podkreśla dwie skrajne wartości. Podczas gdy przewidywania były słabe zarówno dla małych, jak i wysokich wartości odbiegających od przekątnej, optymalne powierzchnie odpowiedzi modelu dla przejściowej ekspresji czerwieni DS w liściach tytoniu pokazano tutaj. Model przewidywał, że wiek liści był istotnym czynnikiem, przy niższym poziomie ekspresji w starych liściach, na przykład liściu drugim na poletku A i poletku B w porównaniu z młodymi liśćmi, takimi jak liść szósty na poletku C i poletku D. Postęp akumulacji czerwieni DS na liściach nie był liniowy ani wykładniczy, ale podążał za krzywą esową podczas ośmiu dni inkubacji po infiltracji.Pięć głównych kombinacji UTR z promotorem CAMV 35 SS skutkowało silniejszą ekspresją czerwieni DS niż kombinacje z promotorem NOS. Chociaż pięć głównych UTR miało również znaczący wpływ na ekspresję prawej strony DS, jak wykazano w porównaniu między TL i CHS, siła ekspresji zależała od towarzyszącego promotora. Model predykcyjny wykazał również, że niektóre pary kombinacji promotora pięciu pierwszych UTR, takie jak nas CHS i CAMV 35 SS CHS, skutkowały zrównoważonymi poziomami ekspresji różniącymi się o mniej niż 30% w stosunku do określonego stosunku na wszystkich liściach i czasie inkubacji dłuższym niż dwa dni.Taka zrównoważona ekspresja byłaby przydatna do ekspresji białek multimerycznych o określonej stechiometrii. Podejście DOE zostało również wykorzystane do optymalizacji warunków inkubacji i schematów zbioru dla jednoczesnej produkcji dwóch G 12 i DS red w tytoniu. Czynniki wpływające na ekspresję przejściową, które zostały uwzględnione w tym eksperymencie, są kursywą od 600 nanometrów i czasem inkubacji.Stworzono model predykcyjny do pomiaru ekspresji każdego białka w roślinach w różnym wieku. Młode liście zbierano po 40 dniach od wysiewu, stare liście zbierano po 47 dniach od wysiewu. Te cztery modele zostały następnie ocenione i ustalono model konsensusu, który obejmował każdy czynnik uznany za istotny w poszczególnych modelach.Następnie potwierdzono, że model konsensusu był nadal dobrym odzwierciedleniem wszystkich początkowych zestawów danych. Model konsensusu został następnie wykorzystany do określenia optymalnych temperatur inkubacji i bakteryjnego OD 600 nanometrów dla obu białek, aby przewidzieć stężenia białek we wszystkich liściach i pozycjach liści u młodych i starych roślin. Integracja profili stężeń z danymi dotyczącymi biomasy zaowocowała następnie absolutnym uzyskiem białka.Bezwzględne ilości białka zostały następnie skorelowane z powiązanymi kosztami końcowymi, co umożliwiło analizę kosztów i korzyści dla przetwarzania każdego liścia w każdym wieku rośliny. Taką samą ilość czerwieni DS i około 65% dwóch G 12 stwierdzono w młodych roślinach w porównaniu ze starymi, pomimo około 50% niższej średniej biomasy odzwierciedlającej wyższą ekspresję białka swoistego w młodych roślinach. Okazało się, że młode rośliny były korzystne dla przejściowej ekspresji, ponieważ białka osiągały wyższe stężenia w krótszych okresach wzrostu, pomimo niższej ogólnej biomasy w porównaniu ze starymi roślinami.Wreszcie, stwierdzono również, że przetwarzanie wszystkich liści ze starych roślin było droższe niż wyrzucanie liści od jednego do trzech i zwiększanie liczby roślin w partii. W związku z tym modele oparte na DOE nadają się nie tylko do oznaczania końcowego etapu eksperymentu, ale także do łączenia z innymi danymi w celu ułatwienia bardziej złożonych aspektów analizy procesu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować prowadzenie i analizę DOE w celu zbadania przejściowej ekspresji białek w roślinach.

characterization-complex-systems-using-design-experiments-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Charakteryzacja Złożonych Systemów Przy Użyciu Podejścia Z Zastosowaniem Projektowania Eksperymentów: Przejściowa Ekspresja Białka w Tytoniu Jako Przypadek Badawczy

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Poznaj metodę Design of Experiments do modelowania przejściowej ekspresji białek w liściach tytoniu. Technika ta pozwala zidentyfikować kluczowe parametry wpływające na akumulację białek i optymalizować produkcję przeciwciał monoklonalnych.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Przeglądaj więcej filmów