Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie modeli predykcyjnych dla przejściowej ekspresji białek w liściach roślin. Osiąga się to poprzez opracowanie projektu eksperymentalnego w celu zidentyfikowania najważniejszych parametrów ekspresji przejściowej i ilościowego określenia ich wpływu na akumulację białka. W drugim etapie geny są klonowane i przenoszone do agrobakterii, które są następnie wstrzykiwane do liści, co powoduje przejściową ekspresję białka.

Następnie próbki liści są analizowane w celu określenia poziomu ekspresji białka. Uzyskano wyniki, które pokazują wzorzec przejściowych poziomów ekspresji białek w liściach w różnym wieku i dla różnych warunków inkubacji w oparciu o projekt oceny modelu eksperymentalnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pojedynczy czynnik na raz, jest to, że interakcje między różnymi parametrami, takimi jak wiek liścia lub ułożenie liścia, mogą być wykrywane i określane ilościowo.

Podejście "jeden czynnik na raz", które jest często używane do scharakteryzowania wpływu pewnych czynników na wynik eksperymentu, jest nieoptymalne, ponieważ poszczególne przebiegi podczas eksperymentu będą wyrównane jak perły na sznurku, osiągając w ten sposób niskie pokrycie przestrzeni projektowej. W przeciwieństwie do projektowania eksperymentów w ramach strategii DOE, zmienność więcej niż jednego czynnika na raz zwiększa pokrycie, a tym samym precyzję uzyskanych modeli. Co więcej, tendencyjne pokrycie przestrzeni projektowej w jednym czynniku na raz.

Eksperymenty mogą również nie być w stanie zidentyfikować optymalnych regionów operacyjnych i przewidzieć nieoptymalnych rozwiązań, podczas gdy strategie DOE z większym prawdopodobieństwem określą preferowane warunki. Ten schemat blokowy ilustruje proces planowania strategii DOE. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie odpowiednich czynników i odpowiedzi, które należy uwzględnić w projekcie.

W tej demonstracji poziomy ekspresji modelowego przeciwciała monoklonalnego anty HIV dwóch G 12 i markera fluorescencyjnego, białka DS red zostaną zmierzone na podstawie poprzednich eksperymentów. Minimalna wykrywalna różnica uznawana za istotną wynosi 10 mikrogramów na mililitr dla dwóch G 12 i 20 mikrogramów na mililitr dla DS red. Ponadto przybliżone wartości szacowanego odchylenia standardowego systemu dla dwóch G 12 i DS red wynoszą odpowiednio cztery i osiem mikrogramów na mililitr.

Pozostałe kroki planowania tej strategii DOE nie będą tutaj omawiane, ale szczegóły można znaleźć w dołączonym manuskrypcie. Dwa G 12 i DS red będą przejściowo wyrażane w roślinach tytoniu. Aby rozpocząć procedurę uprawy roślin, przygotuj bloki skalne o wymiarach 10 na 10 na osiem centymetrów, obficie je przepłukując wodą dejonizowaną w celu usunięcia pozostałości chemikaliów.

Następnie zrównoważ bloki ze świeżo przygotowanym roztworem roślin tytoniu z nasion nawozu, umieszczając od jednego do dwóch nasion tytoniu na każdym bloku ściany skalnej, a następnie krótko spłukując nawozem. Uważaj, aby nie zmyć nasion, kiełkować i uprawiać rośliny tytoniu przez 42 dni w szklarni w odpowiednich warunkach. Przygotuj AUM FASS, hodując kulturę do OD 600 nanometrów 5.0.

Rozcieńczyć kulturę wodą i dwukrotnym podłożem infiltracyjnym, aby dopasować do OD 600 nanometrów wymaganych do wstrzyknięcia przed wstrzyknięciem. Potwierdź OD 600 nanometrów atum zawiesiny fasion, aby przygotować liście do wstrzyknięcia. Delikatnie podrapać naskórek w miejscu wstrzyknięcia końcówką pipety, aby ułatwić napływ roztworu AUM Fasion.

Unikaj przy tym pęknięcia blaszki liściowej. Trzymać strzykawkę zawierającą zawieszenie fazji AUM prostopadle do blaszki liściowej, dotykając lufy polem międzyżebrowym, które ma być leczone, delikatnie popchnąć wylot na dolną stronę liścia. W tym samym czasie delikatnie dociśnij górną stronę liścia, aby zapobiec przesuwaniu się lub pękaniu blaszki liściowej.

Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki. Roztwór mody AUM dostanie się do przestrzeni międzykomórkowych w blaszce liściowej, na co wskazują obszary poddane zabiegowi, które wydają się ciemniejsze, zielone i wilgotne. Podczas wstrzykiwania należy upewnić się, że strzykawka pozostaje prostopadła do liścia.

W przeciwnym razie zawiesina bakteryjna może wydostać się pod wysokim ciśnieniem. Powtórz tę procedurę w kilku pozycjach, aż całe pole międzyżebrowe zostanie nacieknięte aum, aum, fass. Następnie kontynuuj z następnym polem międzyżebrowym po wstrzyknięciu, inkubuj rośliny w warunkach określonych przez DOE po zakończeniu okresu inkubacji.

Rozpocznij pobieranie próbek. Ustabilizuj liść za pomocą ręcznego ręcznika papierowego i użyj pożyczkobiorcy korkowego, aby usunąć cztery do pięciu krążków liściowych z traktowanych pól międzyżebrowych w miejscach i czasach wskazanych przez DOE. Nie należy usuwać całego liścia z rośliny podczas pobierania próbek.

Określ masę każdej próbki i umieść ją w 1,5-mililitrowej plastikowej probówce reakcyjnej oznaczonej nazwą próbki i masą. Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza lub ujemnej 80 stopni Celsjusza przed oznaczaniem ilościowym białka. Na tym etapie proces może zostać wstrzymany na kilka miesięcy, w zależności od stabilności próbki i temperatury przechowywania w celu ekstrakcji białek z próbek krążków liściowych.

Dodać trzy mililitry buforu ekstrakcyjnego na miligram masy próbki i zmielić krążki liściowe w probówce reakcyjnej za pomocą tłuczka elektrycznego, aż nie pozostaną żadne duże fragmenty. Aby uniknąć przegrzania próbki, należy umieścić probówkę na lodzie, gdy probówka jest ciepła po odwirowaniu. Aby usunąć zdyspergowane ciała stałe, przenieś supernatant do czystej 1,5 milimetrowej probówki reakcyjnej.

Zmierz czerwoną fluorescencję DS dwa razy po kolei. W 96 dobrze granym czytniku wyposażonym w 530 25 nanometrowych filtrów wzbudzenia i 590 35 nanometrowych filtrów emisyjnych dla każdej próbki. Uśrednić fluorescencję z dwóch odczytów i trzech kontrprób technicznych i odjąć wartość zarejestrowaną dla ślepej próby kontrolnej zawierającej zero mikrogramów na mililitr DS czerwony.

Należy również odjąć tę wartość od stroików standardowych rozcieńczeń i użyć tych ślepych skorygowanych wartości do regresji liniowej, co daje krzywą odniesienia. Nachylenie krzywej odniesienia jest następnie wykorzystywane do przeliczenia fluorescencji zmierzonej dla próbek na stężenia czerwieni DS. Procedura oznaczania stężenia dwóch przeciwciał G 12 nie zostanie tutaj przedstawiona, ale jest szczegółowo opisana w dołączonym manuskrypcie.

Oprogramowanie Design Expert służy do analizy i oceny danych w węźle analizy. Wybierz odpowiedź, która ma być analizowana, i początkowo wybierz pozycję brak na karcie transformacji. Przejdź do karty podsumowania dopasowania, która zawiera ogólne informacje o czynnikach ważnych dla badanego systemu.

Oprogramowanie zasugeruje początkowy model na podstawie jego znaczenia w zakładce modelu. Początkowy model jest wstępnie wybierany na podstawie wyników podsumowania dopasowania. Użyj trybu automatycznego, aby edytować ten model w zakładce Innova.

Zbadaj sugerowany model i uwzględnione czynniki, jeśli to konieczne. Ręcznie usuń wszystkie czynniki z wartościami P powyżej wstępnie zdefiniowanego progu lub te, które są mało prawdopodobne na podstawie rozważań mechanistycznych, przełączając się z powrotem do karty modelu, zmieniając wybór na ręczny i eliminując odpowiednie czynniki z modelu. Przejdź do karty diagnostyki, aby potwierdzić jakość modelu i wykryć potencjalne wartości odstające w zestawie danych, które mają silny wpływ na model.

Sprawdzając wszystkie zakładki w narzędziu diagnostycznym, dostosuj typ transformacji w zakładce według, jeśli jest to sugerowane przez wykres Coxa i uruchom ponownie procedurę analizy na karcie wykresów modelu. Wizualizuj oceniany model dla ograniczonej liczby czynników liczbowych, takich jak trzy. Reprezentacja powierzchni odpowiedzi jest przydatna do oceny optymalnych charakterystyk.

Powierzchnie odpowiedzi ręcznej ilustrują tylko wpływ dwóch czynników na badaną odpowiedź. Wpływ dowolnego dodatkowego czynnika na odpowiedź jest ujawniany poprzez zmianę jego wartości lub poziomu w oknie narzędzia czynników. Alternatywnie, czynniki można przypisać do osi wykresu, klikając je prawym przyciskiem myszy w oknie narzędzia czynników i wybierając żądaną oś zmiennej niezależnej.

Manipuluj poziomami czynników i przypisz je do współrzędnych wykresu za pomocą narzędzia czynników. Eksportuj wykresy za pomocą polecenia eksportuj wykres do pliku na karcie plik. Użyj numerycznego węzła podrzędnego w węźle optymalizacji, aby zoptymalizować żądaną odpowiedź numerycznie, w zależności od czynników modelu, do których z kolei można zastosować pewne ograniczenia za pomocą karty kryteriów.

Obliczaj i analizuj rozwiązania numeryczne na karcie rozwiązań na podstawie danych wejściowych podanych na karcie kryteriów. Eksportuj te rozwiązania do innego oprogramowania, takiego jak arkusz kalkulacyjny, w celu dalszej analizy, ujawniając ustawienia czynników związane z wysokimi lub niskimi wartościami odpowiedzi. Jest to pomocne, jeśli bada się więcej niż trzy czynniki liczbowe, a reprezentacja 3D jest trudna w tym reprezentatywnym badaniu.

Strategia DOE została wykorzystana do zbadania wpływu różnych promotorów i pięciu pierwszych RS na przejściową ekspresję ds. W poniższej tabeli przedstawiono czynniki czerwone zawarte w modelu ekspresji przejściowej oraz badane zakresy. Czynniki zaznaczone pogrubioną czcionką są unikatowe dla tego eksperymentu.

Czynniki zaznaczone kursywą odnoszą się do innego eksperymentu, który zostanie opisany później. Wybrano co najmniej trzy poziomy dla wszystkich dyskretnych czynników liczbowych, aby umożliwić obliczenie kwadratowego modelu bazowego. Do wyboru przebiegów DOE wybrano algorytm wyboru optymalnego, aby uzyskać najdokładniejsze oszacowania współczynników modelu regresji.

Projekt początkowo zaproponowany przez eksperta projektowego składał się z 90 serii, ale FDS był niewystarczający, aby osiągnąć 1% standardowy błąd przewidywania. Optymalne rozszerzenie projektu do łącznej liczby 210 przebiegów rozwiązało ten problem i zaowocowało FDS na poziomie 100% z bardziej jednolitą dokładnością przewidywania w całej przestrzeni projektowej wskazanej przez płaską krzywą, stężenia czerwieni DS określono dla wszystkich 210 przebiegów, a dane przekształcono logarytmem 10. Współczynniki modelu zostały wybrane przez automatyczny wybór wsteczny z modelu sześciennego o poziomie alfa 0,100.

W rezultacie powstał istotny model z nieznacznym brakiem dopasowania i wysokimi wartościami wielu współczynników korelacji. Wartość P wszystkich współczynników modelu była mniejsza niż 0,05, a zatem nie była wymagana dalsza ręczna manipulacja modelem. Model zawierał trzy interakcje czynnikowe wyróżnione pogrubioną czcionką, które nie były częścią początkowej ponownej oceny kwadratowego modelu bazowego wykresu FDS.

Wykorzystanie wszystkich czynników zawartych w końcowym modelu predykcyjnym ujawniło, że FDS dla standardowego błędu przewidywania nie zmniejszył się znacząco po uwzględnieniu dodatkowych interakcji trzech czynników. Narzędzia diagnostyczne jakości modelu w ekspertyzie ds. projektowania wskazały, że transformacja danych była przydatna i nie brakowało żadnych czynników w modelu, ponieważ normalny wykres reszt wykazywał zachowanie liniowe i nie zaobserwowano określonego wzorca na wykresie reszt w porównaniu z przewidywanym. W trakcie trwania eksperymentu nie zaobserwowano również trendu, który wskazywałby na ukrytą zmienną zależną od czasu.

Zamiast tego przewidywania modelu były bardzo dobrze zgodne z obserwowaną czerwoną fluorescencją Diaza, ponieważ wszystkie punkty leżą blisko przekątnej. W związku z tym założono, że wybrany model jest przydatny do przewidywania przejściowej ekspresji czerwieni DS w liściach tytoniu bez ołowiu pochodzących z różnych kombinacji promotorów pięciu głównych UTR podczas okresu inkubacji po infiltracji trwającego osiem dni, a model sztucznej regresji liniowej bez transformacji danych został również wybrany w celu zilustrowania konsekwencji niewłaściwej selekcji i transformacji czynnika. Jak wyraźnie widać tutaj, normalny wykres reszt odbiega od oczekiwanego zachowania liniowego, a na wykresie reszt w stosunku do przewidywanych występuje wzór w kształcie litery V zamiast losowego rozproszenia.

Ponadto wykres reszt w funkcji przebiegu podkreśla dwie skrajne wartości. Podczas gdy przewidywania były słabe zarówno dla małych, jak i wysokich wartości odbiegających od przekątnej, optymalne powierzchnie odpowiedzi modelu dla przejściowej ekspresji czerwieni DS w liściach tytoniu pokazano tutaj. Model przewidywał, że wiek liści był istotnym czynnikiem, przy niższym poziomie ekspresji w starych liściach, na przykład liściu drugim na poletku A i poletku B w porównaniu z młodymi liśćmi, takimi jak liść szósty na poletku C i poletku D. Postęp akumulacji czerwieni DS na liściach nie był liniowy ani wykładniczy, ale podążał za krzywą esową podczas ośmiu dni inkubacji po infiltracji.

Pięć głównych kombinacji UTR z promotorem CAMV 35 SS skutkowało silniejszą ekspresją czerwieni DS niż kombinacje z promotorem NOS. Chociaż pięć głównych UTR miało również znaczący wpływ na ekspresję prawej strony DS, jak wykazano w porównaniu między TL i CHS, siła ekspresji zależała od towarzyszącego promotora. Model predykcyjny wykazał również, że niektóre pary kombinacji promotora pięciu pierwszych UTR, takie jak nas CHS i CAMV 35 SS CHS, skutkowały zrównoważonymi poziomami ekspresji różniącymi się o mniej niż 30% w stosunku do określonego stosunku na wszystkich liściach i czasie inkubacji dłuższym niż dwa dni.

Taka zrównoważona ekspresja byłaby przydatna do ekspresji białek multimerycznych o określonej stechiometrii. Podejście DOE zostało również wykorzystane do optymalizacji warunków inkubacji i schematów zbioru dla jednoczesnej produkcji dwóch G 12 i DS red w tytoniu. Czynniki wpływające na ekspresję przejściową, które zostały uwzględnione w tym eksperymencie, są kursywą od 600 nanometrów i czasem inkubacji.

Stworzono model predykcyjny do pomiaru ekspresji każdego białka w roślinach w różnym wieku. Młode liście zbierano po 40 dniach od wysiewu, stare liście zbierano po 47 dniach od wysiewu. Te cztery modele zostały następnie ocenione i ustalono model konsensusu, który obejmował każdy czynnik uznany za istotny w poszczególnych modelach.

Następnie potwierdzono, że model konsensusu był nadal dobrym odzwierciedleniem wszystkich początkowych zestawów danych. Model konsensusu został następnie wykorzystany do określenia optymalnych temperatur inkubacji i bakteryjnego OD 600 nanometrów dla obu białek, aby przewidzieć stężenia białek we wszystkich liściach i pozycjach liści u młodych i starych roślin. Integracja profili stężeń z danymi dotyczącymi biomasy zaowocowała następnie absolutnym uzyskiem białka.

Bezwzględne ilości białka zostały następnie skorelowane z powiązanymi kosztami końcowymi, co umożliwiło analizę kosztów i korzyści dla przetwarzania każdego liścia w każdym wieku rośliny. Taką samą ilość czerwieni DS i około 65% dwóch G 12 stwierdzono w młodych roślinach w porównaniu ze starymi, pomimo około 50% niższej średniej biomasy odzwierciedlającej wyższą ekspresję białka swoistego w młodych roślinach. Okazało się, że młode rośliny były korzystne dla przejściowej ekspresji, ponieważ białka osiągały wyższe stężenia w krótszych okresach wzrostu, pomimo niższej ogólnej biomasy w porównaniu ze starymi roślinami.

Wreszcie, stwierdzono również, że przetwarzanie wszystkich liści ze starych roślin było droższe niż wyrzucanie liści od jednego do trzech i zwiększanie liczby roślin w partii. W związku z tym modele oparte na DOE nadają się nie tylko do oznaczania końcowego etapu eksperymentu, ale także do łączenia z innymi danymi w celu ułatwienia bardziej złożonych aspektów analizy procesu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować prowadzenie i analizę DOE w celu zbadania przejściowej ekspresji białek w roślinach.