Name: Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji mediów hodowlanych mikroorganizmów przy użyciu projektowania eksperymentalnego Kriging i technologii mikrobioreaktorów. To podejście przyspiesza rozwój procesów bioprocesowych i produkcję białek heterologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Działalność naukowa Centrum Naukowego Biogospodarki była wspierana finansowo przez Ministerstwo Innowacji, Nauki i Badań w ramach NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Autorzy dziękują Ministerstwu Innowacji, Nauki i Badań Naukowych Nadrenii Północnej-Westfalii oraz Uniwersytetowi Heinricha Heinego w Düsseldorfie za stypendium dla Larsa Freiera w ramach CLIB-Graduate Cluster Industrial Biotechnology. Dalsze fundusze zostały pozyskane z programu Enabling Spaces "Helmholtz Innovation Labs" Niemieckiego Stowarzyszenia Helmholtza w celu wsparcia "Microbial Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab".

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólny charakter przedstawionego protokołu pozwala na różne adaptacje, np. do badania innych gospodarzy ekspresji drobnoustrojów 9,47,48,49,50,51 lub do optymalizacji innych właściwości białka docelowego, takich jak wzór glikozylacji lub wiązania dwusiarczkowe. Konieczne może być również dostosowanie protokołu do dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Integracja systemu MBR pozwala na zwiększenie przepustowości eksperymentalnej, co pozwala na dużą oszczędność czasu. Jednak przy zastępowaniu w pełni oprzyrządowanych i sterowalnych bioreaktorów systemami MBR, należy wziąć pod uwagę skalowalność wyników 8,37,52,53. Zastosowanie metodologii DOE i modelowania matematycznego pomaga zmaksymalizować zawartość informacyjną danych pomiarowych w odniesieniu do badanego celu54 poprzez efektywne planowanie eksperymentalne i interpretację danych w oparciu o model15.
Modyfikacje metody Oprócz wielofunkcyjnych i rozbudowywalnych zrobotyzowanych systemów obsługi cieczy, takich jak ten zastosowany w tym badaniu, należy wspomnieć, że na rynku dostępnych jest kilka mniejszych systemów obsługi cieczy, które są w stanie wykonać to zadanie i można je umieścić wewnątrz stołów roboczych z przepływem laminarnym. Jeśli nie jest dostępny automatyczny system pipetowania, różne składy pożywek zgodnie z planem DOE można również uzyskać za pomocą pipetowania ręcznego za pomocą pipet jedno- i/lub wielokanałowych. Ponieważ ręczne przygotowanie jest bardziej podatne na błędy i będzie wymagało bardzo skoncentrowanej pracy przez dość długi czas, zaleca się przygotowanie mniejszej liczby różnych kompozycji mediów.
W zależności od możliwości zastosowanego systemu MBR, odpowiedni protokół uprawy będzie się różnił. Na przykład, jeśli nie jest dostępny pomiar powstawania biomasy online, może to być wystarczające do zmierzenia stężenia biomasy po zakończeniu eksperymentu wzrostu. W połączeniu z monitorowaniem online pH i tlenu rozpuszczonego, które jest realizowane w kilku systemach MBR, można bezpiecznie określić nasycenie wzrostu. Zasadniczo eksperymenty wzrostowe można przeprowadzać w samych MTP umieszczonych w inkubatorach z wytrząsaniem, bez użycia systemu MBR. W takim przypadku należy zapewnić odpowiednie warunki uprawy: (1) Upraw o ograniczonej zawartości tlenu można uniknąć, stosując MTP o odpowiedniej geometrii, w połączeniu z odpowiednią częstotliwością wytrząsania i średnicą wytrząsania, np. kwadratowe płytki głębinowe 96 lub 24 pracujące odpowiednio z prędkością 1 000 obr./min przy rzucie 3 mm lub przy prędkości 250 obr./min przy wyrzucie 25 mm. Co ważne, im niższe możliwe do osiągnięcia maksymalne prędkości transferu tlenu, tym niższe powinno być stężenie głównego źródła węgla. Jak wspomniano powyżej, w tym badaniu zastosowanie glukozy 10 g/l było odpowiednie, aby zapobiec ograniczeniu tlenu w stosowanych warunkach uprawy; (2) Pobieranie próbek z kultur MTP w celu ilościowego określenia biomasy i produktu powinno być ograniczone do minimum. Za każdym razem, gdy MTP jest usuwany z inkubatora wytrząsającego, transfer tlenu natychmiast się rozpada, co może skutkować niekorzystnymi warunkami uprawy; (3) Zdaniem autorów, stosowanie czytników MTP jako urządzeń do uprawy nie jest zalecane, ponieważ urządzenia te nie zostały opracowane w tym celu. Na przykład mechanika wytrząsania została opracowana z myślą o sporadycznym mieszaniu mikropłytek po dodaniu odczynnika, a zatem często brakuje jej wytrzymałości na długie serie ciągłego wytrząsania trwającego przez kilka dni. Co więcej, w tych czytnikach nie można zrealizować wystarczającego poboru mocy potrzebnej do hodowli mikroorganizmów. Integracja odczytów gęstości optycznej w krótkich odstępach czasu wymaga zatrzymania ruchu wytrząsającego, co skutkuje powtarzającymi się okresami ograniczenia tlenu. Co więcej, parowanie w takich systemach przez długie okresy uprawy zniekształci wyniki. Więcej szczegółów na zaskakująco złożony temat wykorzystania MTP do hodowli mikroorganizmów odsyła czytelnika do cytowanej literatury 22,23,24,25,26 i zawartych w niej odniesień.
Dalsze rozważania Aby przyspieszyć iteracyjne kroki optymalizacji, zaleca się staranny wybór metody analitycznej do oznaczania ilościowego produktu. Szybkie i proste metody powinny być preferowane kosztem precyzji i dokładności, ponieważ iteracyjna strategia projektowania eksperymentalnego toleruje niedokładność eksperymentalną. Jednak ostateczne wyniki muszą zostać zweryfikowane pod kątem wystarczająco precyzyjnych i dokładnych metod oznaczania ilościowego produktu, które mogą być bardziej skomplikowane. Ogólnie rzecz biorąc, staranna ocena i podejmowanie decyzji dotyczących procedur badania wymaga wysiłku na początku badania, ale opłaca się w dłuższej perspektywie, po ustaleniu rutynowych metod.
Zdecydowanie zaleca się zdefiniowanie eksperymentu referencyjnego, który jest porównywany ze wszystkimi eksperymentami podczas optymalizacji. Oznacza to, że zastosowane stężenia składników medium oraz zmierzona wydajność są normalizowane poprzez podzielenie przez wartości odniesienia. W ten sposób każda zastosowana i zmierzona wartość może być interpretowana jako x-krotność wartości odniesienia. Aby uwzględnić różnice między płytkami, na każdej z nich przeprowadza się pięć doświadczeń referencyjnych. Do normalizacji wykorzystuje się średnią wartość zmierzonego wyniku.
Na ogół nie można zagwarantować, że opracowane podłoże jest również optymalne dla innych szczepów. Jednak ulepszona pożywka najprawdopodobniej będzie również odpowiednia do hodowli szczepów ekspresyjnych o niewielkich różnicach genetycznych, np. podczas wytwarzania wariantów enzymów z podstawieniami pojedynczych aminokwasów uzyskanych z badań mutagenezy (chociaż nawet mutacje jednopunktowe zostały opisane jako wpływające na metabolizm komórkowy i ekspresję heterologiczną55,56). W tym przypadku przedstawiony protokół może być pierwszym krokiem, a następnie protokołami do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ekspresji57. Jeżeli protokół jest stosowany do opracowywania pożywki, a następnie zwiększania skali do upraw wsadowych z paszą, zoptymalizowane podłoże powinno zostać zweryfikowane pod kątem odpowiednich warunków bioprocesu, ponieważ kampanie przesiewowe klonów w mikroskali zidentyfikowały różne najlepsze wyniki dla różnych strategii żywienia i podłoży uprawowych52,58. Co więcej, wprowadzony KriKit36 może ogólnie przyczynić się do lepszej całościowej optymalizacji bioprocesów. Dopiero niedawno możliwości narzędzia zostały rozszerzone o obsługę optymalizacji wielocelowej40, co może być ważne dla optymalizacji zarówno procesów poprzedzających, jak i późniejszych59,60.

Nowoczesna technologia rekombinowanych genów umożliwia szerokie zastosowanie enzymów technicznych do różnych zastosowań w przemyśle farmaceutycznym, żywieniu zwierząt, chemii organicznej i przetwórstwie spożywczym1,2,3. Produkcja enzymów technicznych w ilościach hurtowych jest głównym tematem biotechnologii przemysłowej i zoptymalizowanej produkcji białek rekombinowanych, a potrzebna jest zarówno inżynieria szczepów, jak i bioprocesów. Do generowania efektywnie modyfikowanych szczepów produkcyjnych dostępne są różne biblioteki genetyczne, np. dla zrównoważonej ekspresji genów4 lub zwiększonej wydajności wydzielania5.
Corynebacterium glutamicum jest głównym producentem aminokwasów na skalę przemysłową6,7 i stanowi atrakcyjną, niekonwencjonalną ekspresję do produkcji wydzielniczej rekombinowanych białek8,9. Zarówno szlak wydzielniczy ogólny (Sec), jak i translokacja podwójnej argininy (Tat) są obecne w C. glutamicum i zostały z powodzeniem zastosowane do rekombinowanego wydzielania białek10. Bogate doświadczenie w inżynierii bioprocesowej dotyczącej produkcji aminokwasów na skalę przemysłową, a także zdolność do wydzielania białek w ilości g/L11 oraz duża odporność na niejednorodności bioprocesów występujące w uprawach na dużą skalę12,13, sprawiają, że C. glutamicum jest obiecującym organizmem platformowym do produkcji wydzielniczej białek heterologicznych na skalę przemysłową.
Optymalizacja podłoża odżywczego jest znana z poprawy produkcji białek rekombinowanych z systemami mikrobiologicznymi14,15,16,17 i w związku z tym, dostosowanie składu podłoża jest satysfakcjonującym krokiem w rozwoju bioprocesów w odniesieniu do optymalnej produktywności18,19,20,21. Intensywne badania nad zastosowaniem płytek mikromiareczkowych (MTP) do hodowli drobnoustrojów22,23,24 utorowały drogę do opracowania i zaprojektowania MTP do hodowli mikroorganizmów25,26 oraz rozwój systemów mikrobioreaktorów (MBR) opartych na MTP z monitorowaniem online i kontrolą środowiska27,28. MBR umożliwiają znaczne zwiększenie wydajności upraw eksperymentalnych. Poza tym systemy MBR wywodzące się z innych typów bioreaktorów, np. kolumn bąbelkowych lub reaktorów zbiornikowych z mieszadłem, są dostępne do optymalizacji bioprocesów mikrobiologicznych29,30,31,32.
Ogólnie, badania optymalizacyjne korzystają ze zwiększonej przepustowości eksperymentalnej, która staje się jeszcze bardziej potężna w połączeniu z metodologiami DOE, takimi jak ocena interakcji między zmiennymi projektowymi lub redukcja wielowymiarowych przestrzeni wyszukiwania. W związku z tym połączone zastosowanie systemów MBR, automatyzacji laboratorium i DOE okazało się potężną metodą w biotechnologii8,16,33,34,35.
Prezentowany jest protokół do optymalizacji mediów, łączący najnowocześniejszą automatyzację laboratorium, technologię MBR z monitorowaniem procesów online oraz analizę danych / projektowanie eksperymentalne oparte na Krigingu. Metodologia Kriging jest zaimplementowana w MATLAB Toolbox ("KriKit"), który można pobrać i używać bezpłatnie36. Jako przykład zastosowania pokazano maksymalizację produkcji wydzielniczego białka zielonej fluorescencji (GFP) z C. glutamicum poprzez optymalizację składu minimalnej pożywki CgXII. Miano GFP zostało wybrane jako cel optymalizacji, ponieważ można je łatwo określić ilościowo i jest szeroko stosowane jako białko modelowe do badań nad systemami MBR37,38,39.
Przedstawiony framework jest podzielony na cztery kroki, które są zilustrowane na rysunku 1. Kroki są oznaczone ramkami ramek i odpowiadają sekcjom protokołu. Pierwszym krokiem (rys. 1A) jest zdefiniowanie celów projektu i określenie wymaganych metod. Połączenie metodologii DOE, technologii MBR i automatyzacji laboratoryjnej pozwala na zwiększenie przepustowości eksperymentalnej, która wymaga wydajnego przetwarzania danych. Drugi krok (rysunek 1B) ma na celu wykrycie wrażliwych zmiennych projektowych (tj. średnich komponentów) o dużym wpływie na cel optymalizacji. Prowadzi to do zmniejszenia liczby zmiennych projektowych będących przedmiotem zainteresowania. Trzeci krok (rysunek 1C) obejmuje iteracyjną optymalizację w celu bardziej szczegółowego zbadania relacji funkcjonalnej między pozostałymi zmiennymi projektowymi a celem zainteresowania. Korzystając z sukcesywnie rozszerzanego zbioru danych, stosuje się podejście Kriginga do przewidywania wyniku eksperymentu w niemierzonych lokalizacjach. Cykl iteracyjny zatrzymuje się, gdy tylko model Kriginga przewidzi optimum lub plateau z wystarczającą dokładnością. Wyniki są weryfikowane w czwartym kroku (rysunek 1D), rozpoczynając od dalszej analizy wrażliwości wokół zidentyfikowanego optimum. Jeśli początkowo okaże się, że niewrażliwe komponenty są niewrażliwe również w optymalnym regionie, rozsądnie jest założyć, że jest to prawdą podczas iteracyjnej procedury optymalizacji w trzecim kroku. Następnie zaleca się weryfikację wyników optymalizacji poprzez zastosowanie metod ortogonalnych, takich jak test aktywności lub SDS-Page.
Ogólny charakter prezentowanego protokołu pozwala na łatwą adaptację do różnych urządzeń laboratoryjnych, innych gospodarzy ekspresji i wybranych białek docelowych, a także do dalszych zmiennych bioprocesowych, takich jak wartość pH czy temperatura uprawy. Ponadto inne cele optymalizacyjne, takie jak tempo produkcji białka, określony uzysk lub jakość produktu, można wybrać tak, aby pasowały do zakresu innych badań optymalizacyjnych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="rozmiar czcionki: 14px;"> 
Figure 1: Workflow badania optymalizacyjnego. Cztery ramki odpowiadają sekcjom protokołu: "Opracowanie badania i definicja metod" (sekcja 1), "Analiza wrażliwości" (sekcja 2), "Optymalizacja iteracyjna" (sekcja 3) i "Walidacja" (sekcja 4). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Do uprawy w urządzeniu BioLector</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Sterylne uszczelnienie do Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>Swobodnie dostępny, wymagana instalacja MATLAB</td></tr><tr><td>Robot pipetujący Janus</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Obejmuje instalację oprogramowania "WinPrep"</td></tr><tr><td>12-kolumnowa mikropłytka głębinowa</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Pojemnik na średnie roztwory podstawowe</td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki, przezroczyste, F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Do oznaczania białek Bradforda</td></tr> <tr><td>i mikro; przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki, ciało czarne, przezroczyste dno F</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>Do pomiaru fluorescencji w supernatantach bezkomórkowych</td></tr><tr><td>Badania pipet&nbsp; plus pipety wielokanałowe</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Ułatwia ręczną obsługę cieczy dzięki mikropłytkom</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp; Prefabrykaty żelowe</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Do analizy SDS-Page bezkomórkowych supernantantów</td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Przenosi plazmid pEKEx2 z fuzją genu GFP i peptydu sygnałowego PhoD z B.subtilis jako insertu ekspresji. Plazmid zapewnia oporność na kanamycynę. Opisane i opublikowane przez Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash; 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Podstawową działalnością w biotechnologii przemysłowej wykorzystującej fabryki komórek do produkcji mikroorganizmów jest iteracyjny proces inżynierii szczepów i optymalizacji warunków bioprocesowych. Jednym z ważnych aspektów jest ulepszenie podłoża uprawowego, aby zapewnić optymalne środowisko do tworzenia się mikroorganizmów w produkcie będącym przedmiotem zainteresowania. Powszechnie przyjmuje się, że skład pożywki może znacząco wpłynąć na ogólną wydajność bioprocesu. Wiadomo, że optymalizacja pożywek poprawia produkcję białek rekombinowanych z układami mikrobiologicznymi, a zatem jest to satysfakcjonujący krok w rozwoju bioprocesów. Jednak bardzo często standardowe receptury pożywek są zaczerpnięte z literatury, ponieważ indywidualne projektowanie podłoża uprawowego jest żmudnym zadaniem, które wymaga technologii mikrobioreaktorów w celu zapewnienia wystarczającej przepustowości uprawy, szybkiej analizy produktu, a także wsparcia ze strony robotyki laboratoryjnej, aby zapewnić niezawodność na etapach obsługi cieczy. Ponadto zaawansowane metody matematyczne są niezbędne do racjonalnej analizy danych pomiarowych i efektywnego projektowania równoległych eksperymentów, takich jak osiągnięcie optymalnej zawartości informacji.
Ogólny charakter prezentowanego protokołu pozwala na łatwą adaptację do różnych urządzeń laboratoryjnych, innych gospodarzy ekspresji i docelowych białek będących przedmiotem zainteresowania, a także do dalszych parametrów bioprocesu. Co więcej, inne cele optymalizacyjne, takie jak tempo produkcji białka, określony plon lub jakość produktu, można wybrać tak, aby pasowały do zakresu innych badań optymalizacyjnych. Applied Kriging Toolbox (KriKit) jest ogólnym narzędziem do projektowania eksperymentów (DOE), które przyczynia się do poprawy holistycznej optymalizacji bioprocesów. Obsługuje również optymalizację wielozadaniową, co może być ważne w optymalizacji zarówno procesów poprzedzających, jak i następczych.

Wprowadzony protokół został zastosowany w celu maksymalizacji miana wydzielanego GFP. W szczególności jako cel optymalizacyjny wybrano miano GFP po 17 godzinach uprawy. Wykrywanie fluorescencji GFP w trybie online umożliwiło proste określenie ilościowe produktu. Jednak normalizacja sygnału GFP za pomocą danych z uprawy referencyjnej jest niezbędna do zapewnienia odtwarzalności i porównywalności wyników. Wstępna selekcja komponentów mediów została przeprowadzona w sposób racjonalny, jak opisano w punkcie 1. Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale 1: parametry procedur mokrego laboratorium zostały określone dla całego badania, zapewniając spójność i powtarzalność wyników.
Jak opisano w sekcji 2, przeprowadzono wstępne badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania istotnych elementów wykazujących znaczący wpływ na cel optymalizacji dla dalszego, bardziej szczegółowego badania. System MBR oparty na MTP pozwala na równoległe przeprowadzenie 48 eksperymentów. Biorąc pod uwagę maksymalną możliwą liczbę równoległych eksperymentów na jednym MTP (48) oraz całkowitą liczbę składników mediów (11) sprawia, że konstrukcja frakcyjna 2IV11-6 jest odpowiednim wyborem. Ten projekt eksperymentalny składa się z 32 eksperymentów i pozwala na oszacowanie głównego efektu dla każdego z badanych składników pożywki. Pozostałe studnie uprawowe (16) wykorzystano do wielokrotnych powtórzeń doświadczeń z podłożem referencyjnym w celu oceny odtwarzalności i efektów pozycyjnych. Oznacza to, że każdy eksperyment jest przeprowadzany raz (bez powtórzeń), z wyjątkiem eksperymentu referencyjnego (pięć powtórzeń).
Tabela 1 podsumowuje wyniki analizy przesiewowej. W rozważanym zakresie stężeń zróżnicowanie większości składników pożywki nie wykazało zauważalnego wpływu na obiektyw. Składnik NH4+ wykazuje silne negatywne działanie, podczas gdy Ca2+ i Mg2+ wykazują najsilniejszą pozytywną tendencję. WpływMg2+ nie jest znaczący dla obecnego zakresu stężeń, ale może być istotny dla szerszego zakresu stężeń. W związku z tym zdecydowano o pominięciu NH4+ w pożywce i zbadaniu wpływuCa2+ iMg2+ w dalszych eksperymentach.
Sekcja 3 opisuje procedurę iteracyjnej optymalizacji, która jest używana do maksymalizacji sygnału fluorescencji GFP przy jednoczesnej różnicowaniu stężeń Ca2+ i Mg2+. W iteracji 1 przetestowano hipotezę, że NH4+ można pominąć. Zakres stężeń dlaCa2+ iMg2+ przyjęto z analizy przesiewowej. Minimalne stężenie NH4+ ustalono na zero, a maksymalne stężenie przyjęto z eksperymentu przesiewowego. W kolejnych eksperymentach stężenia składników rozprowadzono na siatce 3 x 3 x 3 w określonym zakresie stężeń, w wyniku czego przeprowadzono 27 eksperymentów. Podczas wszystkich upraw włączono pięć powtórzeń podłoża referencyjnego, które posłużyły jako wzorzec wewnętrzny i zapewniły, że nie wystąpią żadne efekty pozycyjne w stosunku do MTP. Dla pozostałych 16 dołków stężenia NH4+, Ca2+ i Mg2+ zostały losowo rozmieszczone w podanych zakresach.
Rysunek 5A przedstawia wyniki pierwszych iteracji. Etykiety osi odnoszą się do stężeń składników stosowanych w oryginalnym podłożu odniesienia, oznaczonych przez x Ref. Niebieskie powierzchnie reprezentują interpolacje Krigingu, które zostały obliczone za pomocą oprogramowania KriKit. Każda powierzchnia jest powiązana ze względnym poziomem stężenia dla NH4+ (ciemnoniebieski: 0 x Ref, w kratkę: 1 x Ref, jasnoniebieski: 2 x Ref). Ta wizualna reprezentacja pokazuje, że korzystne jest pominięcie NH4+. Powierzchnie interpolacji wykazują również pozytywne działanie zarówno Mg2+, jak i Ca2+, ponieważ wszystkie płaszczyzny wznoszą się wraz ze wzrostem stężeń.
Na podstawie wyników iteracji 1 zdecydowano o rozszerzeniu zakresu stężeń Ca2+ i Mg2+ poprzez podwojenie maksymalnych stężeń i przesunięcie okna projektu eksperymentalnego do prawego górnego rogu, zobacz Rysunek 5B. Wewnątrz tego zakresu stężenia zostały rozłożone na siatce 6 x 6. Zapewnia to równomierne rozprowadzenie w całym zakresie stężeń, co prowadzi do optymalnych wyników interpolacji Kriging. Rysunek 5B pokazuje wykres interpolacji Kriginga oparty na połączonych danych zmierzonych w obu iteracjach (czerwone kropki i żółte kwadraty). Zarówno w przypadkuCa2+, jak iMg2+ pozytywny efekt zwiększenia ich stężeń utrzymuje się. W związku z tym procedurę powtórzono poprzez podwojenie maksymalnego stężenia, a tym samym okno projektu eksperymentalnego zostało przesunięte w celu zbadania granic prawego górnego rogu.
Rysunek 6A przedstawia przegląd pozostałej procedury optymalizacji. Analiza zebranych danych zestawionych do iteracji 3 wykazała ograniczenie pozytywnego działania Mg2+, tj. zidentyfikowano optymalny zakres stężeń Mg2+. W związku z tym zdecydowano się na dalsze rozszerzenie zakresu stężeń tylko dla Ca2+ (iteracja 4). Procedurę tę powtórzono dwukrotnie (iteracja 5 i 6), aż do stwierdzenia nasycenia sygnału GFP. To nasycenie tłumaczy się wytrącaniem się soli Ca dla zastosowanych stężeń Ca2+, które nie są dostępne dla komórek.
Ponieważ wyniki eksperymentów są zawsze zakłócane przez szum, wynikająca z tego interpolacja Kriginga wydaje się nieregularna, a oględziny mogą prowadzić do fałszywych wniosków. Jednak optymalny zakres stężeń składników mediów dla nasyconego sygnału GFP można niezawodnie zidentyfikować za pomocą statystycznego testu z, który jest również zaimplementowany w KriKit. Test z wykorzystuje bezpośrednio wewnętrzne informacje statystyczne dostarczone przez metodę Kriginga, tj. wartości predykcyjne i niepewności przewidywania. Rysunek 6B pokazuje zidentyfikowany płaskowyż, określony i zwizualizowany za pomocą zestawu narzędzi KriKit. Zestaw narzędzi KriKit jest dostępny bezpłatnie36 i zawiera szczegółowy samouczek, który wyjaśnia, jak korzystać z jego funkcji.
Jeśli zostaną znalezione więcej niż dwa istotne komponenty, wizualizacja 3D osiąga swój limit. KriKit zapewnia kilka innych możliwych metod reprezentacji wizualnej, takich jak filmy lub "fabuła pokazowa". Jeśli potencjalne optimum mieści się w zdefiniowanym zakresie stężeń, nowe eksperymenty są automatycznie projektowane przy użyciu oczekiwanego ulepszenia40,46. Projekt eksperymentalny oparty na oczekiwanej poprawie jest zintegrowany z zestawem narzędzi KriKit. Bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w dokumentacji oprogramowania.
Po procedurze iteracyjnej przeprowadzono weryfikację wyników, jak opisano w części D. Sprawdzono słuszność wstępnych założeń poprzez wykonanie dodatkowej analizy wrażliwości z wykorzystaniem optymalnego składu podłoża. Oznacza to, że wszystkie początkowe składniki pożywek były zróżnicowane, ale Ca2+ i Mg2+ zostały ustawione na optymalne poziomy stężenia. W tym badaniu wybrano optymalne stężenia <img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref i <img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref. W tabeli 2 przedstawiono wyniki badań przesiewowych w zakresie walidacji. Podobnie jak w przypadku wstępnego badania przesiewowego wrażliwości (por. tabela 1), NH4+ nadal ma znaczący negatywny wpływ, a pozostałe efekty są nadal znikome.
Ze względu na łatwy dostęp, sygnał fluorescencji GFP z zawiesiny hodowlanej został wykorzystany do ilościowego określenia miana zewnątrzkomórkowego GFP podczas wszystkich eksperymentów. Ze względów weryfikacyjnych fluorescencję GFP poddano walidacji w porównaniu z innymi pomiarami. Ponieważ GFP jest wydzielany przez szlak Tat, sygnał fluorescencyjny nie może rozróżniać wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego GFP. W ten sposób uprawy były rozmnażane przy użyciu podłoża referencyjnego i zoptymalizowanego podłoża. Oprócz pomiaru fluorescencji z supernatantów do hodowli bezkomórkowej, zawartość białka określono ilościowo za pomocą testu Bradforda, a (pół)jakościową poprawę GFP zwizualizowano za pomocą SDS-Page15. Wszystkie uzyskane sygnały pomiarowe zostały w przybliżeniu podwojone dla upraw ze zoptymalizowanym podłożem w porównaniu z podłożem referencyjnym i potwierdziły około 100% poprawę wydajności wydzielania zoptymalizowanej pożywki. W związku z tym fluorescencję swoistą GFP zawiesiny uprawowej można uznać za odpowiednią metrykę dla celu optymalizacji, tj. zewnątrzkomórkowego miana GFP.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Zrzut ekranu z listy pipetowania objętościowego do analizy czułości. Wpisy w pierwszej kolumnie przypisują niepowtarzalny identyfikator do wszystkich woluminów wiersza; ten identyfikator jest numerem studni MTP docelowej uprawy MTP na stole roboczym do obsługi cieczy, por. <silna klasa="xfig">Rysunek 4C. Pozostałe kolumny kodują objętości dla różnych roztworów ("Sln-01" do "Sln-15"), które mają być pipetowane. Łączna objętość jednego rzędu odpowiada końcowej objętości uprawy odpowiedniej studni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Zrzut ekranu z oprogramowania do kontroli obsługi cieczy "WinPREP". Po lewej: Polecenia uporządkowane według wierszy, w tym polecenie transferu dla każdego roztworu podstawowego, który ma być pipetowany. Przed ostatnim poleceniem dodania inokulum, wstawiany jest monit użytkownika, aby upewnić się, że kultura nasion zostanie umieszczona na stole w odpowiednim czasie. Po prawej: Schemat stołu roboczego, w tym źródłowy sprzęt laboratoryjny dla Variation Stocks (dwie płytki z głębokimi studniami z 12 studzienkami przypominającymi kolumny), koryto na odczynniki dla Rest Stock, wody i inokulum oraz MTP do uprawy docelowej do przygotowania pożywki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Rysunek 4: Kompilacja szczegółowych zrzutów ekranu do konfiguracji pipetowania roztworu podstawowego. (A) Nieopakowane polecenie do pipetowania materiału Fe. Źródłowe oprogramowanie laboratoryjne i studzienka źródłowa są oznaczone na stole roboczym ramką odczytu i czerwoną kolumną odpowiedniej płytki studni głębinowej. Docelowy sprzęt laboratoryjny i studnie docelowe w środku są oznaczone niebieską ramką wokół i niebieskimi studniami docelowego MTP uprawy. (B) Szczegółowy przykładowy widok przypisania objętości pipetowania dla tego etapu (roztwór podstawowy Fe). Liczba odbiorców jest odczytywana z listy pipetowania, która składa się z 48 wierszy. Objętości dozowania dla wszystkich dołków docelowych dla roztworu podstawowego Fe znajdują się w kolumnie 4 wykazu pipetowania. Zwróć uwagę, że pierwsza kolumna na liście pipetowania zawiera identyfikatory, a nie woluminy do przeniesienia, patrz Rysunek 2. (C) Szczegółowe informacje na temat numeracji studni docelowych. Objętości zapisane w wierszu #1 odpowiedniej listy pipetowania zostaną odpipetowane do studni oznaczonej jako #1 i tak dalej. Studnie #01, #08, #41 i #48 odpowiadają studzienkom A01, A08, F01 i F08 pod względem kodowania alfanumerycznego, które jest również drukowane w samym MTP uprawy. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Rysunek 5: Szczegółowe wyniki z pierwszej iteracji. (A) Interpolacja Kriginga na podstawie danych eksperymentalnych iteracji 1. Czerwone kropki wskazują zestaw danych. Dla porównania, wszystkie trzy powierzchnie interpolacji są nałożone na jeden wykres (ciemnoniebieski: 0 x Ref, w kratkę: 1 x Ref, jasnoniebieski: 2 x Ref). Alternatywną reprezentację wyników można znaleźć w innym miejscu15. (B) Interpolacja krigingowa na podstawie eksperymentów przeprowadzonych w iteracji 1 (czerwone kropki) i iteracji 2 (żółte kwadraty). Część danych przedstawionych na tym rysunku została wcześniej opublikowana15. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Rysunek 6: Przedstawienie iteracyjnie zebranych wyników optymalizacji. (A) Końcowe przewidywanie modelu Kriging. (B) Statystyczna identyfikacja optymalnego obszaru (kolor czerwony) na podstawie statystycznego testu z, który jest dostarczany przez KriKit. Ramki wskazują kolejne etapy iteracyjnego projektowania i wykonywania eksperymentów. Część danych przedstawionych na tym rysunku została wcześniej opublikowana15. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>Znormalizowana wartość średnia współczynnika</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>-0,08</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2+</td>
			<td>-0,05</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2+</td>
			<td>-0,21</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2+</td>
			<td>-0,21</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2,04</td> ZŁ
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+</td>
			<td>-0,11</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>StężenieCO2+</td>
			<td>-0,10</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ok.2+</td>
			<td>godz. 1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+</td>
			<td>0,45</td> pkt.
		</tr>
	</tbody>

Tabela 1: Wyniki analizy wrażliwości. Wartości współczynników reprezentujące średni efekt przy zwiększaniu stężenia danego składnika podłoża od jego wartości środkowej do wartości maksymalnej. W przypadku optymalnych projektów eksperymentalnych, które znajdują się w literaturze standardowej i są tutaj stosowane, odchylenie standardowe reprezentuje bezpośrednio zmienność doświadczalną wynikającą z replikacji doświadczenia referencyjnego. Wartości współczynników zostały znormalizowane przez wartość maksymalną (0,0422 dla składnika Ca2+). Odchylenie standardowe współczynnika znormalizowanego i bezwzględnego wynosi odpowiednio 0,54 i 0,0226.
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>Znormalizowana wartość średnia współczynnika</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2+</td>
			<td>godz. 1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2+</td>
			<td>-3,48</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2+</td>
			<td>-0,52</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15,95</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+</td>
			<td>0,69</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>StężenieCO2+</td>
			<td>-0,51</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0,45</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1,11</td> pkt.
		</tr>
	</tbody>

Tabela 2: Wyniki końcowej analizy wrażliwości. Wartości współczynników reprezentujące średni efekt przy zwiększaniu stężenia danego składnika podłoża od jego wartości środkowej do wartości maksymalnej. Ponieważ zastosowano optymalny projekt eksperymentalny, odchylenie standardowe zależy tylko od zmienności eksperymentalnej przy użyciu zoptymalizowanego składu pożywki. Zmienność doświadczalna nieznacznie wzrosła w porównaniu ze zmiennością przy użyciu pożywki referencyjnej. Wartości współczynników znormalizowano przez wartość maksymalną (0,0106 dla składowej Mn2+). Odchylenie standardowe współczynnika znormalizowanego i bezwzględnego wynosi odpowiednio 3,63 i 0,0385.</tabela></tabela>

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Ogólnym celem tego iteracyjnego przepływu pracy, łączącego eksperymentalny projekt oparty na technologii Kringing i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, jest opisanie ogólnego podejścia do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do hodowli drobnoustrojów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie rozwoju bioprocesów mikrobiologicznych, takie jak optymalizacja podłoży uprawowych, warunki bioprocesu, a także fenotypowanie szczepów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zadaliśmy sobie pytanie, czy podłoża hodowlane zoptymalizowane pod kątem produkcji małych metabolitów najlepiej nadają się również do produkcji białek heterologicznych.Główną zaletą tej techniki jest to, że przyspiesza ona całkowity czas rozwoju dzięki inteligentnemu połączeniu eksperymentu i modelowania. Zademonstruje tę procedurę Roman Jansen, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od koncepcji badania i zdefiniowania metod zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wysterylizuj płytki z głęboką studzienką do przechowywania roztworu podstawowego na stole roboczym, przecierając płytki 70-procentowym etanolem, a następnie susząc je w okapie z przepływem laminarnym. Rozpocznij hodowlę nasion od zaszczepienia 50 mililitrów pożywki BHI zawierającej 25 miligramów na litr kanamycyny jedną porcją z roboczego banku komórek. Umieść wszystkie niezbędne przybory laboratoryjne na stole roboczym robota i wlej roztwory podstawowe do odpowiednich urządzeń laboratoryjnych.Następnie należy uruchomić zrobotyzowany przepływ pracy w celu przygotowania pożywki, tak aby ostatni krok, jakim jest inokulacja, został osiągnięty na czas przed rozpoczęciem hodowli nasion. Po około dwóch godzinach należy pobrać próbkę kultury nasiennej, aby monitorować wzrost, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub O-D-600. Kontynuuj monitorowanie wzrostu o każdej godzinie.Po około pięciu godzinach kultura osiąga O-D-600 między trzema a czterema i służy do zaszczepiania głównych kultur. Umieść kulturę nasion na stole roboczym do obsługi cieczy i kontynuuj protokół przygotowania podłoża. Uszczelnić płytki do mikromiareczkowania po inokulacji.Następnie umieść szczelnie zapieczętowaną uprawę M-T-P w urządzeniu Biolector. Następnie uruchom predefiniowany protokół uprawy. W razie potrzeby pozostałe roztwory podstawowe należy usunąć zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.Następnie wysiewaj kulturę ze zrobotyzowanego stołu roboczego. Wyczyść sprzęt laboratoryjny wielokrotnego użytku przed rozpoczęciem protokołu odkażania płynów. Zatrzymaj główną kulturę po 17 godzinach pracy i przetwarzaj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby określić ilościowo miano G-F-P, najpierw przenieś zawiesiny komórek ze wszystkich dołków hodowlanych do wstępnie opracowanych probówek reakcyjnych. Następnie odwirować zawiesiny komórek przez 10 minut z maksymalną prędkością za pomocą wirówki stołowej, aby uzyskać supernatant wolny od komórek. Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdego supernatantu wolnego od komórek do czarnego 96-dołkowego MTP z przezroczystym dnem.Odczytaj fluorescencję specyficzną dla GFP przy 488 nanometrach dla wzbudzenia i 520 nanometrach dla długości fali emisji za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek. Po zmierzeniu fluorescencji G-F-P, mikropłytka może być bezpośrednio wykorzystana do oznaczania zawartości białka w supernatantach wolnych od komórek za pomocą standardowych protokołów, takich jak test Bradforda lub BCA. Na koniec przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Zademonstrowana procedura stanowi jedną rundę eksperymentów, której wyniki są wykorzystywane do projektowania kolejnych rund z maksymalną oczekiwaną poprawą sygnału G-F-P. W każdej rundzie umieszczane są eksperymenty referencyjne w celu analizy zmienności danych i wykrywania eksperymentalnych wartości odstających. Ten wykres konturowy daje przegląd procedury optymalizacji.Analiza zebranego zestawu danych w iteracji trzeciej ujawniła ograniczenie pozytywnego działania magnezu, identyfikując optymalny zakres stężeń. W związku z tym zdecydowano się na dalsze rozszerzenie zakresu stężeń tylko dla wapnia w czwartej iteracji. Procedurę powtórzono dwukrotnie w iteracji piątej i szóstej, aż do stwierdzenia nasycenia sygnału G-F-P.To nasycenie tłumaczy się wytrącaniem soli wapnia dla zastosowanych stężeń wapnia, które nie są dostępne dla komórki. Siódma iteracja została wykorzystana do bardziej szczegółowego zbadania granic. Optymalne zakresy stężeń składników mediów dla nasyconego sygnału G-F-P można niezawodnie określić za pomocą statystycznego testu Z.Pokazuje zidentyfikowany płaskowyż jako określony i zwizualizowany za pomocą zestawu narzędzi Kringing. Zestaw narzędzi Kringing jest dostępny bezpłatnie i zawiera szczegółowy samouczek, który wyjaśnia, jak korzystać z jego funkcji. Ogólny charakter przedstawionego protokołu pozwala na różne adaptacje, takie jak badanie innych gospodarzy ekspresji drobnoustrojów lub optymalizacja innych właściwości białka docelowego, takich jak wzór glikozylacji lub wiązania dwusiarczkowe.Integracja systemu embrion zwiększa przepustowość eksperymentalną, co pozwala na dużą oszczędność czasu Przy wymianie w pełni sterowalnych i zasilanych bioreaktorów systemami amniarowymi należy wziąć pod uwagę skalowalność wyników. Modelowanie matematyczne i projektowanie eksperymentów pomaga maksymalizować zawartość informacyjną danych pomiarowych w odniesieniu do badanego celu.

generic-protocol-for-optimization-heterologous-protein-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych...

Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę optymalizacji mediów hodowlanych mikroorganizmów przy użyciu projektowania eksperymentalnego Kriging i technologii mikrobioreaktorów. To podejście przyspiesza rozwój procesów bioprocesowych i produkcję białek heterologicznych.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Przeglądaj więcej filmów