Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Ogólnym celem tego iteracyjnego przepływu pracy, łączącego eksperymentalny projekt oparty na technologii Kringing i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, jest opisanie ogólnego podejścia do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do hodowli drobnoustrojów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie rozwoju bioprocesów mikrobiologicznych, takie jak optymalizacja podłoży uprawowych, warunki bioprocesu, a także fenotypowanie szczepów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zadaliśmy sobie pytanie, czy podłoża hodowlane zoptymalizowane pod kątem produkcji małych metabolitów najlepiej nadają się również do produkcji białek heterologicznych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że przyspiesza ona całkowity czas rozwoju dzięki inteligentnemu połączeniu eksperymentu i modelowania. Zademonstruje tę procedurę Roman Jansen, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od koncepcji badania i zdefiniowania metod zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Wysterylizuj płytki z głęboką studzienką do przechowywania roztworu podstawowego na stole roboczym, przecierając płytki 70-procentowym etanolem, a następnie susząc je w okapie z przepływem laminarnym. Rozpocznij hodowlę nasion od zaszczepienia 50 mililitrów pożywki BHI zawierającej 25 miligramów na litr kanamycyny jedną porcją z roboczego banku komórek. Umieść wszystkie niezbędne przybory laboratoryjne na stole roboczym robota i wlej roztwory podstawowe do odpowiednich urządzeń laboratoryjnych.

Następnie należy uruchomić zrobotyzowany przepływ pracy w celu przygotowania pożywki, tak aby ostatni krok, jakim jest inokulacja, został osiągnięty na czas przed rozpoczęciem hodowli nasion. Po około dwóch godzinach należy pobrać próbkę kultury nasiennej, aby monitorować wzrost, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub O-D-600. Kontynuuj monitorowanie wzrostu o każdej godzinie.

Po około pięciu godzinach kultura osiąga O-D-600 między trzema a czterema i służy do zaszczepiania głównych kultur. Umieść kulturę nasion na stole roboczym do obsługi cieczy i kontynuuj protokół przygotowania podłoża. Uszczelnić płytki do mikromiareczkowania po inokulacji.

Następnie umieść szczelnie zapieczętowaną uprawę M-T-P w urządzeniu Biolector. Następnie uruchom predefiniowany protokół uprawy. W razie potrzeby pozostałe roztwory podstawowe należy usunąć zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie wysiewaj kulturę ze zrobotyzowanego stołu roboczego. Wyczyść sprzęt laboratoryjny wielokrotnego użytku przed rozpoczęciem protokołu odkażania płynów. Zatrzymaj główną kulturę po 17 godzinach pracy i przetwarzaj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby określić ilościowo miano G-F-P, najpierw przenieś zawiesiny komórek ze wszystkich dołków hodowlanych do wstępnie opracowanych probówek reakcyjnych. Następnie odwirować zawiesiny komórek przez 10 minut z maksymalną prędkością za pomocą wirówki stołowej, aby uzyskać supernatant wolny od komórek. Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdego supernatantu wolnego od komórek do czarnego 96-dołkowego MTP z przezroczystym dnem.

Odczytaj fluorescencję specyficzną dla GFP przy 488 nanometrach dla wzbudzenia i 520 nanometrach dla długości fali emisji za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek. Po zmierzeniu fluorescencji G-F-P, mikropłytka może być bezpośrednio wykorzystana do oznaczania zawartości białka w supernatantach wolnych od komórek za pomocą standardowych protokołów, takich jak test Bradforda lub BCA. Na koniec przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Zademonstrowana procedura stanowi jedną rundę eksperymentów, której wyniki są wykorzystywane do projektowania kolejnych rund z maksymalną oczekiwaną poprawą sygnału G-F-P. W każdej rundzie umieszczane są eksperymenty referencyjne w celu analizy zmienności danych i wykrywania eksperymentalnych wartości odstających. Ten wykres konturowy daje przegląd procedury optymalizacji.

Analiza zebranego zestawu danych w iteracji trzeciej ujawniła ograniczenie pozytywnego działania magnezu, identyfikując optymalny zakres stężeń. W związku z tym zdecydowano się na dalsze rozszerzenie zakresu stężeń tylko dla wapnia w czwartej iteracji. Procedurę powtórzono dwukrotnie w iteracji piątej i szóstej, aż do stwierdzenia nasycenia sygnału G-F-P.

To nasycenie tłumaczy się wytrącaniem soli wapnia dla zastosowanych stężeń wapnia, które nie są dostępne dla komórki. Siódma iteracja została wykorzystana do bardziej szczegółowego zbadania granic. Optymalne zakresy stężeń składników mediów dla nasyconego sygnału G-F-P można niezawodnie określić za pomocą statystycznego testu Z.

Pokazuje zidentyfikowany płaskowyż jako określony i zwizualizowany za pomocą zestawu narzędzi Kringing. Zestaw narzędzi Kringing jest dostępny bezpłatnie i zawiera szczegółowy samouczek, który wyjaśnia, jak korzystać z jego funkcji. Ogólny charakter przedstawionego protokołu pozwala na różne adaptacje, takie jak badanie innych gospodarzy ekspresji drobnoustrojów lub optymalizacja innych właściwości białka docelowego, takich jak wzór glikozylacji lub wiązania dwusiarczkowe.

Integracja systemu embrion zwiększa przepustowość eksperymentalną, co pozwala na dużą oszczędność czasu Przy wymianie w pełni sterowalnych i zasilanych bioreaktorów systemami amniarowymi należy wziąć pod uwagę skalowalność wyników. Modelowanie matematyczne i projektowanie eksperymentów pomaga maksymalizować zawartość informacyjną danych pomiarowych w odniesieniu do badanego celu.