Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

1. Fazendo a fase móvel

1. Prepare a fase móvel adicionando 400 mL de acetonitrilo a aproximadamente 1,5 L de água DI purificada.
2. Adicione cuidadosamente 2,4 mL de ácido acético glacial a esta solução.
3. Diluir a solução para um volume total de 2,0 L em um frasco volumoso com água DI purificada. A solução resultante deve ter um pH entre 2,8 e 3,2.
4. Ajuste o pH para 4,2 adicionando hidróxido de sódio de 40%, em termos de gota com o uso de um medidor de pH digital calibrado. Adicione muito lentamente quando o pH atingir 4.0. Isso deve levar cerca de 50 gotas para realizar.
5. Filtre a fase móvel através de um filtro de membrana nylon 66 de 0,47-μm sob vácuo para desgasar a solução e remover sólidos que poderiam conectar a coluna cromatográfica. É importante desgasar a fase móvel para evitar ter uma bolha, o que poderia causar um vazio na fase estacionária na entrada da coluna ou trabalhar seu caminho para a célula detectora, causando instabilidade com a absorvência UV.

2. Criando as soluções componentes

Os três componentes que precisam ser fabricados são cafeína (0,8 mg/mL), benzoato de potássio (1,4 mg/mL) e aspartame (L-aspartyl-L-phenylalanine metil ester) (6,0 mg/mL). Essas concentrações, uma vez diluídas da mesma forma, colocam os padrões nos níveis encontrados nas amostras de refrigerante.

1. Adicione 0,40 g de cafeína a um frasco volumoso de 500 mL e, em seguida, dilua para a marca de 500 mL com água DI.
2. Adicione 0,70 g de benzoato a um frasco volumoso de 500 mL e, em seguida, dilua para a marca de 500 mL com água DI.
3. Adicione 0,60 g de aspartame a um frasco volumoso de 100 mL e, em seguida, dilua para a marca de 100 mL com água DI. Coloque esta solução em uma geladeira para evitar a decomposição durante o armazenamento.

3. Fazendo as 7 soluções padrão

Todos os três componentes possuem coeficientes de distribuição diferentes, o que afeta a forma como cada um interage com ambas as fases. Quanto maior o coeficiente de distribuição, maior o tempo que o componente passa na fase estacionária, resultando em tempos de retenção mais longos para chegar ao detector.

1. Seguindo o gráfico na Tabela 1,in pipe a quantidade adequada de cada componente em um frasco volumoso de 50 mL.
2. Diluir cada uma das soluções de estoque para a marca de 50 mL nos frascos volumosicos com fase móvel.
3. Despeje cada solução padrão em frascos pequenos rotulados em um rack de amostra.
4. Armazene os racks de amostras em uma geladeira, juntamente com as demais soluções nos frascos volumosos de 50 mL.

4. Verificando as configurações iniciais do sistema HPLC

1. Confirme que a linha de resíduos está em um contêiner de lixo e não está reciclando de volta à fase móvel.
2. Verifique se a taxa de fluxo da fase móvel está definida para 0,5 mL/min. Isso é alto o suficiente para permitir que todos os picos se eluem dentro de 5 minutos e lento o suficiente para permitir uma boa resolução.
3. Verifique se a pressão mínima e máxima e a taxa de fluxo estão definidas para os valores corretos no painel frontal do sistema de entrega de solventes (a bomba).
   1. Ajuste mínimo de pressão: 250 psi (isto é para desligar a bomba, se ocorrer um vazamento).
   2. Ajuste máximo de pressão: 4.000 psi (isto é para proteger a bomba de quebrar, se um entupimento se formar).
4. Pressione "zero" no painel frontal do detector para definir o branco (o branco é a fase móvel pura).
5. Enxágüe uma seringa de 100 μL com água deionizada, depois com vários volumes de uma das normas de trabalho a serem analisadas e encha a seringa com essa solução. Comece com as 3 amostras de componente único, que permite identificar o pico de cada componente de interesse.

5. Injetando manualmente a amostra e a coleta de dados

1. Com a alça do injetor na posição de carga, injete lentamente 100 μL de solução através da porta de septo.
2. Verifique se o programa de coleta de dados está definido para coletar dados para 300 s, o que permite tempo suficiente para todos os 3 picos passarem pelo detector.
3. Quando estiver pronto para iniciar o teste, gire a alça do injetor para a posição de injeção (que injeta a amostra na fase móvel) e clique em "Iniciar o teste" no programa de coleta de dados do computador imediatamente. Para as normas 1-3, apenas um dos três picos sequenciais aparecem na tela durante a execução (Figura 1).
4. Uma vez que 300 s passaram, a coleta de dados envia um prompt para salvar o arquivo de dados. Salve os dados em um nome de arquivo adequado (por exemplo,STD#1).
5. Observe o tempo em segundos para o pico de cada ensaio, que é usado na identificação desse componente.
6. Remova a seringa do septo e repita o processo para cada uma das normas de trabalho restantes, usando o mesmo tempo por cromatógrafo determinado desde a primeira execução.

Figura 1. O cromatógrafo dos 3 componentes. Da esquerda para a direita, são cafeína, aspartame e benzoato.

6. As amostras de refrigerantes diet

Coca Diet, Diet Pepsi e Coca-Cola Zero são as "incógnitas". Eles foram deixados de fora em recipientes abertos durante a noite para se livrar da carbonação, já que bolhas não são boas para o sistema HPLC. Isso se livra suficientemente de qualquer gases nas amostras.

1. Desenhe cerca de 2 mL do refrigerante diet em uma seringa de plástico.
2. Conecte a ponta do filtro à seringa via Luer-Lok, torcendo-a no lugar.
3. Empurre o líquido na seringa através do filtro e em um pequeno frasco de vidro. Isso se livra de partículas indesejadas que poderiam potencialmente entupir a coluna de separação.
4. Diluir cada amostra com uma quantidade igual de água DI, por isso estão em 50% de pureza.
5. Injete 100 μL da amostra no loop amostral e execute ensaios com os mesmos parâmetros dos padrões.

7. Cálculos

1. A partir das concentrações das soluções componentes, calcule a concentração de todos os componentes nas normas, com base nas diluições feitas para as 7 amostras.
2. Determine áreas de pico nos cromatogramas para cada padrão e amostras desconhecidas pelo método triangular, o que equivale ao pico de altura vezes a largura a 1/2 de altura(Figura 2). Depois de determinar qual pico corresponde a cada componente com base no tempo que leva para cada componente mostrar seu respectivo pico, insira essas áreas de pico em uma planilha de computador.
3. Crie curvas de calibração da área de pico versus concentração (mg/L) nos padrões para os três componentes.
4. Determine os quadrados menos adequados para cada curva de calibração.
5. Calcule a concentração de cada componente nos refrigerantes diet das áreas de pico mostradas a partir dos ensaios hplc para as amostras. Lembre-se que o refrigerante diet foi diluído por um fator de 2 antes de injetar no sistema HPLC.
6. Calcule a quantidade, em mg/L, de cada componente nos refrigerantes dietéticos.
7. Com base nos resultados, calcule os miligramas de cada componente encontrado em uma lata de refrigerante de 12 oz. Assuma 12 oz = 354,9 mL.

Figura 2. Um exemplo básico da altura e largura de pico de uma curva, que devem ser multiplicados (os horários de altura de pico se largura a 1/2 altura).