Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

A cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC, é uma técnica altamente versátil que separa os componentes de uma mistura líquida com base em suas diferentes interações com uma fase estacionária.

A HPLC é uma adaptação da cromatografia em coluna. Na cromatografia em coluna, uma coluna é preenchida com grânulos em microescala chamados de fase estacionária. Os grânulos de fase estacionária são funcionalizados com grupos químicos que induzem uma interação entre o grânulo e os componentes de uma mistura localizada na fase líquida ou móvel. À medida que a mistura flui através da coluna, os componentes interagem com a fase estacionária de maneira diferente.

Em HPLC, a cromatografia em coluna é realizada em uma taxa de fluxo mais alta e, portanto, em uma pressão mais alta do que a cromatografia em coluna clássica. Isso permite o uso de grânulos de fase estacionária menores com uma maior relação área de superfície para volume, o que aumenta muito a interação da fase estacionária e dos componentes na fase móvel.

Este vídeo apresentará os fundamentos da operação da HPLC, demonstrando a separação de componentes de vários refrigerantes diet.

Existem dois tipos de HPLC usados no laboratório: analítico e preparativo. Na HPLC analítica, o instrumento é usado para identificar componentes de um pequeno volume, e a amostra analisada é então descartada como resíduo. Na HPLC preparativa, o instrumento é usado para purificar uma mistura e uma quantidade desejada de cada componente é coletada em frações.

A instrumentação de HPLC consiste em uma série de componentes simples. Primeiro, a fase móvel, mantida em reservatórios de solvente, é bombeada através do sistema por uma ou mais bombas a uma taxa de fluxo constante. A amostra é injetada no fluxo de fase móvel pelo injetor de amostra. A amostra, diluída pela fase móvel, é então entregue à coluna de HPLC, onde os componentes da amostra são separados. Os componentes são então analisados pelo detector e salvos em frações para uso posterior ou transferidos para um frasco de resíduos.

A coluna HPLC é o componente chave do sistema. É composto por um cilindro de metal ou plástico, embalado com esferas em microescala de fase estacionária ou resina de cromatografia. A mistura de amostra flui através do leito de partículas compactado a uma taxa de fluxo constante e cada componente interage com a fase estacionária à medida que flui.

Os compostos interagem com a fase estacionária de maneira diferente e, portanto, percorrem o comprimento da coluna até o detector a uma taxa diferente. O tempo necessário para um componente sair da coluna, ou eluir, é chamado de tempo de retenção. O resultado é um gráfico de tempo de retenção versus intensidade, ou um cromatograma. O tempo de retenção é usado para identificar o componente. O tamanho do pico, especificamente a área sob o pico, é usado para quantificar a quantidade do composto na solução inicial.

A escolha da fase estacionária depende das propriedades dos componentes da mistura de amostras. A fase estacionária mais comumente usada são os grânulos de sílica, pois são um material apolar inerte que forma grânulos em microescala e atinge densidade de empacotamento suficiente. O tipo mais comum de HPLC é a cromatografia de fase reversa, que utiliza uma fase estacionária hidrofóbica, normalmente esferas de sílica com cadeias C18 ligadas à superfície das contas. Os componentes são eluídos em ordem decrescente de polaridade.

A fase móvel usada na cromatografia de fase reversa é tipicamente uma mistura de água e um solvente orgânico, como a acetonitrila. Dependendo da amostra, a fase móvel pode permanecer uma proporção constante de água e solvente orgânico, conhecida como modo isocrático. No entanto, isso pode levar a picos largos, no caso de alto teor de água, ou picos sobrepostos no caso de alto teor orgânico.

A razão de fase móvel também pode ser alterada linearmente ou gradualmente durante a separação, para criar um gradiente de fase móvel. Uma eluição de gradiente pode impedir o alargamento do pico dos componentes menos polares, melhorando assim a separação e encurtando o tempo de eluição.

Agora que os fundamentos da HPLC foram delineados, a técnica de HPLC será demonstrada em laboratório. Neste experimento, a HPLC será usada para separar e quantificar três componentes comuns do refrigerante diet.

Primeiro, para preparar a fase móvel, adicione 400 mL de acetonitrila a 1,5 L de água deionizada purificada. Em seguida, adicione cuidadosamente 2,4 mL de ácido acético glacial. Diluir a solução até um volume total de 2 l. A solução resultante deve ter um pH entre 2,8 e 3,2.

Ajuste o pH para 4,2 adicionando 40% de NaOH, gota a gota, à solução de agitação, com o uso de um medidor de pH calibrado.

Filtre a fase móvel através de um filtro de membrana de 0,47 μm sob vácuo para desgaseificar a solução e remover os sólidos que possam obstruir a coluna. É importante desgaseificar a solução, pois as bolhas podem causar vazios na fase estacionária ou chegar à célula detectora e causar instabilidade nas medições.

Prepare soluções de três componentes de cafeína, benzoato e aspartame, que são três componentes típicos de refrigerantes diet. Essas soluções de componentes são então usadas para preparar as soluções padrão que serão utilizadas para determinar as incógnitas. Prepare 500 mL das soluções de cafeína e benzoato.

Prepare 100 mL da solução componente de aspartame. Guarde a solução na geladeira quando não estiver em uso para evitar a decomposição.

Em seguida, prepare 7 soluções padrão, cada uma com diferentes concentrações de cafeína, benzoato e aspartame. Pipetar a quantidade adequada de cada componente em um balão volumétrico e diluir até a marca de 50 mL com fase móvel.

As 3 primeiras soluções contêm um componente, para permitir a identificação de picos. As outras 4 soluções contêm uma faixa de concentrações de todos os 3 componentes, a fim de correlacionar a altura do pico com a concentração.

Despeje cada solução padrão em um frasco rotulado em um rack de amostras. Guarde o suporte de amostras com amostras e as soluções restantes na geladeira.

Primeiro, configure a fase móvel e os recipientes de resíduos. Certifique-se de que as linhas de resíduos sejam alimentadas em um recipiente de resíduos e não sejam recicladas de volta para a fase móvel. Certifique-se de que a linha de fase móvel de entrada seja alimentada no recipiente de fase móvel.

Verifique se a vazão da fase móvel está definida para 0.5 mL/min. Essa taxa de fluxo permitirá que todos os componentes eluam em 5 minutos, mas é lenta o suficiente para garantir a resolução de picos individuais.

Em seguida, verifique as pressões mínima e máxima no sistema de entrega de solvente. Essas configurações desligam a bomba em caso de vazamento ou entupimento, respectivamente.

Pressione "zero" no painel frontal do detector para definir o espaço em branco. Enxágue um 100-? L com água deionizada, depois com vários volumes de 1 dos 7 padrões de trabalho. Em seguida, encha a seringa com essa solução. Comece com as 3 amostras de componente único para identificar o pico de cada componente.

Em seguida, injete manualmente a solução, colocando a alça do injetor na posição de carga. Injete lentamente o 100 ? L de solução através da porta do septo.

Verifique se o programa de coleta de dados está configurado para coletar dados por 300 s, o que permite tempo suficiente para que todos os 3 picos eluam através do detector. Quando estiver pronto para iniciar o teste, gire a alça do injetor para a posição de injeção, a fim de injetar a amostra na fase móvel. Imediatamente, clique em "Iniciar teste" no programa de coleta de dados. Quando a verificação estiver concluída, repita o processo para cada uma das 7 soluções padrão. Para cada um dos 3 primeiros padrões, apenas um dos 3 picos aparece. Observe a localização do pico, que é usado para identificar o componente.

Selecione 3 amostras de refrigerante diet e deixe-as em recipientes abertos durante a noite para remover a carbonatação.

Após a desgaseificação durante a noite, coloque aproximadamente 3 mL de cada refrigerante diet em uma seringa de plástico. Em seguida, coloque uma ponta de filtro na seringa e empurre o refrigerante através do filtro para um frasco de vidro, a fim de remover quaisquer partículas sólidas.

Dilua 2 mL de cada amostra com 2 mL da fase móvel para diminuir a concentração de refrigerante pela metade.

Empate 100 ? L de uma das amostras de refrigerante em uma seringa e injete-a no laço de amostra. Execute o teste com parâmetros idênticos às soluções padrão. Repita para cada amostra de refrigerante.

Primeiro, correlacione as áreas de pico das amostras padrão com as concentrações conhecidas. Para isso, determinar as áreas dos picos nos cromatógrafos para cada amostra-padrão utilizando o método triangular. Calcule os tempos de altura de pico com a largura na metade da altura e use esse valor como a área de pico.

Usando a área de pico e as concentrações conhecidas, crie uma curva de calibração para cada componente e determine os mínimos quadrados adequados para cada curva de calibração.

Calcule a concentração de cada componente nos refrigerantes diet das áreas de pico. Lembre-se de que os refrigerantes foram todos diluídos por um fator de 2 antes da injeção na HPLC. Com base nesses resultados, calcule o mg de cada componente em uma lata de refrigerante de 12 onças.

Sem surpresa, todos os 3 refrigerantes testados continham aproximadamente a mesma quantidade do conservante benzoato. No entanto, os produtos da Coca-Cola continham mais cafeína. Os valores calculados para todos os componentes correlacionaram-se bem com os valores relatados pelos fabricantes.

A HPLC é um instrumento altamente versátil, usado em uma ampla gama de análises.

A HPLC é frequentemente usada para purificar moléculas de peptídeos. Neste exemplo, complexos peptídicos transmembranares foram preparados e, em seguida, estabilizados por reticulação oxidativa das proteínas com ligações dissulfeto.

As proteínas foram então dissolvidas em ácido fórmico e purificadas usando HPLC de fase reversa. A amostra foi então eluída usando um gradiente linear de dois solventes e a pureza confirmada com espectrometria de massa.

A HPLC também pode ser usada para identificar compostos orgânicos sintetizados em laboratório. No experimento de Miller-Urey, a síntese abiótica de compostos orgânicos na terra primordial foi estudada. Gases primordiais, como metano e amônia, foram introduzidos em um frasco contendo água, simulando os primeiros oceanos. A descarga elétrica foi então aplicada, imitando o relâmpago na terra primordial.

A água foi então analisada usando HPLC acoplada à espectrometria de massa e comparada com os padrões de aminoácidos conhecidos. 23 aminoácidos foram sintetizados e identificados neste experimento.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à HPLC. Agora você deve entender os fundamentos da execução do instrumento e da análise dos dados resultantes.

Obrigado por assistir!