Abstract
النماذج الحيوانية التجريبية من السكتة الدماغية هي أدوات لا تقدر بثمن لفهم السكتة الدماغية علم الأمراض وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. بروتوكول 2 أسبوع لتكرار شروط مسبقة ميتة (رهب) يدفع حماية طويلة الأمد ضد الجهاز العصبي المركزي (CNS) إصابة في نموذج الفأر من السكتة الدماغية التنسيق. يتكون رهب من 9 التعرض لنقص الأكسجين العشوائية التي تختلف في كل مدة (2 أو 4 ساعات) وكثافة (8٪ و 11٪ O 2). RHP يقلل كميات احتشاء، حاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب، والاستجابة الالتهابية في مرحلة ما بعد السكتة الدماغية لعدة أسابيع بعد آخر تعرض لنقص الأكسجين، مما يشير إلى الحث على المدى الطويل من النمط الظاهري CNS واقية الذاتية. منهجية لتقدير مزدوج من حجم احتشاء وBBB اضطراب فعالة في تقييم الحماية الوعائية العصبية في الفئران مع RHP أو neuroprotectants المفترض الآخرين. وقد اشترطت الذكور البالغين فئران وبستر السويسرية التي كتبها رهب أو التعرض المدة أي ما يعادل 21٪ O
Introduction
باعتبارها السبب الرئيسي للعجز الكبار ورابع سبب رئيسي للوفاة، والسكتة الدماغية هي واحدة من الحالات المرضية الأكثر إضعافا التي تواجه السكان البالغين في الولايات المتحدة. 1 النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية تسمح التحقيق التجريبي للطرق جديدة لتقليل الإصابة الدماغية و تحسين الانتعاش بعد السكتة الدماغية. واحد سبيلا جديدا لهذه البحوث متعدية غير شروط مسبقة. شروط مسبقة هو الاستخدام المتعمد للحافزا غير ضارة للحد من الأضرار من لاحقة، وأشد، والإصابة. وقد تبين أن 2 نقص الأوكسجين شروط مسبقة لإحداث تغييرات عديد المظاهر في الدماغ التي توفر الحماية من السكتة الدماغية في كل المجراة في الدراسات المختبرية 3 ومع ذلك، فإن التعرض لنقص الأكسجين واحد لا يقدم سوى العصبية على المدى القصير، وحمل أقل من 72 ساعة من التسامح ضد نقص التروية في فئران بالغة. 4 وحتى بعد أربعة أسابيع من التعرض اليومية 14 ساعة لنقص الأكسجين منخفض الضغط، ولين وآخرون. FOاوند أن العصبية واستمر فقط لمدة أسبوع واحد. 5 شروط مسبقة ميتة المتكرر (رهب) تتميز التغيرات العشوائية في التردد، والمدة، وشدة التعرض ميتة. على النقيض من التحدي شروط مسبقة واحد، RHP يدفع النمط الظاهري cerebroprotective أن تستغرق ما يصل إلى ثمانية أسابيع في الفئران. 6 تخفيض RHP كميات احتشاء، حاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب، والتهاب الأوعية الدموية، والكريات البيض انسلال لعدة أسابيع بعد التعرض ميتة النهائي . RHP انخفاض تحديدا التهاب في الدماغ الدماغية عن طريق الحد من الخلايا التائية، الوحيدات، والسكان بلعم، مع الحفاظ على السكان الخلية B في نصف الكرة الدماغية. 7 في الواقع، بفعل RHP النمط الظاهري المثبطة للمناعة في الفئران قبل أي إصابة الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك السكتة الدماغية. خلايا B RHP المعاملة معزولة عن رهب معاملة الفئران صحي أظهرت النمط الظاهري المضادة للالتهابات فريدة من نوعها، مع downregulation من كل من العرض مستضد وإنتاج الأجسام المضادة. الانخفاض عام في الآليات المناعية التكيفية الموالية للالتهابات يجعل RHP منهجية ممتازة للحث على المناعة الذاتية للأمراض التهابات الجهاز العصبي المركزي محددة فحسب، ولكن أيضا الإصابة أو المرض النماذج الشاملة التي تشمل أمراض الموالية للالتهابات.
RHP يقلل من حيث الحجم واحتشاء BBB اضطراب بعد منتصف انسداد الشريان الدماغي عابر (tMCAo). نماذج حيوانية من السكتة الدماغية، مثل شائعة الاستخدام tMCAo، وتحسين كبير في فهم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية، فضلا عن تصميم neurotherapeutics أكثر فعالية. أول من وضعه كويزومي وآخرون، في عام 1986، 8 الإجراء tMCAo هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع على إحداث سكتة دماغية في القوارض واحدة من الطرق المفضلة للتحقيق في التهاب التالية ضخه. وطرق لtMCAo تتطور، واستخدام أحدث من خيوط المغلفة سيليكون كذلك يقلل من خطر النزف تحت العنكبوتية مقارنة بالطرازات الأخرى 9،10 </ سوب> وتحسين الاعتمادية، على الرغم من سوء الحظ tMCAo غالبا ما تنتج عن اختلاف كبير في حجم احتشاء 11-13 معظم هذه الدراسات تحدد المناطق احتشاء في أقسام الدماغ الاكليلية التي تلطيخ مع 2،3،5- triphenyltetrazolium كلوريد (TTC)، يعتبر المعيار الذهبي لاحتشاء الكمي لأنه هو وسيلة بسيطة وغير مكلفة لإنتاج حية، نتائج قابلة للتكرار. يقدم TTC باعتباره ركيزة من dehydrogenases الموجودة في الميتوكوندريا. عندما يتعرض شرائح الدماغ إلى حل TTC، يؤخذ TTC بشكل انتقائي في الخلايا الحية حيث المنتج الحد غير قابل للذوبان في، formazan، يترسب إلى لون أحمر عميق في الميتوكوندريا قابلة للحياة. بسبب ضعف الميتوكوندريا في الأنسجة الدماغية، تبقى هذه الأنسجة البيضاء، مما يسمح للتمايز الأنسجة التالفة وصحية. 14
RHP يقلل أيضا من BBB اضطراب في نصف الكرة الدماغية. 6 لذلك القياس الكمي المزدوج للسلامة BBB ضمن نفس بالأمطار كما حجم احتشاء أساس TTC-15 قرارات من شأنها أن توفر معلومات مفيدة حول فعالية كاملة من الحماية الذاتية، والعلاقات السببية المحتملة بين BBB اضطراب واحتشاء في الحيوانات غير المعالجة أو المعالجة. تدفق الدم المحيطي من خلال BBB تعطلت والثانوي إلى السكتة الدماغية، ويزيد من السكان الكريات البيض، السيتوكينات الموالية للالتهابات، الاكسدة، وذمة وعائية المنشأ، والتحول النزفية في نصف الكرة الدماغية، وزيادة في نهاية المطاف معدلات الإصابة والوفيات في المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية . 16،17 وهناك طريقة شائعة لقياس BBB اضطراب في النماذج الحيوانية من خلال تقدير حجم ايفانز الأزرق (EB) تسرب الصبغة في الدماغ. 15،18-21 EB يربط بشكل انتقائي لمصل الزلال، وهو بروتين كروي (MW = 65 كيلو دالتون) لا عبور BBB في الحيوانات لم يصب. 22 وبعد السكتة الدماغية، EB يخترق الدماغ، وتتفلور في 620 نانومتر، مما يسمح لقياس الكثافة البصرية داخلهان لحمة أصيب perfused ل22 الكثافة البصرية يتناسب طرديا مع نفاذية BBB عندما تم غسلها EB من الأوعية الدموية القشرية بعد الوفاة التي كتبها transcardiac الارواء. مع تجهيز الفوري للأدمغة TTC الملطخة في الحيوانات مع الإدارة EB، فإن كلا من حجم احتشاء وBBB اضطراب يمكن قياس فعالية. وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن الإصابة العصبية وBBB اضطراب ليست عمليات مصاحبة في المخ بعد السكتة الدماغية، 23،24 حتى اختيار وقت التضحية هو أحد الاعتبارات الهامة.
البروتوكول الذي يلي تفاصيل طريقة رهب، وطريقة tMCAo عن الأمر الذي أدى إلى انسداد الشرايين مؤقت نماذج المتوسطة انسداد الشريان الدماغي في المرضى من البشر، والأساليب النسجية المزدوجة لتحديد العصبية والأوعية الدموية النهاية الإصابة بالسكتة الدماغية. TTC يقيس موت الخلايا وتلف الأنسجة التراكمي، والسماح للالكمي من المجلد احتشاء العامأوميا، في حين يوفر EB لتقدير نصف الكرة الغربي من الضرر BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في مركز ساوث ويسترن الطبي UT الذي يثبت من قبل المعاهد الوطنية للصحة سياسة (NIH) للاستخدام حيوانات التجارب.
1. المتكرر نقص الأوكسجين شروط مسبقة
- العرف تصميم أربعة مقاييس التدفق على المنظمين الغاز ونعلق على القياسية غرف تحريض 15 L مع أنابيب PVC للسماح للغاز مضغوط من الأكسجين (O 2) الدبابات في التدفق إلى الدوائر عن طريق مدخل الميناء. رؤية المعدات والمواد اللازمة لمزيد من التفاصيل عن تصميم حسب الطلب.
- تقسيم الفئران إلى مجموعات 2: المتكرر نقص الأوكسجين شروط مسبقة (رهب) المجموعة، التي تتلقى التعرض إلى 8٪ و 11٪ O 2، والمجموعة الضابطة، التي تتلقى التعرض للO 2 (غرفة الهواء) 21٪ بشكل متزامن. انظر الجدول رقم 1 للتغيرات في وتيرة وكثافة (8 و 11٪ O 2 أو 21٪ O 2)، ومدتها (2 أو 4 ساعة) من التعرض RHP. </ لى>
- إزالة غطاء فلتر العلوي من كل قفص ووضع القفص، مع الطعام وزجاجات المياه على حالها، في غرف متصلة بها O منها 2 الدبابات. إغلاق وتأمين غطاء من الغرفة.
- فتح صمام الغاز الرئيسي للدبابات وضبط تدفق الأولي لكل غرفة الاستقراء إلى 2 L في الدقيقة (LPM) لمدة 5 دقائق الأولى من التعرض. خفض معدل تدفق إلى 1 LPM للفترة المتبقية من التعرض.
- في نهاية التعرض، والحد من تدفق ل0 LPM وإغلاق صمام الغاز للدبابات.
- فتح الأغطية غرفة واستبدال غطاء رأس تصفية على كل قفص. وضع الأقفاص في السكن القياسية حتى التعرض ميتة المقبل.
- رش أسفل كل غرفة الاستقراء مع NPD (STERIS) أو مطهر يعادل / مزيل الروائح بعد كل استعمال.
- فضح كل من 21٪ و RHP الفئران في نفس الوقت من اليوم على مدار أسبوعين كما هو موضح في الجدول 1.
2. عابرالشريان الدماغي الأوسط انسداد (tMCAo)
- انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول توقيت الإصابة بالسكتة الدماغية بعد التعرض RHP النهائي.
- إعداد مكان العمل جراحة العقيم. مكان العمل المحيطة نظيفة مع الايثانول 70٪ أو ما يعادل مطهر وتعقيم جميع الأدوات الجراحية.
- إعداد الليزر دوبلر Flowmetry (LDF) أداة لقياس التغيرات النسبية في تدفق الدم إلى المخ (البرازيلي). بدوره على وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية. تشغيل الحاضنة إلى 34 ° C.
- تخدير الفئران مع التعرض قصيرة إلى مزيج من 4٪ الأيزوفلورين / 70٪ NO 30/02٪ O 2 في غرفة الاستقراء الصغيرة. تأكيد التخدير المناسبة عن طريق معسر طفيفة مخلب. إذا كان الماوس ينسحب مخلب لها، وعودة الماوس إلى غرفة الاستقراء ومواصلة التعرض الأيزوفلورين.
- إزالة الفئران من غرفة التخدير تحريض وإدراج بسرعة الأنف الماوس، في مخروط الأنف. فتح تدفق الغاز إلى مخروط الأنف واغلاق التدفق إلى انيسthesia غرفة الاستقراء.
- دون تغيير NO 70٪ 30/02٪ O 2 خليط الغاز، إصلاح الأيزوفلورين عند 1.8٪ كما جرعة الصيانة للفترة المتبقية من هذا الإجراء. وينبغي أن تظل التنفس البطيء والمنتظم في جميع أنحاء الداخلي ولكن إذا يصبح التنفس السريع والضحل، وزيادة الجرعة الأيزوفلورين. قد تختلف جرعة الصيانة بين تصنيع المعدات والحيوانات المستخدمة في التجربة.
- باستخدام microshaver، حلاقة الشعر على المنطقة الزمنية بين زاوية العين والأذن وكذلك خط الوسط البطني من الرقبة. إزالة الفراء الزائدة وتطبيق مواد التشحيم العين مع مسحة القطن المعقم للحفاظ على القرنيات من الجفاف أثناء العملية. مسح أسفل منطقة شق مع منصات الكحول ومسحة providone اليود مع مسحة القطن المعقم للحفاظ على ظروف معقمة.
- إدارة المسكنات وفقا للمبادئ التوجيهية الجراحية القوارض.
- إجراء شق طريق الجلد الزمني بين العين والأذن.فضح العضلات الصدغي. باستخدام مقص الجراحية الدقيقة، وقطع في الرباط العضلات الزمني في التلال الزمني داخل منطقة العتابي العضلات البيضاء.
- دفع بلطف معظم العضلات أفقيا مع ملقط لتصور الشريان الدماغي الأوسط (MCA) من خلال الجمجمة. بعد شق العضلة الزمنية، والمنطقة قد ملء مع الدم. بلطف استخدام قطعة من القطن لوقف أي نزيف محتمل.
- استهداف طرف لجنة التحقيق LDF إلى منطقة MCA. تسجيل السفينة اختير هذا المجال تختلف بين الفئران.
- عقد LDF في مكان والاحمرار مع الجمجمة حتى يتم قراءة مستقرة الأحمر تدفق خلايا الدم وتسجيل هذه القيمة على أنها البرازيلي الأساس. الاتحاد البرازيلي الأساس المثالي على الليزر دوبلر Flowmetry هي> 600 حالة تغير مستمر، ولكن هذا سوف تختلف مع الصانع. إذا البرازيلي أساسية هي <400 حالة تغير مستمر، هو الأكثر احتمالا من الوريد قريب، أو موضع غير مكتمل لجنة التحقيق على السفينة المستهدفة تسجيل التدفق.
- بعد تأسيس الاتحاد البرازيلي أساسية، repositiعلى الماوس بحيث تتعرض الرقبة. دعم رئيسها والحفاظ على الماوس تحت التخدير ثابت من الرؤوس.
- جعل شق خط الوسط بطني من أسفل الفك السفلي إلى الترقوة.
- باستخدام ملقط، كليلة تشريح كل اللفافة السطحية لفضح الشريان السباتي المشترك الأيسر (CCA). فصل CCA من النسيج الضام والعصب المبهم.
- بشكل دائم ligate التقييم القطري المشترك مع خياطة 6.0 الحرير. وضع خياطة ligating كما الداني ممكن للسماح مساحة كافية لتسد وضع خيوط.
- حلقة وفضفاضة ربط الثانية خياطة الحرير 6.0 حول القاصي CCA للخياطة الاغلاق. يجب الحرص على عدم انسداد الشريان كما سيتم في وقت لاحق أن الخيوط خيوط الاغلاق من خلال الشريان السباتي.
- استخدام serrafine الدقيقة المشبك areterial 8 × 2 مم ضوء لكبح القاصي CCA للخياطة الحرير المرتبطة بشكل فضفاض. رفع بلطف CCA مع ملقط وجعل شق طولي صغير، والأقرب إلى خياطة ligating كماممكن مع 3 مم vannas.
- كاتب الموضوع 12 ملم المغلفة السيليكون 6.0 مقياس النايلون خيوط الاغلاق من خلال شق للدخول لمعة الشريان، ثم دفع ذلك عدد قليل مم. فضفاضة تشديد الثانية خياطة الحرير فضفاضة حول غيض من خيوط الاغلاق لضمان تدفق الدم لا يدفع خيوط من التقييم القطري المشترك وإزالة المشبك الشرايين.
- في التشعب الأول من CCA في الشريان السباتي الداخلي (ICA) والشريان السباتي الخارجي (ECA)، والخيط وخيوط الاغلاق في فرع الأيمن من التشعب الأول لدخول ICA.Advance خيوط الاغلاق 9-10،5 ملم الماضي خياطة الحرير الثانية في الشريان السباتي الأيسر الداخلي (ICA).
- بعد فترة وجيزة من دخول ICA، دفع خيوط الاغلاق في فرع الأيسر في التشعب الثاني بين ICA والشريان pterogopalantine (PPA). التصور من المؤسسة العامة للتقاعد من غير المحتمل جدا المضي قدما حتى تشعر مقاومة معتدلة مع وضع الكامل للخيوط الاغلاق.رفع ICA مع ملقط قد تساعد خيوط على موضوع أكثر سهولة في الفرع الأيسر من birfurcation الثانية. تشديد خياطة الحرير الثانية.
- بدوره الماوس حتى شق على MCA مرئيا. مع المعدات LDF، تأكد من أن الاتحاد البرازيلي تم حظره من خلال قراءات LDF. A انسداد الناجح هو تخفيض> 80٪ من البرازيلي خط الأساس.
- تماما تشديد ومزدوجة عقدة الخيط الحرير الثانية حول خيوط الاغلاق عندما يتحقق الموقف الصحيح. إذا لزم الأمر، ودفع قليلا أو سحب خيوط الاغلاق لتحقيق معايير الاتحاد البرازيلي لانسداد الناجح (على سبيل المثال خفض> 80٪ من البرازيلي أساسية).
- إغلاق الفتحة الرقبة والرأس مع خيوط النايلون 6.0.
- مكان الفئران في 34 ° C الحاضنة لمدة انسداد. طول الموصى بها من انسداد هو 60 دقيقة، ولكن هذا يختلف بالنسبة للعمر، والاختلافات التي تعتمد على الضغط في تشريح الدماغية و 25 و مدى injurذ المطلوب (خفيفة، متوسطة، شديدة). تأكد من أن الحيوانات يستعيد وعيه داخل دقائق من نزوله التخدير.
- إعادة تخدير الحيوانات مع isoflurane، كما هو موضح في الخطوة 2.3، 5 دقائق قبل نهاية الفترة انسداد محددة مسبقا، فتح شق فروة الرأس ونؤكد على أن نضح MCA لا يزال خفض استخدام قراءات LDF عبر الجمجمة. إذا لم يتم خفض البرازيلي بما فيه الكفاية (على سبيل المثال <20٪ البرازيلي الأساس)، وإشباعها على MCA في مرحلة ما خلال انسداد وينبغي استبعادها الماوس من مزيد من التجارب.
- فتح شق خط الوسط الرقبة وفضفاضة ربط الخيط الحرير الثالثة حول CCA، البعيدة للخياطة الحرير الثانية، ولكن الأقرب إلى التشعب CCA للتأكد من أن الشريان السباتي الخارجي (ECA) سوف تبقى قابلة للحياة بعد إزالة خيوط.
- قص أو فك عقدة الذي يحمل خيوط الاغلاق (أي الثانية خياطة الحرير) وسحب خيوط الاغلاق ببطء. إزالة مرة واحدة، بسرعة إغلاقخياطة الحرير الثالثة حول التقييم القطري المشترك للحد من ارتجاع الدم من ICA. مزدوجة عقدة هذا الخيط وإغلاق شق مع خيوط النايلون 6.0.
- إعادة الماوس لتحديد مستوى الاتحاد البرازيلي بعد 5 دقائق من ضخه. ويعرف نجاحا ضخه عموما باعتباره القوة الحدودية المشتركة> 50٪ من البرازيلي خط الأساس، ولكن، كما هو الحال مع تدفق انسداد، تمكن الباحثون من إنشاء معيار الخاصة بهم. إذا الحيوانات تبدي البرازيلي أقل من 50٪ من خط الأساس، فمن المرجح أن MCA هو "بشكل دائم" المغطي، وبالتالي يمثل المعيار الدراسة استبعاد آخر.
- إغلاق كلا الشقوق مع خيوط النايلون 6.0. توفير المياه المالحة، مخدر (ليدوكائين)، والمضادات الحيوية وفقا للمبادئ التوجيهية القوارض. ولكن بعض جرعات صغيرة من المضادات الحيوية (3 ملغم / كغم من المينوسكلين) وقد وجد أن تكون اعصاب المخ يلي. 26
- بعد أن إستعاد وعيه في الحاضنة ساخنة بعد الجراحة، الفئران مكان في قفص معقمة نظيفة. توفير فو مبللسوف يكون هناك رقابة الغذائية د أو الماء المكملات الغذائية جل وطبق بتري المياه باعتبارها الحيوانات التنقل التالية السكتة الدماغية. مراقبة الحيوانات عن كثب خلال الانتعاش المفرط لآلام ما بعد الجراحة والموت.
3. ايفانز الأزرق (EB) حقن
- حقن EB 22 ساعة بعد ضخه، وينبغي أن يعمم في الدم لمدة 2 ساعة السابقة للتضحية وتلطيخ TTC.
- تقديم حل EB للحقن (2٪ EB في المياه المالحة) وتخلط بلطف في درجة حرارة الغرفة. حل مرشح من خلال ورق الترشيح أو دفع من خلال 0.2 ميكرون فلتر تعلق على حقنة صغيرة لإزالة غير منحل EB وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد كمية EB حاجة للحقن (4 مل / كجم من وزن الجسم) رسم المبلغ المطلوب من الصبغة إلى حقنة الانسولين 0.3 سم مع 29 إبرة قياس والتأكد من أن الحل هو في درجة حرارة الغرفة
- كبح الماوس باستخدام رادع مسطحة القاع. عقد ذيل بحيث الوريد الجانبي هو الاتحاد العقاريةermost. وتقع الأوردة الجانبية على جانبي محور الذيل. عقد غيض من الذيل للحفاظ على الماوس ثابتة للحقن.
- ادخال الإبرة في الوريد حوالي 3.5 ملم، والحرص على عدم ثقب الوريد. تأكد من أن الإبرة في الوريد من خلال الاعتماد مرة أخرى على حقنة وتبحث عن آثار دماء.
- حقن كل من الصبغة على مدى 1 دقيقة. يجب إذا كان هذا الحل هو الذهاب إلى الوريد يكون هناك الحد الأدنى من المقاومة كما يتم تطبيق الضغط على حقنة. تأكيد نجاح الإدارة الوريدية النظامية من EB عن طريق تغيير لون الفوري في الذيل والأطراف والعيون من الفأرة.
- إزالة الإبرة من الذيل وبلطف تطبيق الضغط باستخدام شاش نظيفة من أجل وقف النزيف.
- بدء التوقيت عندما يتحول الجلد الماوس، الأزرق. السماح للEB أن تعمم لمدة 2 ساعة لاختراق BBB ضعف.
4. 2،3،5- Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ
- مرة واحدة قد حلت المسحوق تماما، ونقل على الفور إلى زجاجة، غطاء في احباط، وتخزينها في 4 ° C. TTC والنسيج ملطخة TTC خفيفة حساسة.
- بدء تشغيل مضخة نضح في 5 مل / دقيقة معدل التدفق مع حقنة 60 سم مليئة الجليد الباردة 0.01 M PBS وتوصيلها إلى 27 GUAGE المجنح ضخ إبرة. وضع رأس الإبرة حوالي 0.5 سم في البطين الأيسر من القلب وخفض الأذين الأيمن. تدريجيا المخفف الدم الوريدي ينبغي أن تتدفق من الأذين خلال نضح حتى يظهر الدم الوريدي عديم اللون. Transcardially يروي 30 مل 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال القلب.
- إزالة بصيلات الشم عن طريق إدخال الفولاذ المقاوم للصدأ 0.21 مم شفرة سميكة في الفتحة الثانية من الجانب منقاري من المصفوفة.
- إزالة المخيخ عن طريق إدخال شفرة في الفتحة الرابعة من الجانب الذيلية للمصفوفة.
- إدراج شفرة في الفتحة الوسطى من فتحات المتبقية في المصفوفة. إدراج شفرات المتبقية، التي تتوسط بالتساوي الأنسجة المتبقية لضمان أكثر حتى توزيع الأنسجة أثناء تشريح.
- مرة واحدة وقد تم إدراج جميع شفرات، إضافة 1-2 قطرات من برنامج تلفزيوني إلى الدماغ لبلل.
- إزالة شفرةالصورة في وقت واحد من المصفوفة بدءا بمنطقة منقاري. الحفاظ على 7 شرائح الأولى لتحليل TTC بعد tMCAo. استخدام ملعقة صغيرة لنقل بعناية شرائح من شفرة إلى القارورة TTC شغل.
- عندما يتم ترتيب المقاطع على الشريحة، مسح الشريحة باستخدام ماسح ضوئي قياسي. تعيين دقة في ما لا يقل عن 600 نقطة في البوصة لتحليل الصور. تأكد من تضمين اسم الحيوان وحاكم متري في الصورة الممسوحة ضوئيا.
- اقلب الشريحةومسح الجانب الخلفي للتأكد من جمع كل البيانات.
5. عائق الحجم الكمي
- تحديد حجم احتشاء باستخدام برمجيات تحليل الصور القياسية (على سبيل المثال، يماغيج).
- مسح الصور بدقة عالية (مثل 600 نقطة في البوصة) للتحليل كاف. الصور المحاصيل. توحيد مقياس لجميع الصور باستخدام المسطرة متري المدرجة في الصورة الممسوحة ضوئيا.
- حساب الحجم الكلي للنصف الكرة الأرضية المقابل باستخدام الصيغة التالية. كرر هذه الصيغة لحساب الحجم الكلي للنصف الكرة المماثل.
مجموع مجموع نصف الكرة الأرضية المقابل من كل شريحة سمك العاشر شريحة - حساب حجم احتشاء غير المباشر. . الرقابة على ذمة المماثل من السكتة الدماغية باستخدام صحية، نصف الكرة الأرضية المقابل كوسيلة لمراقبة 27 استخدم الصيغة التالية لحساب حجم احتشاء غير المباشر:
الحجم الكلي للنصف الكرة الأرضية المقابل -
(عدد نظام القبول(ه) من نصف الكرة المماثل حجم متوسط درجات من 3 قياسات احتشاء)
6. حاجز الدم في الدماغ (BBB) النزاهة الكمي
- للتحضير لEB الكمي، تزن الأولى 2.5 بوصة وزن القوارب. تسجيل الوزن وتسمية اثنين من وزن القوارب لكل حيوان: واحدة لنصف الكرة المماثل واحدة لنصف الكرة الأرضية المقابل.
- بعد مسح أقسام TTC الملطخة، تقسم كل قسم بشفرة الحلاقة المتاح في نصفي الكرة الأرضية المماثل والمقابل. وضع نصفي الكرة المماثل من جميع أقسام 7 في وزن القارب وتسجيل الوزن. تكرار لنصف الكرة الأرضية المقابل.
- نقل على الفور القوارب وزنا لمجموعة الفرن لمدة 56 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- تزن الأقسام المجففة. نقل نصفي الكرة الأرضية إلى منفصلة 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
- حساب كمية الفورماميد اللازمة لكل نصف الكرة الأرضية (8 مل / ز من الأنسجة الجافة)، وإضافة إلى microcentrifug كل فيما يخصهأنابيب ه. الفورماميد هو ضوء حساسية وتغطية جميع العينات المعالجة الفورماميد في احباط من هذه النقطة فصاعدا.
- نقل أنابيب microcentrifuge إلى حاضنة لتعيين 56 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى.
- بعد ساعة 48، ماصة من طاف الأزرق إلى مجموعة أخرى من أنابيب microcentrifuge المسمى. دفع الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب لتعظيم حجم طاف المستخرج. إبقاء الأنابيب من طاف والتخلص من جميع الأنسجة.
- إعداد التخفيفات المتسلسلة الأسية من EB في الفورماميد لمنحنى القياسية. وتشمل 1 فارغة (الفورماميد فقط) ثم 10 حلول الأسية من 0.125 ميكروغرام / مل إلى 64 ميكروغرام / مل من EB في الفورماميد.
- ماصة 300 ميكرولتر من التخفيفات المقدمة للالمنحنى القياسي في لوحة 96-جيدا. ماصة 300 ميكرولتر من طاف في الآبار المقابلة.
- قياس الامتصاصية على معمل في 620 نانومتر.
- مقارنة منحنى مستوى التخفيفات EB مع الامتصاصية سو العينات طاف. الكثافة البصرية يتناسب طرديا مع سلامة BBB.
- نفترض الكثافة البصرية من نصف الكرة الأرضية المقابل كخلفية واستخدام صيغة (المماثل المقابل) / الجانب المقابل لتحديد التغير أضعاف. لمزيد من التفاصيل حول التحليل الإحصائي رؤية مارتن وآخرون، 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وشملت هذه الدراسة 25 من الذكور الفئران وبستر السويسرية التي كانت 10 أسابيع من العمر في بداية العشوائية في RHP (ن = 10) أو 21٪ O 2 (ن = 15) مجموعات. بعد أسبوعين من التعرض RHP النهائي، وأجريت العمليات الجراحية، مع مجموعات أعمى ويوازن بين أيام. بعد tMCAo، توفي 1 الماوس أثناء الانتعاش بعد العمليات الجراحية وتم استبعاد 1 الماوس من الدراسة لأنها لم تستوف المعيار ضخه الحدودية المشتركة. وكانت كل من الفئران استبعادها من 21٪ O 2 المجموعة. وفقا للمبادئ التوجيهية صلوا اليها، ويبين الجدول 28 2 المعلمات الجراحية. كميات غير المباشرة احتشاء، وتورم في نصف الكرة الغربي (أي، وذمة)، وايفانز الأزرق ترد (EB) extravasations في الشكل (2). وقد تم تحليل جميع البيانات مع المفردة تي اختبارات (يعني الانحراف المعياري تظهر)، والقيم المتطرفة الكشف مع الكاذبة ديسكفري أسعار أقل من 1٪ (Graphpad بريزم)، والتي أزالت 4 القيم المتطرفة (2 من 21٪، و 2 من رهب) من مجموعة البيانات EB.
الحمار = "jove_content"> في هذه المجموعة، وانخفاض كميات RHP احتشاء بمقدار النصف تقريبا (33.9 ± 23.0 مم 3) مقارنة ب 21٪ O 2 الفئران المعالجة بالإثير (62.6 ± 42.6 مم 3)، ولكن هذا الفرق غير معنوي (p = 0.10). ومع ذلك، توقع وبداهة تحليل الطاقة ون = 10 في المجموعة المطلوبة، وهو ما لم يحقق مع الفئران RHP المعاملة بعد أن تم إزالة القيم المتطرفة. وينبغي النظر في تصميم هذه التجارب في المستقبل باستخدام RHP. لم يكن هناك أي تأثير على RHP تورم في نصف الكرة الغربي، مقياس المستمدة من تحليل حجم TTC التي يمكن أن تتساوى مع وذمة. 6 الفئران RHP المعاملة اتجاها (ع = 0.05) في الحد من BBB اضطرابات في نصف الكرة الدماغية طبيعية ل نصف الكرة الأرضية المقابل. الشكل 2D تظهر مجموعة من القيم لEB تسرب لكلا الفريقين العلاج.
الشكل 1: غرف RHP-مصممة خصيصا تصور اللوحة العليا للمقاييس التدفق مبنية خصيصا لرصد الفردية من تدفق الهواء في ما يصل الى أربع غرف. ويرد الهواء أنابيب بردة ترك مقياس الجريان والمترتبة على مدخل الميناء من تحريض غرفة 15 L في اللوحة السفلى. لا يزال الميناء منفذا مفتوحا خلال RHP للسماح لتدوير الهواء.
الشكل 2:. RHP يقلل كميات احتشاء وBBB اضطراب RHP (A) يقلل كميات احتشاء بنسبة 46٪ مقارنة للسيطرة على الفئران، ولكن لديه (B) لا تؤثر على تورم في نصف الكرة الغربي المستمدة من البيانات TTC (C) في نفس الحيوانات، RHP يقلل BBB اضطراب (ع = 0.05) على النحو المحدد من قبل ايفانز الأزرق تسرب تطبيع نصف الكرة الأرضية المقابل. (D) البقع الممثل TTC من كلا RHP المعاملة و 21٪ O 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعرض مرة واحدة لنقص الأكسجة النظامية (أي 2 ساعة من O 2 11٪) في الفئران "عابر" يحمي الدماغ من tMCAo، 29 وهذا يعني أن استجابة جينية لتحدي شروط مسبقة ميتة قصيرة الأمد، ويتم استعادة النمط الظاهري الأساس داخل أيام. العروض المتكررة من التحفيز شروط مسبقة ميتة يمتد بشكل كبير مدة النمط الظاهري اعصاب. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن 6 من وتيرة وحجم ومدة القطار التحفيز المتكرر من العوامل الحاسمة في هذا الرد. على سبيل المثال، ببساطة تكرار نفس كثافة ومدة نقص الأكسجة (2 ساعة من 11٪ أكسجين) 3 مرات في الأسبوع (MWF) أكثر من 2 أسابيع لم تمديد النافذة العلاجية لحماية عائية عصبية من tMCAo، 6 ولكن كان كافيا للحث الطويلة التسامح الدماغية المصطلح في شبكية العين. 30 ومن المثير للاهتمام، على الرغم من 5 التعرض لنقص الأكسجين النظامية (5 ساعة من 8٪ O 2 </ دون>) متباعدة 6 أيام محمية بصرف النظر ضد tMCAo يسببها بعد 3 أيام من التعرض ميتة الماضي، قد فقدت العصبية إذا وضعت التعرض ميتة 5 3 أيام على حدة. 31 والسبب في هذا الاختلاف لا يزال غير واضح، ولكن قد يكون نتيجة ل مدة نقص الأكسجة الشديد بالنسبة لهذا البروتوكول و / أو عدم كفاية الوقت الانتعاش بين التحديات ميتة هذه الصرامة.
وباختصار، فإن المعايرة التحدي ميتة المتكررة عبر مجالات التردد، والحجم، والمدة، ويبدو حاسما في تطوير التسامح مع عدم إحداث الإصابة، ناهيك عن الآثار الأنسجة محددة وربما أنواع محددة. على سبيل المثال، 3 من 9 من التعرض RHP تنطوي على التعرض إلى 8٪ O 2 لمدة 4 ساعة، على الرغم من 6 ساعات من 8٪ O 2 يدفع فاة الخلايا العصبية الحصين. 32 لذلك، يجب أن يكون هناك التزام الصارم لبروتوكول RHP فيما يتعلق مدة وشدة التعرض ميتة للحث الذاتيةالحماية. على الرغم من أن الأثر المحتمل للإيقاع الساعة البيولوجية على حماية الناجم عن شروط مسبقة يحتاج إلى مزيد من الاستكشاف، 33 أداء التعرض RHP في نفس الوقت من اليوم لفوج معينة يقلل من خطر أي تأثير التباس محتمل. من حيث الجرعة والاستجابة والفاعلية، وقعت حماية أقوى RHP بوساطة من السكتة الدماغية التنسيق عندما كان المستحث على tMCAo 2 أسابيع بعد التعرض ميتة النهائي، 3 في وقت المعالجة RHP الفئران صحية يحمل النمط الظاهري المثبطة للمناعة (في غياب الإصابة الدماغية). 7 هذه النقطة الساعة 2 أسبوع قد لا تتزامن مع فترة الحماية القصوى ضد غيرها من إصابات الجهاز العصبي المركزي الحادة، أو في أجهزة الجسم الأخرى. كل من بروتوكول رهب، وملامح الزمنية للاستجابة جينية، سوف تحتاج الأمثل لكل استخدام متعدية جديد بلا شك.
واحدة من أكبر القصور في إجراء tMCAo هو التوزيع غير متجانسة من احتشاء فوlumes، كما يتضح من هذه المجموعة البيانات تمثيلا. تداول الضمانات التي تقدمها دائرة ويليس، anastomoses السحايا الرقيقة، والظهرية تقاطعات ضمانات يمكن أن يؤدي إلى احتشاء كميات غير متناسقة. 34 الاختلافات بين دائرة ويليس في سلالات مختلفة من الفئران، فضلا عن وجود والمباح من الخلفي التواصل الشرايين، 25 (35 عاما) يمكن زيادة خفض اتساق كميات احتشاء ضمن مجموعات. أحجام عينة قوية والتكرار غالبا ما تكون ضرورية لتحقيق نتائج حاسمة وينبغي أن تدرج في تصميم التجربة بعد توفير الطاقة وفقا لذلك. وسائل أخرى للالسكتة الدماغية تحريض وطرق الدماغية التنسيق البعيدة بشكل خاص مثل انسداد فرع MCA الأساسي من خلال فتحة لدغ في الجمجمة الجانبية، أو photothrombosis من الفروع البعيدة للMCA، غالبا ما تنتج أقل التباين في حجم المخ. السكتات الدماغية Photothrombotic محدودة، ومع ذلك، لأنها تنتج في وقت واحد وذمة خارج الخلية والخلايا، وهي فينومينون لم أر في السكتات الدماغية الإقفارية في البشر. 36 وفي المقابل، tMCAos هي أكثر قابلية للتطبيق مباشرة إلى الإعداد السريرية إلى أكثر من 60٪ من كل السكتات الدماغية لدى البشر تحدث بسبب انسداد الشريان الدماغي الأوسط. 37 وأخيرا، فإن التخدير المستخدمة خلال tMCAo، الأيزوفلورين ، وقد تبين للحث على العصبية. 38 من أجل تفسير هذه العصبية، وينبغي أن تكون مستويات الأيزوفلورين متناسقة بين العمليات الجراحية وبين المجموعات التجريبية المعالجة وغير المعالجة، والحفاظ على <3٪ للحد من آثاره اعصاب المحتملة. 39
الوقت أمر بالغ الأهمية في عملية تلطيخ TTC أيضا. بالرغم من وجود تباين كبير في الأدب السكتة الدماغية عن الوقت الذي TTC تلطيخ لا يمكن أن يؤديها بعد نقص التروية، تتفاوت من 4 ساعات إلى 7 أيام بعد السكتة الدماغية، وينبغي أن يحدث 18،40 TTC تلطيخ في 24-48 ساعة بعد السكتة الدماغية لأكثر أحجام احتشاء ثابتة ومحددة بوضوح. أحجام احتشاء TTC لها النحلن وجدت لتحقيق الاستقرار في 24 ساعة بعد السكتة الدماغية ولكن بعد 48 ساعة، تدفق الضامة في الدماغ الدماغية يجعل تحديد حجم احتشاء صعوبة. 14،40 وعلاوة على ذلك، وتلطيخ للأنسجة المخ مع TTC يجب أن يتبعوا التضحية فورا. سوف تأخير تلطيخ تقليل جودة وصمة عار بسبب زيادة مخاطر الوفاة الميتوكوندريا الناجمة عن نفوق الحيوانات، وليس احتشاء دماغي. وهناك زيادة مماثلة في وفاة الميتوكوندريا يحدث إذا لم يتم التقيد بهذا الدماغ رطبة خلال الإدراج من ريش. في حين يوضح هذا البروتوكول بشكل واضح لصالح تحليل احتشاء مع TTC تلطيخ والبقع immunohistological أخرى يمكن استخدامها لتحديد حجم احتشاء التالية tMCAo. الكريزيل البنفسجي أو الفلوري اليشم تلطيخ لديها متطلبات الوقت أقل صرامة لتلطيخ بعد التضحية، ولكن هذه البقع الكلاسيكية تتطلب الشرائح الرقيقة جدا التي حصلت عليها ناظم البرد أو مبضع للفحص المجهري، وبالتالي تتطلب المزيد من الوقت لجمع وتحليل تكاملي. 14 وعلاوة على ذلك، فإن هذه الحادياهلية ت لا يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع EB الكمي من BBB انقطاع، كما وضعت من قبل الآخرين، 15 القضاء على إمكانية المقارنة المباشرة بين حجم احتشاء وسلامة BBB في الدماغ معين. تجدر الإشارة إلى أن الحيوانات المعروضة عادة الوردي RHP المعالجة بدلا من وحدات التخزين بيضاء نقية. 6 ومن أجل تفادي فشل من احتشاء في الفئران RHP المعاملة، ونحن نستخدم فترة أقصر لتلطيخ TTC الذي ينتج في الأنسجة السليمة أكثر الوردي مقابل إلى اللون الأحمر الداكن. قد ايفانز تجهيز الأزرق أيضا تلقي بظلالها على المنطقة احتشاء من غير المرجح مع تلطيخ الكمي المزدوج الواردة في هذا البروتوكول عوائق بيضاء نقية جدا.
من أجل مقارنة EB الكمي داخل وبين المجموعات، يجب على جميع الحيوانات تخضع مرات تداول تعادل لEB. وضخت الآخرين EB ضخه مباشرة بعد وسمح EB أن تعمم لمدة تصل إلى 72 ساعة، 41 أو في 4 ساعات بعد tMCAo أن تعمم لمدة 4 ساعة، 15 كما البديلةنهج ه. كمية EB الذي يعبر BBB تعطلت ويدخل أنسجة المخ يمثل تراكم لا يتجزأ من منضم الزلال الصبغة من زمن الحقن لوقت التضحية. وبالتالي، فإن الطريقة الموضحة في هذه الورقة يكشف عن حالة من BBB في الوقت بالضبط بين 22 و 24 ساعة من ضخه، وربما يغيب فتحها أو إغلاقها من الحاجز في وقت سابق أو لاحق. على العكس من ذلك، فإن الطريقة التي تستخدمها وانغ وآخرون. يكشف عن حالة من BBB لمدة 72 ساعة عقب السكتة الدماغية، بما في ذلك جميع التغييرات في الوضع BBB خلال تلك الفترة لمدة 3 أيام بعد السكتة الدماغية 42 البروتوكول لا هو أفضل أو أسوأ من ذلك؛ على الرغم من أنه لا يزال هناك خطر من "المفقودين" افتتاح عابرة من BBB باستخدام أقصر الأوقات الدورة الدموية، فإنه يسمح للمحققين لتحديد ملامح الزمنية المحددة من BBB الفيزيولوجيا المرضية وإقران ذلك مع أساليب أخرى، كما هو موضح هنا. لقد تضافرت الآخرين TTC وEB عن طريق حقن EB intracardially 1 دقيقة بعد نضح transcardial. 18 ومع ذلك، هذا اجتمعأنتجت هود نتائج متضاربة، وهو إجراء أكثر تعقيدا بكثير من البروتوكول هو موضح أعلاه.
واحدة من الاتجاهات الواعدة في المستقبل لRHP هو تطبيق متعدية هذا البروتوكول شروط مسبقة لمرض دول أخرى. تم العثور على التعرض ميتة متقطعة إلى أن تكون وقائية في ظروف CNS الموالية للالتهابات أخرى من نقص التروية. في نموذج الفئران من مرض الزهايمر، خفضت 2 أسابيع من 4 ساعات التعرض اليومي لنقص الأكسجة ناقص الضغط على ضعف الاحتفاظ الذاكرة وفقدان الخلايا العصبية القشرية بعد الحقن داخل المخ من البيتا اميلويد 43 نقص الأكسجين المتقطع (2 أسابيع من التعرض اليومية 15 ساعة إلى نقص الأكسجة ناقص الضغط تم العثور على) أيضا أن توفر الحماية في الفئران بعد L-buthionine- [S، R] -sulfoximine (L-BSO) التسريب، وهذا نموذج من الشلل الرعاش الذي يعوق انتقال الدوبامين الجسم المخطط. 44 ومع ذلك، التحقيق في هذه النماذج من مرض الزهايمر والشلل الرعاش فقط الآثار على المدى القصيرشروط مسبقة ميتة. 43،44 التحقيق في العصبية طويلة الأجل الناجمة عن RHP قد يكون اتجاه المثمر في المستقبل لأغراض البحث. وعلاوة على ذلك، والعصبية الناجمة عن RHP قد تمتد إلى تحسين سلامة BBB في نماذج الفئران من مرض الزهايمر، والتي يمكن تحليلها مع EB 45 إن TTC وEB التحليل المزدوج يكون أكثر فائدة في نموذج باركنسون كما أنه يدفع الآفات العقدة المخططة 46 و BBB اضطراب، 47 التي يمكن قياسها كميا مع TTC 48 و EB، 49 على التوالي. RHP العام هو، نموذج بسيط قوي من شروط مسبقة مع إمكانية متعدية كبيرة كما أنه يدفع فريد طويل الأجل، المضادة للالتهابات، وآثار اعصاب. الكمي المزدوج للTTC وEB كما يمكن تطبيقها بسهولة على الحالات المرضية الأخرى التي تنطوي على اضطراب الميتوكوندريا، موت الخلايا، وتسرب BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
