Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

Abstract

Экспериментальные модели на животных инсульта являются бесценными инструментами для понимания хода патологии и разработке более эффективных стратегий лечения. 2 недели протокол для повторного гипоксического прекондиционирования (RHP) индуцирует долговременную защиту против центральной нервной системы (ЦНС) травмы в мышиной модели координационного ишемического инсульта. ПРЗ состоит из 9 стохастических воздействий к гипоксии, которые изменяются в обоих длительности (2 или 4 ч) и интенсивности (8% и 11% O 2). ПРЗ уменьшает объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) нарушения, и постинсультной воспалительную реакцию в течение недель после последнего воздействия гипоксии, предлагая долгосрочные индукции эндогенного ЦНС защитного фенотипа. Методология двойной количественного объема инфаркта и нарушения BBB является эффективным при оценке нервно-сосудистого защиту у мышей с ПРЗ или других предполагаемых нейропротекторами. Взрослых самцов мышей Swiss Webster были обусловлена ​​ПРЗ или продолжительность эквивалент воздействия до 21% O (т.е. воздуха в помещении). 60 мин временной окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo) индуцировали 2 недели после последней гипоксии. Оба окклюзии и реперфузии были подтверждены транскраниальной лазерной доплеровской флоуметрии. Двадцать два часа после реперфузии, Эванс синий (EB) вводили внутривенно через инъекции в хвостовую вену. 2 ч позже, животные были принесены в жертву изофлурановой передозировки и срезах мозга окрашивали 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC). Инфаркты объемы затем количественно. Далее, ЕВ экстрагировали из ткани более 48 ч, чтобы определить разрушение ВВВ после tMCAo. В целом, RHP является простой протокол, который может быть воспроизведен, с минимальными затратами, чтобы вызвать долгосрочное эндогенного сосудисто-нервный защиту от травм инсульта у мышей, с поступательным потенциала для других ЦНС на основе системных и провоспалительных болезненных состояний.

Introduction

Как ведущий дело взрослых инвалидности и четвертой ведущей причиной смерти, инсульта является одним из самых изнурительных болезненных состояний, стоящих перед взрослое население Соединенных Штатов. 1 животных моделях инсульта позволяют экспериментального исследования новых методов снижения ишемического повреждения и улучшение восстановление после инсульта. Один роман проспект для такого поступательного исследования предварительной подготовки. Предварительная это умышленное использование безвредных стимулов для снижения ущерба от последующего, более тяжелой, травмы. 2 гипоксического прекондиционирования было показано, чтобы произвести плейотропные изменения в головном мозге, которые обеспечивают защиту от инсульта в как в естественных условиях и в пробирке исследования . 3 Тем не менее, при однократном воздействии гипоксии предлагает только краткосрочную нейропротекцию, вызывая меньше 72 ч толерантности в отношении ишемии у взрослых мышей. 4 Даже после четырех недель 14 ч ежедневно воздействия на гипобарической гипоксии, Лин и др. FOунд что нейропротекция лишь поддерживается в течение одной недели. 5 повторяющихся гипоксического прекондиционирования (RHP) характеризуется стохастических изменений в частоте, продолжительности и интенсивности гипоксических воздействий. В отличие от одного вызова предварительной подготовки, ПРЗ индуцирует церебропротективное фенотип, который длится до восьми недель у мышей. 6 ПРЗ сократили объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), нарушения сосудистого воспаления, и лейкоцитов диапедез неделями после окончательного гипоксии , RHP частности уменьшается воспаление в ишемической мозга за счет снижения Т-клеток, моноцитов, макрофагов и популяции, сохраняя популяции В-клеток в ишемической полушарии. 7 В самом деле, RHP индуцированной иммунодепрессивное фенотип у мышей до любого повреждения ЦНС, в том числе инсульта. ПРЗ обработанные В-клетки, выделенные из ПРЗ обработанной здоровых мышей выставлены уникальные противовоспалительное фенотип, с подавлением как презентации антигена и продукции антител.общее снижение провоспалительных адаптивных иммунных механизмов делает ПРЗ отличную методику, чтобы вызвать эндогенный иммунитета не только для ЦНС конкретных воспалительных заболеваний, но и системные травмы или болезни, которые включают модели про-воспалительной патологии.

ПРЗ снижает как объем инфаркта и нарушения ВВВ следующий переходного окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo). Животные модели инсульта, такие как обычно используемые tMCAo, значительно улучшить понимание патофизиологии инсульта, а также разработку более эффективных neurotherapeutics. Во-первых, разработанная Коидзуми и др., В 1986 году, 8 процедура tMCAo это широко используемый метод индукции инсульта у грызунов и одним из предпочтительных методов исследования воспаление после реперфузии. В качестве способов tMCAo развиваться, более недавнее использование силиконовых покрытием волокон дополнительно снизить риск субарахноидального кровоизлияния по сравнению с другими моделями 9,10 </ SUP> и повышения надежности, хотя, к сожалению, часто tMCAo производит широкий разброс в объемах инфаркта. 11-13 Большинство из этих исследований разграничить миокарда регионы корональных срезах мозга с помощью окрашивания 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC), считается золотой стандарт для количественного инфаркта, потому что это простой и недорогой способ позволяет получать яркие, воспроизводимых результатов. TTC служит субстратом дегидрогеназ, присутствующих в митохондриях. При срезах мозга подвергаются раствора TTC, TTC избирательно принимать во живых клеток, где его нерастворимые продукт восстановления, формазана, выпадает в осадок в глубокий красный цвет в жизнеспособных митохондрий. Из-за дисфункции митохондрий в ишемической ткани, эта ткань остается белым, что позволяет дифференциации поврежденной и здоровой ткани. 14

ПРЗ также уменьшает ВВВ нарушения в ишемической полушарии. 6 Таким образом, двойное количественное целостности BBB в той же бДожди, как ТТК основе объема инфаркта определений 15 будет предоставлять полезную информацию о полной эффективности эндогенного защиты, и потенциальные причинно-следственных связей между BBB нарушения и миокарда в необработанных и обработанных животных. Приток периферической крови через нарушается BBB, вторичной по отношению к инсульту, увеличивает популяции лейкоцитов, провоспалительных цитокинов, оксидативный стресс, Вазогенный отек и геморрагической трансформации в ишемической полушарии, в конечном счете, повышения ставок инфекции и смертности у пациентов с ишемическим инсультом . 16,17 распространенным методом измерения нарушения ВВВ на животных моделях через количественного Эванс синий (EB) утечки красителя в мозг. 15,18-21 EB селективно связывается с сывороточным альбумином, шаровидную белок (молекулярная масса = 65 кДа) что не проникает через ГЭБ в неповрежденных животных. 22 После ишемического инсульта, Е.Б. инфильтраты мозг, и флуоресцирует при 620 нм, что позволяет для измерения плотности оптического withiп перфузии паренхимы ранения. 22 Оптическая плотность прямо пропорциональна проницаемости ГЭБ при ЕВ была вымываются из посмертного коркового сосудистой путем transcardiac перфузии. С непосредственной обработки TTC-окрашенных мозга у животных с администрацией Б., как объем инфаркта и нарушение BBB может быть эффективно количественно. Следует отметить, однако, что повреждение нейронов и нарушение BBB не сопутствующие процессы в постинсультной мозга, 23,24, так выбор время умерщвления является важным фактором.

Протокол, который следует подробно метод RHP, метод tMCAo для индукции временного артериальной окклюзии, что модели среднего окклюзии мозговой артерии у больных человека, и двойные гистологические методы определения нейронных и сосудистые конечные точки травмы инсульт. ТТК измеряет гибель клеток и повреждение тканей совокупный, что позволяет для количественного определения общего инфаркта обрычажок, а EB обеспечивает полушария количественного BBB повреждений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в UT Юго-западного медицинского центра, который пребывает Национальными Институтами для Здоровья (NIH) политики для экспериментального использования животных в.

1. Повторяющиеся Гипоксическая Предварительная

  1. Пользовательский дизайн четыре расходомеры на газовых регуляторов и прикрепить к стандартным 15 л индукционных камерах с трубами из ПВХ, чтобы сжатый газ из кислорода (O 2) танки течь в камерах через впускной порт. См оборудования и материалов для более подробной информации о нестандартной конструкции.
  2. Разделите мышей на 2 группы: Серийное Гипоксическая Предварительная (ПРЗ) группа, которая получит воздействия до 8% и 11% O 2, и контрольная группа, которые получают воздействия до 21% O 2 (воздух помещения) одновременно. В Таблице 1 вариаций частоты, интенсивности (8 и 11% O 2, или 21% O 2), и продолжительность (2 или 4 ч) экспозиции ПРЗ. </ LI>
  3. Снимите верхнюю крышку фильтра в каждую клетку и поместите в клетку, с пищей и водой бутылки нетронутыми, в камерах, подключенных к их танков соответствующий O 2. Закрыть и закрепить крышку камеры.
    1. Открыть главный газовый клапан для резервуаров и установить начальный поток для каждого индукции камеры до 2 л в минуту (LPM) в течение первых 5 минут после контакта. Уменьшите расход до 1 LPM для остальной части экспозиции.
    2. В конце экспозиции, уменьшить поток, чтобы до 0 LPM и закройте газовый клапан для резервуаров.
    3. Откройте крышки камеры и заменить фильтр верхнюю крышку на каждую клетку. Поместите клетки, в стандартном корпусе до следующего гипоксии.
  4. Спрей вниз каждой индукционной камеру с НДП (Steris) или эквивалентной дезинфицирующим / дезодорант после каждого использования.
  5. Expose как 21% и RHP мышей, в то же время суток на протяжении двух недель, как описано в таблице 1.

2. ПереходныйСредней мозговой артерии Окклюзия (tMCAo)

  1. См Обсуждение для более подробной информации о сроках инсульта после окончательного воздействия RHP.
  2. Подготовка асептических хирургии рабочее место. Чистый окружающий рабочее с 70% этанол или эквивалентного дезинфицирующих и автоклав всех хирургических инструментов.
    1. Настройте лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) прибор для измерения относительных изменений в мозговой кровоток (CBF). Включите грелку до 37 ° C. Включите инкубатор на 34 ° С.
  3. Обезболить мышей с кратким воздействия смеси 4% изофлуран / 70% NO 2/30% O 2 в небольшом индукции камеры. Подтвердите надлежащие анестезии, слегка зажимая лапу. Если мышь отказывается лапу, вернуть курсор к индукции камеры и продолжают ИФ экспозиции.
  4. Удалить из мышей индукции анестезии камеры и быстро вставить нос мыши в носовом конусе. Откройте подачу газа в носовом конусе, закрывая поток в Anesthesia индукции камера.
    1. Без изменения 70% нет 2/30% O 2 газовой смеси, исправить изофлурана на 1,8%, так как доза для оставшейся процедуры технического обслуживания. Дыхание должно оставаться медленным и регулярно в течение всей процедуры, но если дыхание становится быстрым и поверхностным, увеличить дозу ИФ. Поддерживающая доза может варьировать от изготовления оборудования и животных, используемых в эксперименте.
  5. Использование microshaver, брить волосы на височной области между углом глаза и уха, а также вентральной срединной линии шеи. Удалите излишки меха и применять глазной смазки со стерильным ватным тампоном, чтобы сохранить роговицы от высыхания во время процедуры. Протрите разрез зона с алкоголем колодки и мазок провидон-йода с стерильной ватным тампоном, чтобы сохранить асептические условия.
  6. Администрирование анальгетиков в соответствии с руководящими принципами грызунов хирургических.
  7. Сделать надрез через кожу височной между глазом и ухом.Expose височной мышцы. Использование хирургических микро-ножницы, разрезать височной мышцы связки в височной хребта в районе белого мышц страты.
    1. Аккуратно надавите на мышечную массу в боковом щипцами для визуализации средней мозговой артерии (MCA) через череп. После разреза височной мышцы, область может заполняться кровью. Осторожно используйте ватный тампон, чтобы остановить любого потенциального кровотечения.
    2. Цель кончик зонда СОЛ в области MCA. Запишите выбранный судно, поскольку эта область меняется между мышами.
    3. Держите LDF на месте и на одном уровне с черепом, пока стабильна поток красных кровяных клеток не читать и записывать это значение в качестве базового БФК. Идеально базовый БФК на лазерной доплеровской флоуметрии в> 600 поток, но это будет варьироваться в зависимости от производителя. Если базовый НБВ <400 флюс, запись потока, скорее всего, из соседнего вену, или неполного размещения зонда над целевого сосуда.
  8. После базовой БФК установлено, repositiмыши, чтобы шея подвергается. Поддержите свою голову и держать мышь в стационарном анестезии с головная.
  9. Сделайте срединный разрез брюшной от чуть ниже нижней челюсти к ключице.
    1. Использование щипцов, тупым рассекают все поверхностной фасции, чтобы разоблачить левую общую сонную артерию (CCA). Отделите CCA от соединительной ткани и блуждающего нерва.
    2. Постоянно перевязывать ОСО с 6,0 шелковой нити. Поместите лигирования шов проксимального, как это возможно, чтобы достаточно места для закупорки размещение нити.
    3. Петля и свободно завязать второй шелк 6.0 шов вокруг дистальной ОСО в окклюдируя шва. Будьте осторожны, чтобы не закупоривать артерии, как поглощающий нити впоследствии будет продет через сонную артерию.
    4. Используйте 8 х 2 мм светло-микро serrafine areterial зажим, чтобы зажать дистальных CCA в свободно-связанного шелковой нити. Аккуратно поднимите CCA с пинцетом и сделать небольшой продольный разрез, проксимального к лигирования шва какможно с 3 мм Vännäs.
    5. Автор 12 мм кремния покрытием 6,0 калибра нейлон окклюзии нить через разрез, чтобы войти в просвет артерии, а затем продвигать его несколько мм. Свободно затянуть вторую свободную шелковую нить вокруг кончика окклюзионного нити, чтобы обеспечить кровоток не толкает нить из CCA и удалить артериальной зажим.
    6. На первом бифуркации ОСА в внутренней сонной артерии (ВСА) и наружной сонной артерии (ЭКА), резьба окклюзии нить в правой ветви первого бифуркации, чтобы войти ICA.Advance Окклюзионный нить 9 до 10,5 мм прошлого Второй шов шелковой нитью в левой внутренней сонной артерии (ВСА).
    7. Вскоре после ввода в ICA, продвигать окклюзии нить в левой ветви на втором бифуркации между МКА и pterogopalantine артерии (PPA). Визуализация PPA вряд поэтому продолжайте, пока не почувствуете легкое сопротивление при полном размещении окклюдируя нити.Подъем ICA щипцами может помочь нити, чтобы нить легче в левой ветви второго бифурка ционной. Затяните вторую шелковый шов.
    8. Переверните мышь так разрез над MCA видна. С LDF оборудования, убедитесь, что БФК заблокирован через показания LDF. Успешно окклюзия сокращение от базовой БФК> 80%.
    9. Полностью затяните и дважды узел второй шелковый шов вокруг окклюдируя нити, когда правильное положение достигается. При необходимости, слегка нажать или вытянуть нить окклюзии для достижения критериев CBF для успешного окклюзии (например, сокращение по сравнению с исходным БФК> 80%).
    10. Закройте шеи и головы отверстие с 6,0 нейлоновых швов.
  10. Место мышей в 34 ° C инкубаторе в течение всего срока окклюзии. Рекомендуемая длина окклюзии 60 мин, но это зависит возрастных, процедить зависит от различий в анатомии сосудов головного мозга, 25 и степени injurу лучшего (легкая, умеренная, тяжелая). Убедитесь, что животные в сознание в течение минут от сходит анестезии.
  11. Повторное анестезию животных с изофлуран, как описано на стадии 2.3, 5 мин до конца заранее определенного периода окклюзии, открыть головы разрез и подтвердить, что перфузии MCA до сих пор восстанавливают с использованием транскраниальной показания LDF. Если CBF не достаточно снижается (например, <20% базовой БФК), МСА имеет реперфузии в некоторый момент во время окклюзии и мышь должны быть исключены из дальнейших экспериментов.
  12. Открытие средней линии шеи разрез и свободно связать третий шелковым швом вокруг ОСО, дистальнее второго шелковой нити, но проксимальнее бифуркации CCA для того, чтобы наружную сонную артерию (ECA) остаются жизнеспособными после нить удаляется.
    1. Вырезать или развязать узел, который держит окклюзии нить (то есть второй шелковой нити) и вывести окклюзии нить медленно. После удаления, быстро закрытьТретий шелк нить вокруг ОСО, чтобы минимизировать обратный поток крови из сонной артерии. Дважды узел это шов и закрыть разрез с 6,0 нейлоновых швов.
    2. Расположите мышь, чтобы количественно уровень БФК через 5 мин реперфузии. Успешное реперфузии, как правило, определяется как БФК> 50% от базовой CBF, но, как и окклюзии потока, исследователи могут создать свою собственную критерий. Если животные обладают МК ниже 50% от их базового уровня, то, скорее всего, MCA является «постоянно» окклюзии, и, таким образом, представляет собой еще один критерий исследования исключения.
    3. Закрыть оба разрезы с 6,0 нейлоновых швов. Обеспечить физиологический раствор, обезболивающее (лидокаин), и антибиотики в соответствии с руководящими принципами грызунов. Однако некоторые небольшие дозы антибиотиков (3 мг / кг миноциклин) были признаны нейропротекторное следующего хода. 26
  13. После приходя в сознание в инкубаторе с подогретым после операции, место мышей в чистой стерильной клетке. Обеспечить смоченной FooD или пищевые биологически активные добавки гидратации гелевых и Петри воды, как животные будут ограничены мобильности следующие инсульта. Монитор животных тесно во время восстановления для чрезмерного послеоперационный боли и смерти.

3. Эванс синий (EB) для инъекций

  1. Вводите EB 22 ч после реперфузии и должны циркулировать в крови в течение 2 часов до умерщвления и окрашивание ТТС.
  2. Согласовать решение EB для инъекций (2% EB в физиологическом растворе) и осторожно смешивают при комнатной температуре. Фильтр решение через фильтровальную бумагу или толкать через фильтр 0,2 мкм, прикрепленной к небольшой шприц удаления нерастворенного EB и хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовьте количество EB, необходимое для инъекций (4 мл / кг массы тела) обращают нужное количество краски в 0,3 куб.см инсулиновый шприц с иглой 29 и гарантировать, что решение при комнатной температуре
    1. Задержите курсор с помощью плоскую нижнюю фиксатор. Держите хвост так, чтобы боковая вена УППermost. Боковые вены расположены по обе стороны от осевой линии хвостовой. Держите кончик хвоста, чтобы держать мышь устойчивый для инъекций.
    2. Вставьте иглу в вену около 3,5 мм, стараясь не перфорировать вену. Убедитесь, что игла находится в вене, опираясь обратно на шприц и глядя на следы крови.
    3. Вводят все красителя в течение 1 мин. Если раствор собирается в вену должно быть минимальное сопротивление, как давление приложено к шприцу. Подтверждение успешного системного венозного администрации EB по немедленному изменению цвета в хвосте, конечностей и глаз мыши.
    4. Снимите иглу из хвоста и осторожно применять давление с помощью чистой марлей, чтобы остановить кровотечение.
  4. Начните времени, когда кожа мыши превращается синий. Разрешить EB циркулировать в течение 2 часов, чтобы проникнуть в ослабленной BBB.

4. 2,3,5- трифенилтетразолия хлорид (ТТС) Окрашивание

  • Перфузии и окрашиванию TTC должно происходить через 24 ч после реперфузии.
  • Подготовьте 2% раствор TTC до назначенного времени жертвоприношения. Добавьте 10 г порошка TTC к 500 мл 0,01 М фосфатным буферным раствором (PBS), рН 7,4. Тепло решение до 37 ° С на водяной бане, чтобы облегчить солюбилизирующих в TTC. ВНИМАНИЕ: порошок ТТК и решение кожи, легких и раздражение глаз. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с этими материалами.
    1. После того как порошок полностью не растворится, немедленно передать к бутылке, крышка в фольгу, и хранить при температуре 4 ° С. ТТК и ткани окрашивали ТТК являются светочувствительными.
  • В 24 ч после tMCAo и 2 ч после введения EB, пожертвовать животное с ИФ передозировки в небольшом индукции камеры. Перфузии должны начать сразу же после sacricice для того, чтобы минимизировать автолиза, который начинается в отсутствие кислорода после смерти.
  • Быстро обеспечить животноена платформе пенополистирола с предплечья, закрепленных через лапы. Вырезать боковую разрез через брюшную стенку от средней линии чуть ниже грудной клетки. Аккуратно вырежьте через диафрагму выставить сердце.
    1. Начните перфузии насоса при 5 мл / мин скорости потока с 60 см шприц с ледяной 0,01 М PBS, и подключен к 27 GUAGE крылатый инфузионной иглой. Поместите кончик иглы около 0,5 см в левом желудочке сердца и сократить правое предсердие. Постепенно до венозная кровь не появляется бесцветный разбавляют венозной крови должно течь из предсердия во время перфузии. Транскардиальную заливать 30 мл 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) через сердце.
  • Добавьте 5 мл раствора TTC в прозрачные бутылки 20 сцинтилляционных.
  • Сразу же после перфузии, обезглавить животных и анализировать из мозгов, используя маленькие ножницы и шпателя, если необходимо. Изучите мозги, чтобы исключить животных, которые подверглись субарахноидальное hemorrhaGE в круг Уиллиса, вторичной по отношению к размещению шовного. Убедитесь, что полушарие контралатеральной закупоренной MCA выглядит бледным, без заметного EB утечки или отека.
  • Налейте PBS в акриловой матрицы мозга разработан, чтобы сделать толщиной 1,0 мм корональные разделы мозга мыши. Поместите мозг, спинной стороной вверх, в матрицу и сразу же залить PBS всему мозгу. Держите мозг влажным.
    1. Удалить обонятельной луковицы путем вставки из нержавеющей стали 0,21 мм толщиной лезвия во второй слот от ростральной части матрицы.
    2. Удалить мозжечок, вставив лезвие в четвертом интервале от хвостового стороны матрицы.
    3. Вставьте лезвие в средней слот остальных слотов в матрице. Вставьте остальные ножи, равномерно деля пополам оставшуюся ткань, чтобы обеспечить наиболее равномерное распределение ткани во время нарезки.
    4. После того, как все ножи были вставлены, добавить 1 до 2 капель PBS в мозг, чтобы увлажнить его.
    5. Снимите ножс по одному из матрицы, начиная с ростральной области. Держите первые 7 ломтики для анализа TTC после tMCAo. Используйте маленькую лопаточку, чтобы тщательно передачи ломтики от лезвия к ТТК-заполнены флаконе.
  • После того как все разделы во флаконе, крышка и поместить в теплую ванну воды до тех пор, пока разделы розовеют. Осторожно поверните бутылку в ванной, если это необходимо, чтобы избежать дублирования раздел, который может привести к неравномерному окрашиванию. Затем утилизировать TTC и залить 4% -ный раствор параформальдегида во флакон, чтобы покрыть срезы головного мозга прекратить TTC химическую реакцию.
  • Сразу организовать разделы по чистой 1 "х 3" стекло и ориентировать разделы из ростральнее хвостового.
    1. Когда секции расположены на слайде, сканирование слайдов с использованием стандартного сканера. Установите разрешение в минимум 600 точек на дюйм для анализа изображений. Будьте уверены, чтобы включать в себя имя животного и метрической линейкой в ​​отсканированном изображении.
    2. Переверните слайди сканировать обратную сторону, чтобы обеспечить все данные, собранные.

    • 5. Инфаркт Объем Количественное

    1. Количественно объем инфаркта с помощью программного обеспечения для анализа изображений стандарта (например, ImageJ).
    2. Сканирование изображений с высоким разрешением (например, 600 DPI) для адекватного анализа. Кадрирование изображений. Стандартизация масштаб для всех изображений с использованием метрики правителя входит в отсканированном изображении.
    3. Вычислить общий объем контралатерального полушария, используя следующую формулу. Повторите эту формулу для вычисления общего объема ипсилатерального полушария.
      Сумма общего контралатерального полушария каждого среза толщиной х ломтик
    4. Рассчитать косвенный объем инфаркта. . Контроль за ипсилатеральном отека от инсульта с помощью здорового, контралатеральной полушарии в качестве контроля 27 Используйте следующую формулу для расчета косвенное объем инфаркта:
      Общий объем контралатерального полушария -
      (Всего Volumе ипсилатеральном полушарии -Средняя объем 3 измерений инфаркта)

    6. гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) Честность Количественное

    1. Чтобы подготовиться к EB количественного сначала взвесить 2,5-дюймовый весит лодки. Запишите вес и маркировать две лодки весят для каждого животного: один для ипсилатеральном полушарии и один для контралатеральной полушарии.
    2. После сканирования TTC-окрашенных участков, пополам каждую секцию с одноразовой бритвой в ипсилатеральных и контралатеральной полушарий. Поместите ипсилатеральные полушария из всех 7 секций в весовой лодке и записывать вес. Повторите для противоположной полушарии.
    3. Сразу перенести вес лодки в сушильном шкафу в течение 56 ° С в течение 48 ч.
    4. Взвесьте высушенные участки. Перевести оба полушария в отдельных 1,5 мл микропробирок.
      1. Рассчитать количество формамида, необходимого для каждого полушария (8 мл / г сухого ткани), и добавить к их соответствующим microcentrifugе трубы. Формамид светочувствительных и охватывают все образцы формамида лечение в фольге с этого момента.
      2. Передача микроцентрифужных пробирок, чтобы инкубатор до 56 ° С в течение еще 48 ч.
    5. После 48 ч, пипетки из синий супернатант в другой набор меченых микроцентрифужных пробирках. Нажмите ткани в нижней части трубки, чтобы увеличить объем извлеченного супернатанта. Держите трубки супернатанта и распоряжаться всем ткани.
    6. Подготовьте экспоненциальные серийных разведений EB в формамиде для стандартной кривой. Включайте 1 пустые (формамида только), а затем 10 экспоненциальные решения от 0,125 мкг / мл через 64 ​​мкг / мл EB в формамидом.
      1. Пипетировать 300 мкл разведений, сделанных для стандартной кривой в 96-луночный планшет. Пипетировать 300 мкл супернатанта в соответствующие лунки.
      2. Измеряют поглощение на спектрофотометре при длине волны 620 нм.
      3. Сравнение стандартной кривой разведений EB с поглощения Oе надосадочной образцов. Оптическую плотность прямо пропорциональна целостности BBB.
      4. Предположим, оптическую плотность контралатеральной полушария в качестве фона и использовать формулу (ипсилатерального-контралатеральной) / контралатеральной определить кратное изменение. Для получения более подробной информации о статистическом анализе см Мартин и др., 2010 18

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    В исследование было включено 25 мужчин мышей Swiss Webster, которые были 10-недельного возраста в начале рандомизации в ПРЗ (п = 10) или 21% O 2 (п = 15) группы. Через две недели после последней экспозиции RHP, хирургические процедуры проводились с группами слепым и уравновешенный между дней. После tMCAo, 1 мышь умерла во время послеоперационного восстановления и 1 мышь исключены из исследования, поскольку она не отвечает критерию реперфузии CBF. Оба исключены мышей от 21% O 2 группы. В соответствии с ПРИБУДУТ принципы, 28 Таблица 2 показывает хирургические параметры. Косвенные объемы инфаркта, отек полушария (т.е., отек), и Эванс синий (EB) кровоизлияниями показаны на рисунке 2. Все данные были проанализированы с непарных т-тестов (среднее значение, стандартное отклонение показано), и выбросы обнаружены с ложной Discovery Оценить менее 1% (GraphPad Prism), который удален 4 выбросы (2 от 21%, 2 из ПРЗ) из набора данных EB.

    3) по сравнению с 21% O 2 -обработанной мышей (62,6 ± 42,6 мм 3), но эта разница была не значимая (р = 0.10). Тем не менее, априори анализ питания предсказал необходимую N = 10 в каждой группе, которые мы не достичь с ПРЗ-мышей после выбросы были удалены. Это следует учитывать при проектировании будущих экспериментов, используя ПРЗ. Там не было никакого эффекта ПРЗ на полушария отек, метрика получена из анализа объема TTC, которые могут быть приравнены к отек. 6 ПРЗ-мышей выставлены тенденцию (р = 0,05), в сокращении нарушения BBB в ишемической полушарии, нормированная на контралатеральной полушарии. Рис 2D показывает диапазон значений для EB утечки для обеих групп лечения.

    Фигура 1
    Рисунок 1:. Специально разработанный камеры RHP Верхняя панель изображает заказные расходомеры для индивидуального мониторинга воздушного потока в четырех камерах. Воздух непроницаемой трубки, показана оставляя расходомер и присоединение к впускному отверстию 15 л индукции камеры в нижней панели. Выходное отверстие остается открытым в течение ПРЗ, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха.

    Рисунок 2
    Рисунок 2:.. RHP уменьшает объем инфаркта и BBB нарушение RHP () уменьшает объем инфаркта на 46% по сравнению с контрольными мышами, но имеет (B) не влияет на полушария отек, полученной из данных TTC (С) В тех же животных, RHP уменьшает разрушение ВВВ (р = 0,05), как определено Evans Blue утечки нормированы на контралатеральной полушария. (D) пятна представитель TTC с обеих RHP обработанной и 21% O 2

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Одноразовое воздействие системной гипоксии (то есть, 2 ч 11% O 2) у мышей "временно" защищает мозг от tMCAo, 29 означает эпигенетические ответ на вызов гипоксического прекондиционирования является кратковременным, и базовый фенотип восстанавливается в течение дней. Повторяющиеся презентации гипоксического стимула предварительной подготовки резко увеличить продолжительность нейропротективного фенотипа. 6 Многие исследования показали, что частота, величина и продолжительность повторяющихся стимулов поезда являются критическими факторами, определяющими этот ответ. Например, просто повторяя ту же интенсивность и длительность гипоксии (2 ч 11% кислорода) 3 раза в неделю (MWF) в течение 2 недель не расширяют терапевтическое окно для защиты от нервно-сосудистого tMCAo, 6, но был достаточно, чтобы вызвать длительный Термин ишемическая толерантность в сетчатке. 30 Интересно, что хотя 5 воздействия на системной гипоксии (5 ч 8% О 2 </ Суб>) расположены 6 дней друг от друга защищен от tMCAo индуцированных 3 дня после последнего гипоксии, нейропротекция погиб, если 5 гипоксические воздействия были размещены 3 дней друг от друга. 31 Причина этой разницы остается неясным, но, возможно, было связано с Продолжительность тяжелой гипоксии по отношению к этому протоколу и / или недостаточное время восстановления между гипоксии проблем этого тяжести.

    Короче говоря, титрования повторяющейся гипоксической вызов через доменов частоты, величины и продолжительности, кажется решающее значение для развития толерантности, а не вызывая повреждения, не говоря уже о тканеспецифические и, возможно, видов-специфические эффекты. Например, 3 9 экспозиций ПРЗ подвержен воздействию 8% O 2 в течение 4 ч, хотя 6 ч 8% O 2 индуцирует гибель нейронов гиппокампа. 32 Таким образом, должно быть строгое соблюдение протокола RHP отношении Продолжительность и тяжесть гипоксии воздействия побудить эндогенныеЗащита. Хотя потенциальный эффект циркадного ритма на предварительной подготовки, вызванной защиты нуждается в дополнительном изучении, 33 исполнительское RHP воздействия, в то же время суток для данной когорты снижает риск любого потенциального искажающего эффекта. С точки зрения доза-реакция и эффективности, самый надежный ПРЗ-опосредованной защиты от фокальной инсульта произошло, когда tMCAo было вызвано 2 недели после окончательного гипоксии, 3 в момент, когда ПРЗ лечение здоровых мышей проявляют иммуносупрессивную фенотип (в Отсутствие ишемического повреждения). 7 Этот 2 недели момент времени может не совпадать с периодом максимальной защиты от других острых травм ЦНС, или в других системах органов. Оба протокола ПРЗ, и временные особенности эпигенетической ответ будет, несомненно, должны оптимизацию для каждого нового поступательного использования.

    Одна из самых больших ограничений в порядке, tMCAo является гетерогенным распределение инфаркта VOLumes, как показано на этом представительном наборе данных. Коллатеральное кровообращение обеспечивается Круга Уиллиса, лептоменингиальной анастомозов и спинной залога переходов может привести к несогласованности инфаркта объемов. 34 Вариации между Круга Уиллиса в различных штаммов мышей, а также наличие и проходимости артерий задних общения, 25 , 35 можно дополнительно уменьшить согласованности объемов инфаркта в группах. Прочные размеры выборки и репликации часто необходимо производить убедительные результаты и должны быть включены в конструкцию эксперимента после включения, соответственно. Другие методы индукции инсульта, особенно дистальных координационные ишемические методы, такие как окклюзия основного MCA отрасли через заусенцев отверстие в боковой черепа, или фототромбоза дистальных ветвей СМА, часто производят меньше изменение ударного объема. Фототромботического штрихи ограничены, однако, поскольку они производят одновременно внеклеточный и внутриклеточный отек, phenomenoн не видел в ишемических инсультов у людей. 36 И наоборот, tMCAos более непосредственно применимо к клинической обстановке, более 60% всех инсультов у людей возникают из-за обструкции средней мозговой артерии. 37 И, наконец, анестезия используется во время tMCAo, ИФ , было показано, чтобы побудить нейропротекцию. 38 Для того, чтобы объяснить это нейропротекции, Isoflurane уровни должны быть согласованы между операций, а также между обработанной и необработанной экспериментальных групп, и выдерживали при <3%, чтобы уменьшить свои потенциальные нейропротекторное действие. 39

    Время также имеет важное значение в процессе окрашивания TTC. Хотя есть большой разброс в инсульта литературы о времени, в котором окрашивание ТТС может быть выполнена после ишемии, колеблется от 4 ч до 7 дней после инсульта, 18,40 окрашивание ТТС должно происходить при 24 до 48 часов после инсульта для наиболее последовательные и четко очерченные объемы инфаркта. Объемы инфаркта TTC есть пчелуN Найдено стабилизации 24 ч после инсульта, но после 48 часов, Приток макрофагов в ишемической мозга делает определение объем инфаркта сложно. 14,40 Более того, окрашивание ткани головного мозга с TTC должны следовать непосредственно за жертву. Задержка окрашивание снизит качество окраски из-за увеличения митохондриальной смерти в результате гибели животных, а не инфаркта головного мозга. Подобное увеличение митохондрий смерти будет происходить, если мозг не влажной во время вставки лопастей. Хотя этот протокол наглядно иллюстрирует преимущество инфаркта анализа с окрашиванием TTC, другие иммуногистологические пятна могут быть использованы для количественной оценки объема инфаркта следующую tMCAo. Cresyl фиолетовый или окрашивание фтор-нефрита меньше жесткие требования времени для окрашивания после жертвоприношения, но эти классические пятна требуют очень тонких срезов, полученных криостата или микротоме и, следовательно, требуют больше времени для интегративной суммирования и анализа. 14 Кроме того, эти улAINS не может быть использован в сочетании с EB количественного нарушения BBB, разработанные другими, 15 устраняя возможность непосредственного сравнения между объема инфаркта и целостности BBB в данном мозга. Следует отметить, что ПРЗ обработанных животных, как правило, выставлены розовый, в отличие от чистого белого объемов. 6 Во избежание вымывания инфаркта в RHP-обработанных мышей, мы используем более короткий период, в течение окрашивания ТТС, что приводит к более розовой здоровой ткани, в отличие до темно-красного. Evans Blue обработка может также затемнить область инфаркта, так чисто белые инфаркты являются вряд ли с двойной количественного окрашивания, представленной в этом протоколе.

    Для того чтобы сравнить EB количественную внутри и между группами, все животные должны пройти эквивалентные раз циркуляции для EB. Другие вводят EB сразу после реперфузии и позволил Б. циркулировать в течение 72 ч, 41 или 4 ч после tMCAo чтобы распространить в течение 4 часов, 15 а алтернативае подходы. Количество EB, который пересекает нарушенный ГЭБ и поступает ткани мозга представляет собой неотъемлемую накопление альбуминсвязанного красителя от времени инъекции в момент жертвоприношения. Таким образом, способ, описанный в данной работе, показывает состояние BBB именно в то время между 22 и 24 ч реперфузии, и может пропустить ранних или более поздних отверстий или закрытия барьера. Наоборот, метод, примененный Ван и др. показывает статус BBB в течение 72 ч после инсульта имеют, в том числе обо всех изменениях в состоянии BBB в течение этого времени 3 день после инсульта 42 Ни протокол лучше или хуже. хотя остается риск "пропавших без вести" переходный открытие BBB с помощью раз короче циркуляции, что позволяет исследователям определить конкретные временные особенности BBB патофизиологии и ее сопряжение с другими методами, как показано здесь. Другие сочетании TTC и EB путем введения EB внутрисердечно 1 мин после transcardial перфузии. 18 Тем не менее, это встретилсяХод производится противоречивые результаты и гораздо более сложная процедура, чем с протоколом, описанным выше.

    Одним из наиболее перспективных направлений для будущих ПРЗ является поступательное применение этого протокола предварительной подготовки к другим болезненных состояний. Прерывистые гипоксические воздействия были найдены, чтобы быть защищенными в провоспалительных ЦНС условиях, отличных от ишемии. В крысиной модели болезни Альцгеймера, 2 недели 4 ч ежедневно воздействия на гипобарической гипоксии снижается обесценение удержания памяти и потери корковых нейронов после внутримозговых инъекций бета-амилоида. 43 Периодический гипоксии (2 недели 15 ч ежедневно воздействия на гипобарической гипоксии ) также установлено, что защитная у крыс после L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-БСО) настой, модель Паркинсона, которая ухудшает полосатого тела дофаминергическую передачу. 44 Тем не менее, эти модели болезни Альцгеймера и Паркинсона только исследовали краткосрочные эффектыгипоксического прекондиционирования. 43,44 Исследование долгосрочного нейропротекцию, вызванное ПРЗ может быть плодотворным будущее направление для исследований. Кроме того, нейропротекция индуцируется ПРЗ может распространяться на улучшение целостности BBB в мышиных моделях болезни Альцгеймера, которые могут быть проанализированы с ИК. 45 двойной ТТК и EB анализ будет еще более полезным в модели Паркинсона, как он вызывает полосатого поражений 46 и BBB Разрушение, 47, которые могут быть определены количественно с TTC 48 и EB, 49 соответственно. В целом ПРЗ является простой, но мощный форма предварительной подготовки с большим потенциалом поступательного как это однозначно вызывает долгосрочные, противовоспалительное и нейропротекторное действие. Двойной количественное ТТК и EB также может быть легко применены к другим болезненных состояний, которые связаны митохондриальной нарушения, гибель клеток, и утечки ВВВ.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Flowmeters, regulators VetEquip, Inc Specialty order Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
    21% O2 tank AirGas OX USP200
    11% O2 tank AirGas Specialty order
    8% O2 tank  AirGas Specialty order
    15 L induction chambers VetEquip 941454
    Moor Laber Dopper Flow  Moor Instruments  moorVMS-LDF1-HP 0.8 mm diameter probe 
    High Intensity Illuminator  Nikon NI-150
    Zoom Stereo Microscope  NIkon SMZ800 Other surgical microscopes may be used. 
    Kent Scientific Right Temperature CODA Kent Scientific Corporation Discontinued Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
    Hovabator Incubator Stromberg's 2362-E Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
    V010 Anesthesia system  VetEquip 901807 Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
    250 ml isoflurane  Butler Schein NDC-11695
    D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer  Andis  #23905 Replacement blades are available from Andis (#23995)
    Betadine  Fisher Scientific 19-898-867 
    Q-tips Multiple sellers  Catalog number not available 
    Gauze Pads Fisher Scientific 67622
    Surgical drape Fisher Scientific GM300 
    Silk Sutures  Look/Div Surgical Specialties SP115
    Nylon Sutures Look/Div Surgical Specialties SP185
    Durmont #5 forceps (2)  Fine Science Tools  11251-35 Angled 45°
    Surgical Scissors Fine Science Tools  14028-10
    3 mm Vannas Kent Scientific Corporation INS600177 Straight blade
    Hartman Hemostats  Fine Scientific Tools 13002-10
    Occluding filaments Washington University Specialty order Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
    Evans Blue Sigma Aldritch E2129-10G
    Filter Paper  Sigma Aldritch WHA1001150 150 mm, circles, Grade 1 
    Weigh Boats Fisher Scientific 02-202-101 2.5" diameter
    0.9% Sodium Chloride Injection USP  Baxter Pharmaceutics  2B1321
    0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle Becton Dickinson Labware 309301
    Flat bottom restrainer  Braintree Scientific  FB M 2.0" diameter
    TTC Sigma T8877
    10x PBS, pH 7.4 Fisher Scientific BP399-20
    Water Bath Multiple sellers  Catalog number not available  Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
    Styrofoam board Multiple sellers  Catalog number not available 
    Large Syringe Kit PumpSystems Inc P-SYRKIT-LG
    Perfusion Pump PumpSystems Inc NE-300 
    60 cc syringe Fisher Scientific NC9203256
    27 gauge winged infusion set Kawasumi Laboratories, Inc D3K1-25G 1
    20 ml scintillation vial Fisher Scientific 50-367-126
    Stainless steel spatula Fisher Scientific 14-373-25A
    Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal CellPoint Scientific  Catalog number not available 
    0.21 mm stainless steel blades, 25 pk CellPoint Scientific  Catalog number not available  Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
    4% paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology  SC-281692
    Superfrost microscope slides  Fisher Scientific 12-550-15
    HP Scanjet G4050 Multiple sellers  Catalog number not available  Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
    ImageJ  National Institute of Health Catalog number not available 
    Analytical Balance Mettler Toledo  XSE 205U
    Precision Compact Oven   Thermo Scientific  PR305225M
    1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) Denville Scientific  C2170
    Formamide Fisher Scientific BP228-100
    96-well plates Fisher Scientific 07-200-9
    Epoch Microplate Spectrophotometer  BioTek  Catalog number not available 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
    2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
    3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
    4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
    5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
    6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
    7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
    8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
    9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
    10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
    11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
    12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
    13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
    14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
    15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
    16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
    17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
    18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
    19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
    20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
    21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
    22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
    23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
    24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
    25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
    26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
    27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
    28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
    29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
    30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
    31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
    32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
    33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
    34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
    35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
    36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
    37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
    38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
    39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
    40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
    41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
    42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
    43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
    44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
    45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
    46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
    47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
    48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
    49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

    Tags

    Медицина выпуск 99 гипоксия предварительной подготовки временной окклюзии средней мозговой артерии инсульт нейропротекция нарушение гематоэнцефалический барьер
    Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M.,… More

    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M., Ortega, S. B., Plautz, E. J., Kong, X., Gidday, J. M., Stowe, A. M. Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (99), e52675, doi:10.3791/52675 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter