Abstract
Experimentella djurmodeller för stroke är ovärderliga verktyg för att förstå stroke patologi samt utveckla effektivare behandlingsstrategier. En 2 vecka protokoll för repetitiva hypoxisk prekonditionering (RHP) inducerar långtidsskydd mot centrala nervsystemet (CNS) skada i en musmodell av fokal ischemisk stroke. RHP består av nio stokastiska exponeringar mot hypoxi som varierar i både varaktighet (2 eller 4 timmar) och intensitet (8% och 11% O2). RHP minskar infarktvolymer, blod-hjärnbarriären (BBB) störningar, och den post-stroke inflammatoriskt svar i veckor efter den sista exponeringen för hypoxi, vilket tyder på en långsiktig induktion av en endogen CNS-skyddande fenotyp. Metoden för den dubbla kvantifiering av infarktvolymen och BBB störningar är effektiv vid bedömningen neurovaskulära skydd hos möss med RHP eller andra förmodade neuroprotectants. Vuxna manliga Schweiziska Webster möss förbehandlas med RHP eller löptid motsvarande exponeringar mot 21% O
Introduction
Som den ledande orsaken till vuxen funktionshinder och den fjärde vanligaste dödsorsaken är stroke en av de mest försvagande sjukdomstillstånd inför den vuxna befolkningen i USA. 1 Djurmodeller av stroke möjliggör experimentella undersökningar av nya metoder för att minska ischemisk skada och förbättra efter stroke återhämtning. En ny väg för en sådan translationell forskning prekonditionering. Förbehandling är avsiktlig användning av ett icke-skadliga stimulans för att minska skadorna från en efterföljande, och allvarligare, skada. 2 hypoxisk prekonditionering har visat sig ge pleiotropiska förändringar i hjärnan som ger skydd mot stroke både in vivo och in vitro-studier . 3 emellertid en enda exponering för hypoxi erbjuder endast kortsiktiga neuroprotektion, förmå mindre än 72 timmar av tolerans mot ischemi hos vuxna möss. 4 Även efter fyra veckor av 14 tim daglig exponering till hypobaric hypoxi, Lin et al. found att neuroprotektion endast upprätthållas under en vecka. 5 Upprepad hypoxisk prekonditionering (RHP) kännetecknas av stokastiska variationer i frekvens, varaktighet och intensitet hypoxiska exponeringar. I motsats till en enda förkonditionering utmaning, RHP inducerar en cerebroprotektiva fenotyp som varar upp till åtta veckor i möss. 6 RHP minskad infarktvolymer, blod-hjärnbarriären (BBB) störningar, inflammation i blodkärlen, och leukocyter diapedes för veckor efter den sista hypoxisk exponering . RHP särskilt minskad inflammation i den ischemiska hjärnan genom att minska T-cell, monocyt- och macrophage populationer, medan B-cellspopulationer bibehålla den ischemiska hemisfären. 7 I själva verket, RHP inducerade en immunsuppressiv fenotyp i möss innan någon CNS-skada, inklusive stroke. RHP-behandlade B-celler isolerade från RHP-behandlade friska möss uppvisade en unik anti-inflammatorisk fenotyp, med en nedreglering av både antigenpresentation och antikroppsproduktion. Dentotal minskning av proinflammatoriska adaptiva immunmekanismer gör RHP en utmärkt metod för att inducera endogen immunosuppression för att inte bara CNS-specifika inflammatoriska sjukdomar, men även system skada eller sjukdom modeller som inkluderar en pro-inflammatorisk patologi.
RHP minskar både infarktvolymen och BBB störningar till följd av en övergående mellersta cerebral artärocklusion (tMCAo). Djurmodeller av stroke, såsom vanligen används tMCAo, dramatiskt förbättra förståelsen av patofysiologi av stroke, liksom utformningen av mer effektiva NeuroTherapeutics. Första utvecklats av Koizumi et al., 1986, är en allmänt använd metod för att inducera stroke hos gnagare och en av de vanligaste metoderna för att undersöka inflammation efter reperfusion 8 tMCAo förfarandet. Metoderna för tMCAo utvecklas, den nyare användning av silikonbelagda filamenten ytterligare minska risken för subarachnoid blödning jämfört med andra modeller 9,10 </ Sup> och förbättra tillförlitligheten, men tyvärr tMCAo ger ofta en stor variation i infarktvolymer. 11-13 De flesta av dessa studier avgränsa infarkt regioner i koronala hjärnan sektioner genom färgning med 2,3,5- trifenyltetrazoliumklorid (TTC), anses vara en guldmyntfoten för infarkt kvantifiering, eftersom det är ett enkelt och billigt sätt att producera levande, repliker resultat. TTC tjänar som ett substrat av dehydrogenaser som finns i mitokondrier. När hjärnsnitt exponeras för TTC lösningen, TTC selektivt tas in i levande celler, där dess icke-lösliga reduktionsprodukt, formazan, utfälls till en djup röd färg i livskraftiga mitokondrier. På grund av mitokondriell dysfunktion i ischemisk vävnad, denna vävnad förblir vitt, vilket möjliggör differentiering av skadad och frisk vävnad. 14
RHP minskar också BBB störningar i den ischemiska hemisfären. 6 Därför dubbla kvantifiering av BBB integritet inom samma bregn som TTC-baserade infarktvolymen bestämningar 15 skulle ge värdefull information om den fullständiga effekten av endogen skydd, och potentiella orsakssamband mellan BBB störningar och infarkt i obehandlade och behandlade djur. Inflödet av perifert blod genom en störd BBB, sekundärt till stroke ökar leukocytpopulationer, pro-inflammatoriska cytokiner, oxidativ stress, vasogent ödem och hemorragisk omvandling i den ischemiska hemisfären, i slutändan öka antalet infektioner och dödlighet hos patienter med ischemisk stroke . 16,17 En vanlig metod för mätning av BBB-störningar i djurmodeller är genom kvantifiering av Evans-blått (EB) färgämne läcka in i hjärnan. 15,18-21 EB binds selektivt till serumalbumin, ett globulärt protein (MV = 65 kDa) som inte korsar BBB i oskadade djur. 22 Efter ischemisk stroke, infiltrerar EB hjärnan, och fluorescerar vid 620 nm, vilket möjliggör mätning av optisk densitet within perfusion skadade parenkym. 22 Den optiska densiteten är direkt proportionell mot permeabiliteten hos BBB när EB har tvättats ut ur den efter slakt kortikala vaskulaturen genom transkardial perfusion. Med omedelbar behandling av TTC-färgade hjärnor hos djur med EB administration, kan både infarktvolymen och BBB störningar effektivt kvantifieras. Det bör emellertid noteras, att neuronal skada och BBB störningar inte är samtidiga processer i efter stroke hjärnan, 23,24 så valet av tidpunkten för avlivandet är en viktig faktor.
Protokollet som följer detaljer RHP metoden, tMCAo metod för att inducera en tillfällig artärocklusion som modeller mitten cerebral artär ocklusion hos människor, och de dubbla histologiska metoder för att bestämma neurala och vaskulära stroke skada endpoints. TTC mäter celldöd och kumulativ vävnadsskada, vilket möjliggör kvantifiering av en övergripande infarkt volume, medan EB föreskrivs hemisfäriska kvantifiering av BBB skador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid UT Southwestern Medical Center som står fast vid National Institutes for Health (NIH) policy för försöksdjursanvändningen.
1. Repetitiva Hypoxisk Förkonditionering
- Custom design fyra flödesmätare på gasregulatorer och bifoga standard 15 L induktionskammare med PVC-rör för att tillåta komprimerad gas från syre (O 2) tankar att flyta in i kamrarna via en inloppsöppning. Se utrustning och material för mer information om anpassad design.
- Dela möss i 2 grupper: Upprepande hypoxisk Förkonditionering (RHP) Group, som tar emot exponeringar mot 8% och 11% O2, och kontrollgruppen, som tar emot exponering för 21% O 2 (rumsluft) samtidigt. Se tabell 1 för variationerna i frekvens, intensitet (8 och 11% O2 eller 21% O 2), och varaktigheten (2 eller 4 timmar) i RHP exponeringar. </ Li>
- Ta bort det översta filtret locket på varje bur och placera buren, med mat och vattenflaskor intakta, i kamrarna är anslutna till sina respektive O 2 tankar. Stäng och säkra locket hos kammaren.
- Öppna huvud gasventil för tankarna och ställ den ursprungliga flödet för varje induktionskammare till 2 L per minut (LPM) för de första fem minuter av exponering. Minska flödet till 1 LPM under återstoden av exponeringen.
- Vid slutet av exponerings, minska flödet till 0 LPM och stänga gasventilen för tankarna.
- Öppna kammarlocken och byt filter topp lock på varje bur. Placera burar i standardhuset tills nästa hypoxisk exponering.
- Spraya ner varje induktionskammare med NPD (Steris) eller motsvarande desinfektionsmedel / deodorizer efter varje användning.
- Exponera både 21% och RHP möss vid samma tid på dagen under loppet av två veckor, såsom beskrivits i tabell 1.
2. ÖvergåendeMiddle Cerebral artärocklusion (tMCAo)
- Se diskussion för mer information om tidpunkten för stroke efter slut RHP exponering.
- Förbered en aseptisk kirurgi arbetsplats. Rengör omgivande arbetsplats med 70% etanol eller motsvarande desinfektionsmedel och autoklav alla kirurgiska verktyg.
- Ställ in Laser Doppler Flowmetry (LDF) instrument för att mäta relativa förändringar i cerebralt blodflöde (CBF). Sätt på värmeplattan för att 37 ° C. Slå på inkubatorn till 34 ° C.
- Söva möss med en kortvarig exponering för en blandning av 4% isofluran / 70% NO2 / 30% O 2 i en liten induktion kammare. Bekräfta korrekt anestesi genom att lätt nypa tassen. Om musen drar tillbaka sin tass tillbaka musen till induktionskammare och fortsätta isofluran exponering.
- Ta möss ur narkosen induktionskammare och snabbt sätta in musens näsan i noskonen. Öppna gasflödet till noskonen, stänga av flödet till anesThesia induktionskammare.
- Utan att ändra den 70% NO2 / 30% O 2 gasblandningen, fixa isofluran på 1,8% som underhållsdosen för resten av förfarandet. Andningen bör förbli långsam och regelbunden under hela förfarandet men om andningen blir snabb och ytlig, öka isofluran dosen. Underhållsdosen kan variera mellan utrustning tillverkning och djur som används i experimentet.
- Med användning av en microshaver, raka håret på tinningsområdet mellan hörnet av ögat och örat liksom ventrala mittlinjen av halsen. Ta bort överflödigt päls och tillämpa okulär smörjmedel med en steril bomullspinne för att hålla hornhinnor från att torka ut under förfarandet. Torka snitt med spritsuddar och svabb providon-jod med en steril bomullspinne för att upprätthålla aseptiska förhållanden.
- Administrera analgetika enligt gnagare kirurgiska riktlinjer.
- Gör ett snitt genom den tidsmässiga hud mellan ögat och örat.Exponera temporalis muskel. Använda kirurgiska mikro-sax, klippa temporala muskeln ligament på den temporala åsen inom området vita muskel strimmor.
- Tryck försiktigt muskeln bulk i sidled med pincett för att visualisera mitten cerebral artär (MCA) genom skallen. Efter snitt i den temporala muskeln, kan området fylls med blod. Använd försiktigt en bomullspinne för att hårdnackad eventuella blödningar.
- Rikta den LDF sondens spets till MCA området. Spela fartyget valda eftersom detta område varierar mellan möss.
- Håll LDF på plats och i jämnhöjd med skallen tills en stabil röda blodkroppar flödet läsa och registrera detta värde som baslinje CBF. Perfekt baslinjen CBF på en laser Doppler Flowmetry är> 600 flux, men detta kommer att variera med tillverkaren. Om utgångsvärdet CBF är <400 flux, är mest sannolikt från en närliggande ven eller en ofullständig placering av sonden över målkärlet flödes inspelningen.
- Efter baslinjen CBF är etablerad, repositipå musen så att halsen exponeras. Stöd huvudet och hålla musen under stationära anestesi från noskonen.
- Gör en ventrala mittlinjen snitt från strax under käken till nyckelbenet.
- Använd pincett, trubbig dissekera alla ytliga fascia att exponera vänster gemensamma halspulsådern (CCA). Separera CCA från bindväv och vagusnerven.
- Permanent ligera CCA med 6,0 silkessutur. Placera ligering sutur som proximal som möjligt för att ge tillräckligt utrymme för ockluderande glöd placering.
- Loop och löst knyta en andra siden 6,0 sutur runt CCA distalt blockeringen sutur. Var noga med att inte täppa till artären som blockeringen glöd senare kommer att träs genom halspulsådern.
- Använd en 8 x 2 mm ljusmikro serrafine areterial klämma till klämma CCA distalt den löst bundna silkessutur. Lyft försiktigt CCA med pincett och göra en liten längsgående snitt, som proximal till ligerande sutur sommöjligt med 3 mm Vannas.
- Trä en 12 mm kisel-belagd 6,0 gauge nylon ockluderande tråden genom snittet för att komma in i artären lumen, och sedan avancera det några mm. Dra åt den andra lös silkesutur runt spetsen av den ockluderande filamentet för att säkerställa blodflöde driva inte glödtråden ut ur CCA och avlägsna den arteriella klämman.
- Vid den första förgreningen av CCA i den inre halspulsådern (ICA) och den yttre halspulsådern (ECA), trä blockerande filament i den högra delen av den första förgreningen att ange ICA.Advance blockeringen tråden 9-10,5 mm förbi den andra silkesutur in i den vänstra inre halsartären (ICA).
- Strax efter att ICA, avancera blockeringen tråden i den vänstra grenen på andra förgreningen mellan ICA och pterogopalantine artären (PPA). Visualisering av PPA är osannolikt så vidare tills du känner en mild motstånd med full placeringen av blockeringen filament.Lyfta ICA med pincett kan hjälpa tråden att gänga lättare i den vänstra delen av den andra birfurcation. Dra åt andra silkessutur.
- Vänd musen så snittet över MCA är synlig. Med LDF utrustning, bekräfta att CBF är blockerad genom LDF avläsningar. En framgångsrik ocklusion är en minskning> 80% från baseline CBF.
- Helt skärpa och dubbelknut andra silkesutur runt blockeringen tråden när rätt läge uppnås. Om det behövs, något trycka in eller dra ut ockluderande tråden för att uppnå CBF kriterier för ett framgångsrikt ocklusion (t.ex.> 80% minskning från baslinjen CBF).
- Stäng halsen och huvudet öppning med 6,0 nylonsuturer.
- Placera möss i 34 ° C inkubator under den tid ocklusionen. Rekommenderad längd ocklusion är 60 minuter, men det varierar för ålder, stamberoende skillnader i cerebrovaskulär anatomi, 25 och omfattningen av injury önskas (mild, måttlig, svår). Se till att djur återfår medvetandet inom minuter av lossnar anestesi.
- Åter söva djuren med isofluran, som beskrivs i steg 2,3, 5 minuter före slutet av den fördefinierade ocklusion period, öppna hårbotten snitt och bekräfta att MCA perfusion fortfarande reduceras med hjälp av transkraniell LDF avläsningar. Om CBF inte är tillräckligt reducerad (t.ex. <20% baslinjen CBF) har MCA reperfuseras någon gång under ocklusion och musen bör undantas från ytterligare experiment.
- Öppna mittlinjen hals snitt och löst knyta en tredje silkessutur runt CCA, distalt till den andra silkesutur men proximalt CCA bifurkationen för att säkerställa att den yttre halsartären (ECA) kommer att förbli livsdugliga efter att glödtråden avlägsnas.
- Klipp eller knyta upp knuten som håller ockluderande tråd (dvs. andra silkessutur) och dra blockeringen glöd långsamt. Efter uttagningen snabbt stängatredje silkessutur runt CCA att minimera återflöde av blod från ICA. Dubbel knut denna sutur och stänga snittet med 6,0 nylonsuturer.
- Flytta musen för att kvantifiera nivån av CBF efter 5 minuter av reperfusion. Framgångsrik reperfusion definieras allmänt som en CBF av> 50% av baslinjen CBF, men som med ocklusion flöde, kan utredarna etablera sin egen kriterium. Om djur uppvisar en CBF under 50% av deras baslinjen, är det troligt MCA är "permanent" tilltäppt, och utgör därmed en annan studie uteslutningskriterium.
- Stäng båda snitt med 6,0 nylonsuturer. Ge saltlösning, bedövningsmedel (Lidocaine), och antibiotika enligt gnagare riktlinjer. Men några små doser av antibiotika (3 mg / kg av minocyklin) har visat sig vara neuroprotektiv efter stroke. 26
- Efter att ha återupprättat medvetandet i den uppvärmda inkubatorn efter operation, placera möss i en ren, steril bur. Tillhandahålla fuktat food eller näringshydrakost gel kompletterar och en petriskål av vatten som djuren kommer att ha begränsad rörlighet efter stroke. Övervaka djur noga under återhämtning för överdriven postoperativ smärta och död.
3. Evans Blue (EB) Injektion
- Spruta EB 22 timmar efter reperfusion och bör cirkulera i blodet under 2 timmar före avlivning och TTC färgning.
- Gör en EB lösning för injektion (2% EB i saltlösning) och blanda försiktigt vid rumstemperatur. Filter lösningen genom filterpapper eller driva igenom en 0,2 ìm filter fäst vid en liten spruta för att avlägsna olöst EB och förvara vid rumstemperatur.
- Förbered mängden EB som behövs för injektion (4 ml / kg kroppsvikt) Rita den önskade mängden färgämne i en spruta 0,3 ml insulin med en 29 gauge nål och se till att lösningen är rumstempererad
- Hindra musen med flat botten som hindrar. Håll svansen så att den laterala ven är uppermost. Sido vener är placerade på vardera sidan av centrum svansen. Håll svansspetsen för att hålla musen stadig för injektion.
- Stick in nålen i venen ungefär 3,5 mm, försiktigt så att inte perforera venen. Kontrollera att nålen är i venen genom att dra tillbaka på sprutan och letar efter spår av blod.
- Injicera alla av färgämnet under loppet av 1 minut. Om lösningen kommer in i venen det bör vara minimal resistans som tryck appliceras på sprutan. Bekräfta framgångsrik systemisk venös administrering av EB från en omedelbar färgförändring i svansen, armar och ben, och ögon musen.
- Ta bort nålen från svansen och tryck försiktigt med rent kompress för att stoppa blödning.
- Börja timing när musen hud blir blå. Låt EB cirkulera under 2 timmar för att penetrera den försvagade BBB.
4. 2,3,5- trifenyltetrazoliumklorid (TTC) Färgning
- När pulvret har lösts upp, omedelbart överföra till en flaska, täcka i folie, och förvara vid 4 ° C. TTC och vävnad färgas med TTC är ljuskänsliga.
- Starta perfusionen pumpen vid 5 ml / min flödeshastighet med en 60 ml spruta fylld med iskall 0,01 M PBS och anslöts till en 27 gauge vingförsedd infusionsnål. Placera nålspetsen ca 0,5 cm i den vänstra ventrikeln av hjärtat och skär det högra förmaket. Gradvis utspädd venöst blod ska flöda ut ur förmaket under perfusion tills venöst blod visas färglös. Transcardially BEGJUTA 30 ml 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom hjärtat.
- Ta bort de lukt glödlampor genom att sätta in en rostfri 0,21 mm tjockt blad i den andra slitsen från den rostrala sidan av matrisen.
- Avlägsna cerebellum genom att föra in ett blad i den fjärde slitsen från svanssidan av matrisen.
- Sätt i ett blad genom mellanskåran av de återstående spåren i matrisen. Sätt de återstående bladen, jämnt tudelar den återstående vävnaden att säkerställa den mest jämn fördelning av vävnad under skivningen.
- När alla knivarna har förts in, tillsätt 1 till 2 droppar av PBS till hjärnan för att fukta den.
- Ta bladets en i taget från matrisen börjar med rostralt regionen. Håll de första 7 skivor för TTC analys efter tMCAo. Använd en liten spatel för att noggrant överföra skivorna från bladet till TTC-fyllda flaskan.
- När sektionerna är anordnade på bilden, scanna bilden med en vanlig skanner. Ställ in upplösning på minst 600 dpi för bildanalys. Var noga med att inkludera namnet på djuret och en metrisk linjal i den skannade bilden.
- Vänd över bildenoch skanna baksidan för att säkerställa att alla data som samlats in.
5. infarktvolymen Kvantifiering
- Kvantifiera infarktvolymen med hjälp av en standardbildanalysmjukvara (t.ex. ImageJ).
- Skanna bilder på en hög upplösning (t.ex. 600 dpi) för adekvat analys. Beskära bilder. Standardisera skala för alla bilder som använder metriska härskare som ingår i den skannade bilden.
- Beräkna den totala volymen av den kontralaterala hemisfären med användning av följande formel. Upprepa denna formel för att beräkna den totala volymen av den ipsilaterala hemisfären.
Summan av totalt kontralaterala hemisfären av varje skiva x snittjocklek - Beräkna den indirekta infarktvolymen. . Kontroll för ipsilateral ödem av stroke genom att använda friska, kontralaterala hemisfären som kontroll 27 Använd följande formel för att beräkna den indirekta infarktvolymen:
Total volym av kontralaterala hemisfären -
(Total volume av ipsilaterala halvklotet -Genomsnittlig volym 3 mätningar av infarkt)
6. blod-hjärnbarriären (BBB) Integrity Kvantifiering
- För att förbereda sig för EB kvantifiering, först väger 2,5 tum väger båtar. Notera vikten och märka två väga båtar för varje djur: en för den ipsilaterala halvklotet och en för kontralaterala hemisfären.
- Efter avsökning av TTC-färgade sektioner Bisect varje avsnitt med en engångs rakblad i ipsilaterala och kontrahalvklotet. Placera ipsilaterala halvkloten från alla 7 avsnitt i en väga båt och notera vikten. Upprepa för kontralaterala hemisfären.
- Överför omedelbart vikt båtar till en ugn set till 56 ° C under 48 timmar.
- Väg den torkade sektionerna. Överför de båda halvkloten i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Beräkna mängden formamid som behövs för varje hemisfär (8 ml / g av torr vävnad), och lägga till sin respektive microcentrifuge rör. Formamid är ljuskänslig och omfattar alla formamid behandlade prover i folie från denna punkt framåt.
- Överför mikrocentrifugrör till en inkubator inställd på 56 ° C under ytterligare 48 timmar.
- Efter 48 timmar, pipett ut den blå supernatanten i en annan uppsättning av märkta mikrocentrifugrör. Tryck vävnad till botten av röret för att maximera volymen av extraherat supematant. Håll rören supernatant och avyttra all vävnad.
- Förbered exponentiella serieutspädningar av EB i formamid för standardkurvan. Inkludera en blank (formamid) och sedan 10 exponentiella lösningar från 0,125 ug / ml genom 64 ug / ml EB i formamid.
- Pipettera 300 | il av de spädningar som gjorts för standardkurvan in i en 96-brunnsplatta. Pipettera 300 | il av supernatanten i motsvarande brunnar.
- Mät absorbansen på en spektrofotometer vid 620 nm.
- Jämför standardkurvan av EB utspädningar med absorbansen of supernatantlösningarna prover. Den optiska densiteten är direkt proportionell mot integriteten hos BBB.
- Antag den optiska densiteten hos den kontralaterala hemisfären som bakgrund och använda formeln (ipsilateral-kontralateralt) / kontra att bestämma faldig förändring. För ytterligare information om statistisk analys se Martin et al., 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie ingick 25 manliga Schweiziska Webster-möss som var 10 veckor gamla vid början av randomisering till RHP (n = 10) eller 21% O 2 (n = 15) grupper. Två veckor efter den sista RHP exponering, har kirurgiska ingrepp utförs med grupper förblindade och motvikts mellan dagar. Efter tMCAo, dog 1 mus under postoperativ återhämtning och 1 mus uteslöts från studien eftersom det inte uppfyller reperfusion CBF kriteriet. Båda uteslutna möss från O2-gruppen 21%. I enlighet med ARRIVE riktlinjer, 28 Tabell 2 visar kirurgiska parametrar. Indirekta infarkt volymer, hemisfärisk svall (dvs. ödem) och Evans-blått (EB) extravasering visas i figur 2. Samtliga data analyserades med oparade t-test (medelvärde, standardavvikelse visad) och extremvärden detekteras med ett falskt Discovery Rate mindre än 1% (Graphpad prisma), som tog bort 4 extremvärden (2 från 21%, 2 från RHP) från EB datamängden.
3) jämfört med 21% O 2 behandlad möss (62,6 ± 42,6 mm 3), men denna skillnad var inte signifikant (p = 0,10). Men förutspådde en a priori maktanalys ett obligatoriskt n = 10 per grupp, som vi inte uppnå med RHP-behandlade möss efter extremvärden togs bort. Detta bör beaktas vid utformningen av framtida experiment med RHP. Det fanns ingen effekt av RHP på hemisfärisk svullnad, en måttenhet som härrör från volymanalys TTC som kan jämställas med ödem. 6 RHP-behandlade möss uppvisade en trend (p = 0,05) i en minskning av BBB störningar inom den ischemiska hemisfären normaliserad till den kontralaterala hemisfären. Figur 2D visar en rad värden för EB läcka för båda behandlingsgrupperna.
Figur 1:. Skräddarsydda RHP kammare Övre panel skildrar skräddarsydda flödesmätare för individuell övervakning av luftflödet i upp till fyra avdelningar. Luftogenomträngligt slangen visas lämnar flödesmätaren och fästa till inloppsporten hos 15 L induktionskammare i den undre panelen. Utloppsporten förblir öppen under RHP att tillåta luftcirkulation.
Figur 2:.. RHP minskar infarktvolymer och BBB störningar RHP (A) minskar infarktvolymer med 46% jämfört med kontrollmöss, men har (B) ingen inverkan på hemisfäriska svullnad härrör från TTC data (C) i samma djur, RHP minskar BBB störningar (p = 0,05) enligt definitionen i Evans Blue läcka normaliserad till kontralaterala hemisfären. (D) representant TTC fläckar från både RHP-behandlade och 21% O 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enda exponering för system hypoxi (dvs 2 timmar av 11% O 2) i möss "övergående" skyddar hjärnan från tMCAo, 29 vilket innebär att epigenetiska svar på hypoxisk prekonditionering utmaningen är kortvariga och baslinjen fenotypen återställs inom dagar. Upprepade presentationer av hypoxisk prekonditionering stimulans sträcker sig dramatiskt den tid som neuroprotektiva fenotypen. 6 Många studier har visat att frekvensen, omfattningen och varaktigheten av den repetitiva stimulans tåg har en avgörande betydelse i detta svar. Till exempel, helt enkelt upprepa samma intensitet och varaktighet hypoxi (2 timmar av 11% syre) 3 gånger per vecka (MWF) mer än 2 veckor inte förlänga det terapeutiska fönstret för neurovaskulära skydd mot tMCAo, 6 men var tillräcklig för att inducera lång- Uttrycket ischemisk tolerans i näthinnan. 30 Intressant, även om 5 exponeringar mot systemisk hypoxi (5 tim på 8% O 2 </ Sub>) placerade 6 dagars mellanrum skyddas mot tMCAo inducerade 3 dagar efter den sista hypoxisk exponering, neuro förlorades om 5 hypoxiska exponering placerades 3 dagars mellanrum. 31 Orsaken till denna skillnad är fortfarande oklart, men kan ha berott på varaktigheten av svår syrebrist i förhållande till detta protokoll och / eller otillräcklig återhämtningstid mellan hypoxiska utmaningar denna svårighetsgrad.
Kort sagt, titrering av repetitiva hypoxisk utmaningen över områdena frekvens, omfattning och varaktighet, verkar avgörande för utvecklingen av tolerans utan att framkalla skada, för att inte tala vävnadsspecifika och kanske artspecifika effekter. Till exempel, 3 av 9 i RHP exponeringar innebär exponering för 8% O2 under 4 timmar, men 6 timmar på 8% O2 inducerar hippocampus neuronal död. 32 Därför måste det finnas en strikt anslutning till RHP-protokollet när det gäller varaktighet och svårighetsgrad av hypoxiska exponeringar att inducera endogenskydd. Även den potentiella effekten av dygnsrytmen på prekonditionering-inducerad skydd behöver ytterligare prospektering, 33 utför RHP exponeringar vid samma tid på dagen för en viss kohort minskar risken för eventuella confounding effekt. I termer av dos-respons och effekt, uppträdde den mest robusta RHP-medierat skydd från fokal stroke när tMCAo inducerades 2 veckor efter den slutliga hypoxisk exponering, 3 vid en tidpunkt då RHP-behandlade friska möss uppvisar en immunsuppressiv fenotyp (i frånvaro av ischemisk skada). 7 Detta 2 vecka tidpunkt kan inte sammanfalla med perioden för maximalt skydd mot andra akuta CNS-skador, eller i andra organsystem. Både RHP-protokollet, och tids inslagen i den epigenetiska svar, utan tvekan kommer att behöva optimering för varje ny translationell användning.
En av de största begränsningarna hos tMCAo proceduren är den heterogena fördelningen av infarkt voLumes, såsom visas av denna representativa datauppsättningen. De säkerheter cirkulation tillhandahålls av Circle of Willis, leptomeningeal anastomoser och rygg säkerheter korsningar kan leda till inkonsekventa infarkt volymer. 34 Variationer mellan Circle of Willis i olika stammar av möss, samt närvaro och öppenheten hos bakre kommunicera artärer, 25 35 kan ytterligare reducera konsekvensen av infarktvolymer inom grupper. Robusta provstorlekar och replikering är ofta nödvändiga för att producera avgörande resultat och bör ingå i utformningen av experimentet efter att ha slagit i enlighet därmed. Andra metoder för stroke induktion, särskilt distala fokal ischemisk metoder såsom tilltäppning av den primära MCA grenen via en Burr hål i sido skallen, eller photothrombosis av distala grenar av MCA, ofta producerar mindre variation i slagvolym. Photothrombotic stroke är begränsade, men eftersom de producerar samtidig extracellulära och intracellulära ödem, en phenomenon inte sett i ischemisk stroke hos människor. 36 Omvänt tMCAos är mer direkt tillämpliga på den kliniska situationen eftersom mer än 60% av alla stroke hos människor uppstå på grund av obstruktion av mellersta hjärnartären. 37 Slutligen, anestesi används under tMCAo, isofluran , har visat sig inducera neuroprotektion. 38 För att ta hänsyn till detta neuroprotektion bör isofluran nivåer vara konsekvent mellan operationer och mellan behandlade och obehandlade försöksgrupper, och hölls vid <3% för att minska dess potentiella nervskyddande effekter. 39
Tiden är också kritisk i TTC färgning processen. Även om det finns en stor variation i slag litteraturen om den tid under vilken TTC färgning kan utföras efter ischemi, varierar från 4 timmar till 7 dagar efter stroke, bör 18,40 TTC färgning inträffa vid 24 till 48 timmar efter stroke för det mesta konsekvent och tydligt avgränsade infarktvolymer. TTC infarkt volymer har been funnit att stabilisera 24 timmar efter stroke, men efter 48 timmar, ett inflöde av makrofager i den ischemiska hjärnan gör att definiera infarktvolymen svårt. 14,40 Vidare färgningen av hjärnvävnad med TTC bör omedelbart följa offer. Att skjuta färgning kommer att minska kvaliteten på fläcken på grund av ökad mitokondriell dödsfall på grund av djur död, inte hjärninfarkt. En liknande ökning av mitokondrie dödsfall kommer att inträffa om hjärnan inte hålls fuktig under införandet av bladen. Även om detta protokoll visar tydligt nyttan av infarktanalys med TTC färgning, kan andra immunohistologiska fläckar användas för att kvantifiera infarktvolymen efter tMCAo. Kresylviolett eller fluor-jade färgning har mindre stränga tidskrav för färgning efter offer, men dessa klassiska fläckar kräver mycket tunna sektioner som erhållits genom kryostat eller mikrotom, och därmed kräver mer tid för integrativ summering och analys. 14 Vidare, dessa stains kan inte användas tillsammans med EB kvantifiering av BBB störningar, som utvecklats av andra, 15 eliminerar risken för direkt jämförelse mellan infarktvolymen och BBB integritet i en viss hjärna. Det bör noteras att RHP behandlade djur typiskt uppvisade rosa i motsats till rena vita volymer. 6 För att undvika uttvättning av infarkt i RHP-behandlade möss, använder vi en kortare färgningsperiod för TTC som resulterar i mer rosa frisk vävnad i motsats till mörkröd. Evans Blue behandling kan också mörkare infarktområdet så rena vita infarkter är osannolikt med dubbla färgning kvantifiering presenteras i detta protokoll.
För att jämföra EB kvantifiering inom och mellan grupper, måste alla djur genomgå motsvarande cirkulationstider för EB. Andra har injicerat EB omedelbart efter reperfusion och fick EB cirkulera i upp till 72 timmar, 41 eller vid 4 timmar efter tMCAo att cirkulera under 4 timmar, 15 som Alternative metoder. Mängden EB som korsar den avbrutna BBB och går hjärnvävnad representerar integral ackumuleringen av albumin-bundet färgämne från tidpunkten för injektion till tidpunkten för avlivning. Sålunda, den metod som beskrivs i detta dokument avslöjar status av BBB vid just den tid mellan 22 och 24 timmar av reperfusion, och kan missa tidigare eller senare öppningar eller stängning av barriären. Omvänt, den metod som används av Wang et al. avslöjar status BBB under 72 timmar efter stroke, inklusive alla ändringar i BBB-status under den 3 dag efter stroke tid 42 Varken protokoll är bättre eller sämre. även om det återstår en risk för "saknas" en övergående öppning av BBB med kortare omloppstider, gör det möjligt för utredarna att identifiera specifika tids egenskaper hos BBB patofysiologi och att para ihop den med andra metoder, som visas här. Andra har kombinerat TTC och EB genom att injicera EB intracardially 1 minut efter transcardial perfusion. 18 Dock träffade dettahod producerade inkonsekventa resultat och är en mycket mer komplicerad procedur än det protokoll som beskrivs ovan.
En av de mest lovande framtida inriktningar för RHP är translations tillämpningen av detta iordningställande protokoll till andra sjukdomstillstånd. Intermittent hypoxiska exponering har visat sig vara skyddande i pro-inflammatoriska andra än ischemi CNS villkor. I en råttmodell av Alzheimers, 2 veckor 4 tim daglig exponering till hypobaric hypoxi minskade försämring av minne lagring och förlust av kortikala neuroner efter intracerebrala injektioner av beta-amyloid. 43 Intermittent hypoxi (2 veckor 15 tim daglig exponering till hypobaric hypoxi ) konstaterades också att vara skyddande i råttor efter L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) infusion, en modell av Parkinsons vilket försämrar striatala dopaminerga transmissionen. 44 är dock bara dessa modeller av Alzheimers och Parkinsons sökte kortsiktiga effekter avhypoxisk prekonditionering. 43,44 Undersöka långsiktiga neuroprotektion induceras av RHP kan vara ett givande framtida inriktning för forskning. Vidare kan neuroprotektion induceras av RHP omfatta förbättrad BBB integritet i musmodeller av Alzheimers, vilket skulle kunna analyseras med EB. 45 Den dubbla TTC och EB analys skulle vara ännu mer användbar vid Parkinsons modell som det framkallar striatala lesioner 46 och BBB avbrott, 47 som kan kvantifieras med TTC 48 och EB, 49 respektive. Totalt RHP är en enkel, kraftfull form av prekonditionering med stor translationell potential som det unikt inducerar långsiktig, antiinflammatoriska och nervskyddande effekter. Den dubbla kvantifiering av TTC och EB kan också lätt tillämpas på andra sjukdomstillstånd som involverar mitokondriell störning, celldöd, och BBB läckage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
