Abstract
Modelos animais experimentais de acidente vascular cerebral são ferramentas inestimáveis para a compreensão do AVC e desenvolvendo estratégias de tratamento mais eficazes. Um protocolo de 2 semanas para o pré-condicionamento repetitivo hipóxica (RHP) induz a proteção a longo prazo contra a lesão do sistema nervoso central (SNC) em um rato modelo de acidente vascular cerebral isquêmico focal. RHP consiste em 9 exposições estocásticos a hipoxia, que variam em termos de duração (2 ou 4 h) e intensidade (8% e 11% de O 2). RHP reduz os volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) uma ruptura, e a resposta inflamatória pós-derrame durante semanas após a última exposição a hipoxia, sugerindo uma indução de longo prazo de um fenótipo do SNC de protecção endógena. A metodologia para a quantificação dual de volume do enfarte e a certificação perturbação é eficaz na avaliação da protecção neurovascular em ratinhos com RHP ou outros neuroprotectores putativos. Camundongos adultos machos Swiss Webster foram pré-condicionados por RHP ou exposições de duração equivalente a 21% de O
Introduction
Como a principal causa de incapacidade em adultos e a quarta principal causa de morte, acidente vascular cerebral é um dos estados patológicos mais debilitantes que afectam a população adulta dos Estados Unidos. 1 Os modelos animais de acidente vascular cerebral permitir a investigação experimental de novos métodos de reduzir a lesão isquémica e melhorar a recuperação pós-acidente vascular cerebral. Uma nova avenida para tal investigação translacional é pré-condicionamento. Pré-condicionamento é o uso intencional de um estímulo não prejudicial para reduzir a lesão a partir de uma subsequente e mais grave, ferimento. 2 o pré-condicionamento hipóxica foi mostrado para produzir alterações pleiotrópicos no cérebro que fornecem protecção contra derrame em tanto in vivo e in vitro . 3 No entanto, uma única exposição à hipóxia só oferece neuroproteção de curto prazo, induzindo menos de 72 horas de tolerância contra a isquemia em ratos adultos. 4 Mesmo depois de quatro semanas de 14 horas exposição diária à hipóxia hipobárica, Lin et al. found neuroproteção que só foi sustentado por uma semana. 5 hipóxico pré-condicionamento repetitivo (RHP) é caracterizada por variações estocásticos em frequência, duração e intensidade da exposição hipóxia. Em contraste com um desafio único de pré-condicionamento, RHP induz um fenótipo cerebroprotective que dura até oito semanas em ratinhos. 6 RHP redução dos volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) uma ruptura, inflamação vascular, e a diapedese de leucócitos para semanas após a última exposição hipóxica . RHP especificamente redução da inflamação no cérebro isquémico por redução de células T, monócitos, e populações de macrófagos, mantendo ao mesmo tempo as populações de células B no hemisfério isquémico. 7 Na verdade, RHP induziu um fenótipo imunossupressora em ratos antes de qualquer lesão do SNC, incluindo acidente vascular cerebral. As células B tratadas com RHP isolados a partir de ratos saudáveis tratados com RHP exibiram um fenótipo anti-inflamatório único, com uma regulação negativa tanto de apresentação de antigénio e produção de anticorpos. Oredução global nos mecanismos imunes adaptativas pró-inflamatórios faz RHP uma excelente metodologia para induzir imunossupressão endógena para não só as doenças inflamatórias do SNC-específicos, mas também lesões ou doenças sistémicas modelos que incluem uma patologia pró-inflamatória.
RHP reduz tanto o volume de enfarte e certificação interrupção na sequência de uma oclusão transiente da artéria cerebral média (tMCAO). Os modelos animais de acidente vascular cerebral, tais como a tMCAO comumente usados, melhorar dramaticamente a compreensão da patofisiologia de acidente vascular cerebral, bem como a concepção de Neurotherapeutics mais eficazes. Primeiro desenvolvido por Koizumi et al., Em 1986, o procedimento tMCAO 8 é um método amplamente utilizado de induzir acidente vascular cerebral em roedores e um dos métodos preferidos para a investigação de inflamação após a reperfusão. Como os métodos para tMCAO evoluir, o uso mais recente de filamentos revestidos com silicone reduzir ainda mais o risco de hemorragia subaracnóide em comparação com outros modelos 9,10 </ Sup> e melhorar a confiabilidade, embora, infelizmente tMCAO muitas vezes produz uma grande variação de volumes de infarto. 11-13 A maioria desses estudos delinear regiões infarto em seções cerebrais coronais por coloração com cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC), considerado um padrão-ouro para infarto quantificação, pois é uma maneira simples e barata de produzir resultados reproduzíveis vivas. TTC serve como um substrato de desidrogenases presentes na mitocôndria. Quando fatias de cérebro são expostos à solução de TTC, TTC é tomado selectivamente em células vivas, onde o seu produto de redução não-solúvel, formazano, precipita-se para uma cor vermelho escuro em mitocôndrias viáveis. Por causa da disfunção mitocondrial no tecido isquémico, este tecido permanece branco, permitindo a diferenciação do tecido danificado e saudável. 14
RHP também reduz a certificação perturbação no hemisfério isquêmico. 6 Portanto, a dupla quantificação da integridade BBB dentro da mesma bchuvas como o volume de enfarte baseada em TTC 15 determinações iria fornecer informações úteis sobre a eficácia plena da protecção endógena, e as relações causais entre potenciais BBB perturbações e infarto em animais tratados e não tratados. O afluxo de sangue periférico através de uma certificação interrompido, secundária a acidente vascular cerebral, aumenta populações de leucócitos, citocinas pró-inflamatórias, estresse oxidativo, edema vasogênico e transformação hemorrágica no hemisfério isquêmico, finalmente, aumentar as taxas de infecção e mortalidade em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico 16,17. Um método comum de medir a certificação ruptura em modelos animais é através de quantificação de azul de Evans (EB) vazamento de corante no cérebro. 15,18-21 EB liga-se selectivamente a albumina do soro, uma proteína globular (PM = 65 kDa) que não atravessa a certificação em animais não lesionados. 22 Seguindo acidente vascular cerebral isquémico, EB se infiltra no cérebro, e fluoresce a 620 nm, permitindo a medição da densidade óptica within o parênquima ferido perfundidos. 22 A densidade óptica é directamente proporcional à permeabilidade da BHE quando EB foi lavada para fora da vasculatura cortical post mortem por perfusão transcardíaca. Com o processamento imediato dos cérebros TTC-corada em animais com a administração EB, tanto o volume do enfarte e a certificação perturbação pode ser quantificada de forma eficaz. Deve notar-se, no entanto, que a lesão neuronal e a certificação perturbação não são processos concomitantes no cérebro pós-AVC, 23,24 de modo que a selecção de tempo de sacrifício é uma consideração importante.
O protocolo que se segue detalha a RHP método, o método tMCAO para induzir uma oclusão arterial temporária que modela oclusões da artéria cerebral média em pacientes humanos, os métodos histológicos e para a determinação dupla neuronais e vasculares terminais lesão do derrame. TTC mede a morte celular e danos nos tecidos cumulativo, o que permite a quantificação de um enfarte vol globalume, enquanto EB prevê a quantificação dos danos hemisférica BBB.
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Protocol
NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da UT Southwestern Medical Center, que age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde política (NIH) para uso animal experimental.
1. Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic
- Projete quatro medidores de vazão em reguladores de gás e anexar a câmaras de indução 15 L padrão com tubos de PVC para permitir que o gás comprimido a partir do oxigênio (O 2) tanques a fluir para as câmaras através de uma porta de entrada. Veja Equipamentos e Materiais para mais detalhes sobre o design personalizado.
- Divida ratos em dois grupos: Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic (RHP) do Grupo, que recebem exposições a 8% e 11% O 2, eo grupo controle, que recebem exposições de O 2 (ar ambiente) 21% simultaneamente. Ver Tabela 1 para as variações de frequência, intensidade (8 e 11% de O2 ou 21% de O2) e duração (2 ou 4 horas) exposições de RHP. </ Li>
- Remova a tampa do filtro de topo de cada gaiola e colocar a gaiola, com comida e água garrafas intactas, nas câmaras ligadas às suas respectivas Ó 2 tanques. Feche e prenda a tampa da câmara.
- Abrir a válvula de gás principal para os tanques e definir o fluxo inicial para cada câmara de indução de 2 L por min (LPM) para os primeiros 5 minutos de exposição. Reduzir a taxa de fluxo a 1 LPM para o restante da exposição.
- No final da exposição, para reduzir o fluxo para 0 LPM e fechar a válvula de gás para os tanques.
- Abra as tampas de câmara e substituir o filtro de topo da tampa em cada gaiola. Coloque as gaiolas em habitação padrão até a próxima exposição hipóxica.
- Spray para baixo cada câmara de indução com NPD (Steris) ou um desinfectante / desinfetante equivalente após cada utilização.
- Expor ambos 21% e RHP ratinhos, ao mesmo tempo do dia ao longo de duas semanas, como descrito na Tabela 1.
2. TransientMédio oclusão da artéria cerebral (tMCAO)
- Veja a discussão para mais detalhes sobre o tempo de acidente vascular cerebral após a exposição RHP final.
- Prepare um local de trabalho cirurgia asséptica. Local de trabalho envolvente limpo com 70% de etanol ou um desinfetante equivalente e autoclave todas as ferramentas cirúrgicas.
- Configure o instrumento Laser Doppler Fluxometria (LDF) para medir mudanças relativas no fluxo sanguíneo cerebral (CBF). Ligue o bloco de aquecimento a 37 ° C. Ligue o incubador a 34 ° C.
- Anestesiar ratos com uma breve exposição a uma mistura de 4% de isoflurano / 70% de NO2 / 30% de O 2 em uma pequena câmara de indução. Confirme anestesia adequada levemente beliscar a pata. Se o rato retirar a sua pata, devolver o mouse para a câmara de indução e continuar exposição isoflurano.
- Retirar ratos da câmara indução da anestesia e inserir rapidamente o nariz do rato no cone do nariz. Abra o fluxo de gás para o cone de nariz, fechando o fluxo para os anestesia câmara de indução.
- Sem alterar o NÃO 70% 2/30% de O 2 da mistura de gases, corrigir isoflurano a 1,8% como a dose de manutenção durante o resto do procedimento. A respiração deve permanecer lento e regular durante todo o procedimento, mas se a respiração torna-se rápida e superficial, aumentar a dose isoflurano. A dose de manutenção pode variar entre equipamentos de fabrico e de animais utilizados na experiência.
- Usando um microshaver, raspar o cabelo na região temporal entre o canto do olho e a orelha, bem como na linha média ventral do pescoço. Remover o excesso de pele e aplicar lubrificante ocular com uma mecha de algodão estéril para manter as córneas de secar durante o processo. Limpe a área de incisão com compressas embebidas em álcool e cotonete providone-iodo com um cotonete estéril para manter condições assépticas.
- Administrar analgésicos de acordo com as orientações cirúrgicas de roedores.
- Realizar uma incisão através da pele temporal entre o olho e a orelha.Exponha o músculo temporal. Usando micro-tesouras cirúrgicas, corte o ligamento do músculo temporal no cume temporal, dentro da área de estrias músculo branco.
- Suavemente empurrar a massa muscular, lateralmente, com uma pinça para visualizar a artéria cerebral média (MCA) através do crânio. Após a incisão do músculo temporal, a área pode se encher de sangue. Gentilmente use um cotonete para estancar qualquer sangramento potencial.
- Alvo a ponta da sonda LDF para a área de MCA. Grave o navio escolhido como esta área varia entre os camundongos.
- Segure o LDF no lugar e nivelada com o crânio até que um fluxo de células vermelhas do sangue estável é ler e gravar esse valor como a CBF linha de base. FSC da linha de base ideal numa fluxometria por laser Doppler são> 600 de fluxo, mas isto pode variar com o fabricante. Se basal CBF é <400 do fluxo, o fluxo de gravação é mais provável de uma veia próxima, ou uma colocação incompleta da sonda ao longo do vaso-alvo.
- Depois de base CBF é estabelecida, repositino rato, de modo que o pescoço fique exposta. Apoiar a sua cabeça e manter o mouse sob anestesia constante do cone do nariz.
- Faça uma incisão na linha média ventral, logo abaixo da mandíbula até a clavícula.
- Utilizando uma pinça, sem corte dissecar tudo fáscia superficial para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA). Separa-se a CCA de tecido conjuntivo e do nervo vago.
- Permanentemente ligar o CCA com uma sutura de seda 6.0. Coloque a sutura ligadura como proximal quanto possível para permitir espaço suficiente para ocluir colocação filamento.
- Loop e vagamente amarrar um segundo fio de seda 6,0 em torno do CCA distal à sutura oclusão. Ter cuidado para não obstruir a artéria como o filamento de oclus vai subsequentemente ser enfiada através da carótida.
- Use um 8 x 2 milímetros luz micro serrafine braçadeira areterial para prender o CCA distal à sutura de seda vagamente amarrado. Levante cuidadosamente a CCA com uma pinça e fazer uma pequena incisão longitudinal, como proximal à sutura liga�o da comopossível com 3 milímetros Vannas.
- Um fio de 12 milímetros de silício revestido de nylon de calibre 6.0 oclus filamento através da incisão de introduzir o lúmen da artéria, e depois fazê-la avançar alguns mm. Genericamente apertar o segundo fio de seda em torno da ponta solta do filamento de oclus para garantir o fluxo de sangue não empurrar o filamento fora do CCA e remover o grampo arterial.
- Na primeira bifurcação da CCA na artéria carótida interna (ACI) e na artéria carótida externa (ACE), passe o filamento de oclusão no braço direito do primeiro bifurcação para entrar no ICA.Advance o filamento oclusão 9-10,5 mm depois a segunda sutura de seda na artéria carótida interna esquerda (ICA).
- Pouco depois de entrar no ICA, avançar o filamento de oclusão para o ramo esquerdo na segunda bifurcação entre o ICA ea artéria pterogopalantine (PPA). Visualização do PPA é improvável assim proceder até sentir uma leve resistência com colocação integral do filamento oclusão.O levantamento do ICA com uma pinça pode ajudar o filamento para enfiar mais facilmente no ramo esquerdo da segunda birfurcation. Aperte o segundo fio de seda.
- Vire o mouse de modo a incisão através da MCA é visível. Com o equipamento LDF, confirmar que a CBF é bloqueado através de leituras do FDL. A oclusão de sucesso é uma redução> 80% da linha de base a partir de CBF.
- Aperte completamente e dê um duplo nó do segundo fio de seda em torno do filamento oclusão quando a posição correta é alcançada. Se necessário, empurre ligeiramente em ou puxe o filamento de oclusão para alcançar critérios CBF para uma oclusão bem sucedida (por exemplo, redução> 80% da linha de base CBF).
- Feche a abertura do pescoço e da cabeça com suturas de nylon 6.0.
- Colocar em ratos a 34 ° C incubadora para a duração da oclusão. Comprimento recomendado de oclusão é de 60 min, mas isso varia por idade, diferenças dependentes da estirpe de anatomia vascular cerebral, 25 e a extensão da injury desejado (leve, moderada, grave). Certifique-se de que os animais recuperar a consciência dentro de minutos saindo de anestesia.
- Re-anestesiar os animais com isoflurano, conforme descrito no passo 2.3, 5 minutos antes do final do período de oclusão pré-definido, a incisão no couro cabeludo e confirmar que a perfusão MCA é ainda reduzido utilizando leituras transcranianas LDF. Se o FSC não é suficientemente reduzida (por exemplo, <20% da linha de base CBF), a MCA reperfundido em algum momento durante a oclusão e o rato deve ser impedida de continuar a experimentação.
- Abra a incisão na linha média do pescoço e vagamente amarrar um terceiro fio de seda em torno do CCA, distai em relação à segunda sutura de seda mas proximal à bifurcação CCA para assegurar que a artéria carótida externa (ECA) vai permanecer viável após o filamento é removido.
- Cortar ou desatar o nó que prende o filamento de oclusão (ie, segundo fio de seda) e retirar o filamento oclusão lentamente. Uma vez removido, a fechar rapidamenteterceiro fio de seda ao redor do CCA para minimizar o refluxo de sangue do ICA. Dê um duplo nó desta sutura e fechar a incisão com suturas de nylon 6.0.
- Reposicionar o mouse para quantificar o nível de CBF após 5 min de reperfusão. Reperfusão bem sucedida é geralmente definido como um CBF de> 50% da linha de base CBF, mas, como acontece com o fluxo de oclusão, os investigadores podem estabelecer o seu próprio critério. Se os animais exibem um CBF abaixo de 50% da sua linha de base, é provável que o MCA é 'permanentemente' ocluído, e representa, portanto, um outro critério de exclusão do estudo.
- Feche as duas incisões com suturas de nylon 6.0. Fornecer solução salina, anestésico (lidocaína), antibióticos e de acordo com as diretrizes de roedores. No entanto algumas pequenas doses de antibióticos (3 mg / kg de minociclina) foram encontrados para ser neuroprotector percurso de seguimento 26.
- Depois de recobrar a consciência na incubadora aquecida após a cirurgia, lugar camundongos em uma gaiola limpa, estéril. Fornecer foo umedecidod ou suplementos nutricionais hidratação gel alimentares e uma placa de Petri de água como os animais têm uma mobilidade restrita após acidente vascular cerebral. Monitorar os animais de perto durante a recuperação para a dor pós-operatória excessiva e morte.
3. Evans Blue (EB) Injecção
- Injectar EB 22 horas após a reperfusão e deve circular na corrente sanguínea, durante 2 horas antes do sacrifício e coloração TTC.
- Adicione uma solução injectável EB (EB 2% em solução salina) e misturar suavemente à temperatura ambiente. Filtrar a solução através de papel de filtro ou empurrar através de um filtro de 0,2 um ligado a uma pequena seringa para remover não dissolvido EB e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepara-se o valor de EB necessário para a injecção (4 ml / kg de peso corporal) Desenhar a quantidade desejada de corante para uma seringa de insulina de 0,3 cc com uma agulha de calibre 29 e assegurar que a solução é à temperatura ambiente
- Contenha mouse usando restrainer fundo plano. Segurar a cauda de modo que a veia lateral é uppmais exterior. Veias laterais estão localizados em cada lado da linha central da cauda. Manter a ponta da cauda para manter constante o rato para injecção.
- Insira a agulha na veia, aproximadamente, 3,5 mm, tomando cuidado para não perfurar a veia. Confirmar que a agulha está na veia recuando na seringa e à procura de sinais de sangue.
- Injectar todo o corante ao longo de 1 min. Se a solução vai para dentro da veia deve haver resistência mínima como a pressão é aplicada à seringa. Confirme administração venosa sistêmica bem sucedida de EB por uma mudança de cor imediato na cauda, membros e olhos do mouse.
- Retire a agulha da cauda e gentilmente aplicar pressão utilizando gaze limpa, a fim de parar o sangramento.
- Começar a cronometragem quando a pele do rato fica azul. Permitir que a EB para circular durante 2 horas para penetrar a BBB enfraquecida.
4. 2,3,5 Trifeniltetrazólio Chloride (TTC) Coloração
- Uma vez que o pó se dissolva completamente, transferir imediatamente para uma garrafa, tampa em papel alumínio, e armazenar a 4 ° C. TTC e tecido manchado com TTC são sensíveis à luz.
- Iniciar a bomba de perfusão em 5 ml de caudal / min com uma seringa de 60 cc cheio com gelo frio PBS 0,01 M e ligado a um medidor de 27 infusão alado agulha. Colocar a ponta da agulha de cerca de 0,5 cm para o ventrículo esquerdo do coração e cortar o átrio direito. Progressivamente sangue venoso diluída deve fluir para fora do átrio durante a perfusão até que o sangue venoso parece incolor. Transcardialmente perfundir 30 ml de 0,01 M de solução salina tamponada de fosfato (PBS) através do coração.
- Remover os bulbos olfativos através da inserção de um aço inoxidável de 0,21 milímetros de espessura de lâmina para dentro do segundo compartimento do lado rostral da matriz.
- Remover o cerebelo através da inserção de uma lâmina na quarta ranhura do lado caudal da matriz.
- Inserir uma lâmina na ranhura meio das ranhuras restantes na matriz. Insira as lâminas restantes, de maneira uniforme que atravessa o tecido remanescente para garantir a distribuição mais uniforme de tecido durante o corte.
- Uma vez que todas as lâminas terem sido inseridos, é de 1 a 2 gotas de PBS para o cérebro para humedecer.
- Remover a lâminas um de cada vez a partir da matriz começando com a região rostral. Mantenha os primeiros sete fatias para análise TTC após tMCAO. Utilize uma pequena espátula para transferir cuidadosamente as fatias a partir da lâmina para o frasco TTC-cheia.
- Quando as seções são organizadas no slide, digitalizar o slide usando um scanner padrão. Defina a resolução em um mínimo de 600 dpi para análise de imagem. Certifique-se de incluir o nome do animal e uma régua métrica na imagem digitalizada.
- Vire o slidee digitalizar o lado de trás para garantir que todos os dados são coletados.
5. Infarct Volume Quantificação
- Quantificar o volume de enfarte, usando um software de análise de imagem padrão (por exemplo, ImageJ).
- Digitalizar imagens com uma resolução elevada (por exemplo, 600 dpi), para análise adequada. Corte de imagens. Padronizar a escala para todas as imagens usando a régua métrica incluídos na imagem digitalizada.
- Calcular o volume total do hemisfério contralateral com a seguinte fórmula. Repetir esta fórmula para calcular o volume total do hemisfério ipsilateral.
Soma de hemisfério contralateral total de cada fatia de espessura x fatia - Calcular o volume de enfarte indirecta. . Controle de edema ipsilateral do traço, usando o saudável, hemisfério contralateral como controle 27 Use a seguinte fórmula para calcular o volume de enfarte indireta:
O volume total de hemisfério contralateral -
(Volum totale do hemisfério ipsilateral -média volume de 3 medições de infarto)
6. Barreira sangue-cérebro (BBB) Integridade Quantificação
- Para se preparar para EB quantificação, primeiro pesar 2,5 polegadas pesar barcos. Grave o peso e rotular dois pesar barcos para cada animal: uma para o hemisfério ipsilateral e uma para o hemisfério contralateral.
- Depois de digitalizar as seções TTC-coradas, bissetriz cada seção com uma lâmina de barbear descartável em hemisférios ipsilateral e contralateral. Coloque os hemisférios ipsilateral de todas as sete seções em um barco pesar e registar a sua massa. Repita o procedimento para hemisfério contralateral.
- Transferir imediatamente os barcos de peso a um conjunto forno por 56 ° C durante 48 horas.
- Pesar as secções secas. Transferir ambos os hemisférios em separadas tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
- Calcular a quantidade de formamida necessária para cada hemisfério (8 ml / g de tecido seco), e adicionar ao respectivo microcentrifuge tubos. Formamida é sensível à luz e cobrir todas as amostras tratadas com formamida em folha a partir deste ponto em diante.
- Transferir os tubos de microcentrífuga para um incubadora ajustada a 56 ° C durante mais 48 h.
- Após o 48 horas, Pipeta fora o sobrenadante azul em um outro conjunto de tubos de microcentrífuga rotulado. Empurrar o tecido para o fundo do tubo para maximizar o volume de sobrenadante extraído. Mantenha os tubos de sobrenadante e dispor de todo o tecido.
- Preparar diluições em série de EB exponenciais em formamida para a curva padrão. Incluir um em branco (formamida apenas) e, em seguida, 10 soluções exponenciais de 0,125 ug / ml através de 64 ug / ml de EB em formamida.
- Pipetar 300 uL das diluições feitas para a curva padrão para uma placa de 96 poços. Pipetar 300 l do sobrenadante em cavidades correspondentes.
- Medir a absorvância num espectrofotómetro a 620 nm.
- Comparar a curva padrão das diluições EB com a absorvância of as amostras de sobrenadante. A densidade óptica é directamente proporcional à integridade da BBB.
- Assumir a densidade óptica do hemisfério contralateral como o fundo e usar a fórmula (ipsilateral contralateral-) / contralateral para determinar a mudança de dobragem. Para mais detalhes sobre a análise estatística ver Martin et al, 2010. 18.
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Representative Results
Este estudo incluiu 25 ratinhos Swiss Webster machos que tinham 10 semanas de idade no início da randomização em RHP (n = 10) ou 21% de O 2 (n = 15) grupos. Duas semanas após a exposição final RHP, procedimentos cirúrgicos foram realizados, com grupos cegos e contrabalançadas entre os dias. Seguindo tMCAO, um rato morreu durante a recuperação pós-operatória e um rato foi excluído do estudo porque não cumpria o critério de reperfusão CBF. Ambos os ratos foram excluídos do grupo O 2 de 21%. De acordo com CHEGADA diretrizes, 28 Tabela 2 mostra os parâmetros cirúrgicos. Volumes indiretos infarto, inchaço hemisférico (ou seja, edema) e azul de Evans (EB) extravasamento são mostrados na Figura 2. Todos os dados foram analisados com testes t não pareado (média, desvio padrão mostrado) e valores extremos detectado com um falso Descoberta Classificação menos de 1% (Graphpad Prism), que removeu quatro casos anómalos (2 de 21%, a partir de 2 RHP) a partir do conjunto de dados EB.
3) em comparação com 21% O 2 ratos tenha sido tratada com (62,6 ± 42,6 milímetros 3), mas essa diferença não foi significativa (p = 0,10). No entanto, uma análise a priori de Energia previu um n = 10 por grupo necessária, o que nós não alcançar com os ratinhos tratados com RHP depois de outliers foram removidos. Isto deve ser considerado na elaboração de futuros experimentos utilizando RHP. Não houve efeito sobre o inchamento de RHP hemisférica, uma métrica derivado da análise de volume TTC que pode ser equacionada com edema. 6 ratinhos tratados com RHP exibiu uma tendência (p = 0,05) na redução de certificação interrupção dentro do hemisfério isquémico normalizados para o hemisfério contralateral. A Figura 2D mostra uma gama de valores para EB vazamento para ambos os grupos de tratamento.
Figura 1:. Câmaras RHP pedido de clientes, o painel superior mostra os medidores de vazão custom-built para a monitorização individual de fluxo de ar em até quatro câmaras. Ar tubo impermeável é mostrado deixando o medidor de caudal e anexando à porta de entrada da câmara de indução 15 L no painel inferior. Porta de saída permanece aberto durante RHP para permitir a circulação de ar.
Figura 2:.. RHP reduz os volumes de enfarte e a certificação perturbação RHP (A) reduz os volumes de enfarte por 46% em comparação com ratinhos de controlo, mas tem (B) nenhum efeito sobre o inchaço hemisférico derivado a partir dos dados de TTC (C) nos mesmos animais, RHP reduz a certificação ruptura (p = 0,05), tal como definido por Azul de Evans vazar normalizado para o hemisfério contralateral. (D) representativas TTC manchas de ambos RHP-tratada e 21% de O2
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Discussion
Uma única exposição à hipóxia sistêmica (ou seja, 2 horas de 11% O 2) em camundongos "transitoriamente" protege o cérebro de tMCAO, 29 ou seja, a resposta epigenética ao desafio hipóxico pré-condicionamento é de curta duração, eo fenótipo linha de base é restaurada dentro dias. Apresentações repetitiva do estímulo pré-condicionamento hipóxico alargar drasticamente a duração do fenótipo neuroprotector. 6 Muitos estudos têm demonstrado que a frequência, amplitude e duração do estímulo trem repetitivo são determinantes críticos desta resposta. Por exemplo, simplesmente repetindo a mesma intensidade e duração de hipoxia (2 h, de 11% de oxigénio), 3 vezes por semana (MWF) durante 2 semanas não se estendem a janela terapêutica para a protecção de tMCAO neurovascular, 6, mas foi suficiente para induzir a longo tolerância isquêmica prazo na retina. 30 Curiosamente, embora cinco exposições a hipóxia sistêmica (5 horas de 8% de O2 </ Sub>) espaçadas 6 dias separados protegido contra tMCAO induzida de 3 dias após a última exposição hipóxica, neuroprotecção foi perdido se a 5 exposições hipóxicas foram colocados três dias separados. 31 A razão para esta diferença permanece pouco clara, mas pode ter sido devido à duração da hipóxia grave em relação a este protocolo e / ou tempo de recuperação insuficiente entre desafios hipóxicos desta gravidade.
Em suma, a titulação da provocação hipóxica repetitivo entre os domínios de frequência, amplitude e duração, parece crucial para o desenvolvimento de tolerância, enquanto não induzir lesão, para não mencionar os efeitos específicos de tecido e talvez específica da espécie. Por exemplo, 3 de 9 das exposições RHP envolvem exposição a 8% O 2 durante 4 horas, embora 6 horas de 8% O2 induz morte neuronal no hipocampo. 32 Portanto, deve haver uma estrita adesão ao protocolo RHP no que respeita à duração e gravidade das exposições de hipoxia para induzir endógenoprotecção. Embora o efeito potencial do ritmo circadiano na proteção induzida pelo pré-condicionamento precisa de uma maior exploração, realizando 33 exposições RHP ao mesmo tempo do dia para uma coorte especial reduz o risco de qualquer potencial efeito de confusão. Em termos de dose-resposta e a eficácia, a protecção mediada por RHP mais robusta do acidente vascular cerebral focal ocorreu quando o tMCAO foi induzida 2 semanas após a exposição hipóxica final, 3 de cada vez quando RHP-tratados ratinhos saudáveis exibem um fenótipo imunossupressor (no ausência de lesão isquêmica). 7 Este ponto de tempo duas semanas pode não coincidir com o período de protecção máxima contra outras lesões agudas do SNC, ou em outros sistemas de órgãos. Tanto o protocolo RHP, e as características temporais da resposta epigenética, sem dúvida, precisa de otimização para cada novo uso translacional.
Uma das maiores limitações do processo tMCAO é a distribuição heterogénea da enfarte VOlumes, como mostrado por este conjunto de dados representativo. A circulação colateral fornecido pelo Círculo de Willis, anastomoses leptomeningeal, e junções colaterais dorsal pode levar a volumes de infarto inconsistentes. 34 Variações entre o Círculo de Willis em diferentes linhagens de camundongos, bem como a presença ea desobstrução das artérias comunicante posterior, 25 , 35 pode reduzir ainda mais a consistência dos volumes de infarto dentro dos grupos. Tamanhos de amostra robustos e replicação são muitas vezes necessários para produzir resultados conclusivos e devem ser incluídas na concepção do experimento depois de ligar em conformidade. Outros métodos de indução do curso, métodos de isquemia focal particularmente distais, como a oclusão do ramo MCA primária através de um orifício de trepanação no crânio lateral, ou fototrombose de ramos distais do MCA, muitas vezes produzem menos variação do volume sistólico. Acidentes vasculares cerebrais Photothrombotic são limitados, no entanto, uma vez que produzem edema extracelular e intracelular simultâneo, um phenomenon não visto em acidentes vasculares cerebrais isquêmicos em humanos. 36 Por outro lado, tMCAos são mais directamente aplicável ao contexto clínico como mais de 60% de todos os acidentes vasculares cerebrais em humanos ocorre devido à obstrução da artéria cerebral média. 37 Por último, a anestesia utilizada durante tMCAO, isoflurano , tem sido mostrado induzir neuroprotecção. 38 A fim de explicar esta neuroprotecção, os níveis de isoflurano deve ser consistente entre as cirurgias e entre os grupos experimentais tratados e não tratados, e mantida a <3% para reduzir os potenciais efeitos neuroprotectores. 39
O tempo também é crítico no processo de coloração de TTC. Apesar de haver uma grande variação na literatura derrame sobre o tempo no qual a coloração TTC pode ser realizada após a isquemia, variando desde 4 h a 7 dias pós-AVC, 18,40 TTC coloração deve ocorrer a 24 a 48 h após o acidente vascular cerebral, na maior volumes de infarto consistentes e claramente delineados. Volumes de infarto TTC têm a abelhan encontrado para estabilizar 24 horas após o derrame, mas após 48 horas, um influxo de macrófagos no cérebro isquémico faz definindo o volume de enfarte difícil. 14,40 Além disso, a coloração de tecido cerebral com TTC deve seguir imediatamente sacrifício. Atrasando a coloração diminuirá a qualidade da mancha devido ao aumento de morte mitocondrial resultante de morte do animal, não enfarte cerebral. Um aumento semelhante na morte mitocondrial vai ocorrer se o cérebro não é mantido húmido durante a inserção das lâminas. Embora este protocolo ilustra claramente o benefício de análise de enfarte com coloração de TTC, outros imuno-manchas pode ser utilizado para quantificar o volume de enfarte a seguir tMCAO. Cresyl violeta ou coloração flúor-jade tem requisitos de tempo de menos rígidas para a coloração após o sacrifício, mas essas manchas clássicos exigem seções muito finas obtidas por cryostat ou micrótomo, e, portanto, necessitam de mais tempo para soma e análise integrativa. 14 Além disso, estes stains não pode ser usado em conjunto com EB quantificação de certificação perturbação, tal como foi desenvolvido por outros, 15 eliminando a possibilidade de comparação directa entre o volume de enfarte e integridade da BHE num determinado cérebro. Deve notar-se que os animais tratados com RHP-rosa tipicamente expostos ao contrário de volumes brancos puros. 6 A fim de evitar a lavagem do enfarte em ratos tratados com RHP, usamos um período mais curto para a coloração de TTC que resulta em tecido saudável mais rosa em oposição ao vermelho escuro. Evans processamento Azul pode também escurecer a área do enfarte infartos branco tão puro é improvável com a coloração quantificação dupla apresentado neste protocolo.
Para comparar EB quantificação dentro e entre os grupos, todos os animais devem ser submetidos a tempos de circulação equivalentes para EB. Outros têm injetado EB imediatamente após reperfusão e permitiu EB a circular por até 72 horas, 41 ou a 4 horas após a tMCAO a circular durante 4 horas, 15 como alternative abordagens. A quantidade de BE que atravessa a certificação interrompido e entra tecido cerebral representa a acumulação integrante de corante ligado à albumina do tempo de injecção para o tempo de sacrifício. Assim, o método descrito neste documento revela o estado de certificação do precisamente no tempo entre 22 e 24 h de reperfusão, e pode perder anteriores ou posteriores aberturas ou fechamentos da barreira. Por outro lado, o método utilizado por Wang et al. revela o status da certificação durante 72 horas após o AVC, incluindo todas as alterações no estado BBB durante esse tempo três dias pós-acidente vascular cerebral 42 Nem protocolo é melhor ou pior.; embora subsista um risco de "desaparecidos" a abertura transiente do BBB usando tempos mais curtos de circulação, que permite aos investigadores identificar características temporais específicos de certificação fisiopatologia e emparelhá-lo com outros métodos, como mostrado aqui. Outros têm combinado TTC e EB através da injeção de EB intracardial 1 min após a perfusão transcardial. 18 No entanto, esta conheceuhod produziram resultados inconsistentes e é um processo muito mais complicado do que o protocolo descrito acima.
Uma das indicações futuras mais promissoras para RHP é a aplicação de translação deste protocolo pré-condicionamento para outros estados de doença. Exposições hipóxicas intermitentes foram encontrados para ser protetor de isquemia em outras condições pró-inflamatórias do SNC. Em um modelo de rato da doença de Alzheimer, de 2 semanas de 4 hr exposição diária à hipóxia hipobárica reduziu o prejuízo da retenção de memória e perda de neurônios corticais após injeções intracerebrais de beta-amilóide. 43 hipóxia intermitente (2 semanas de 15 horas exposição diária à hipóxia hipobárica ) foi encontrado igualmente para ser protetor em ratos após a L-buthionine- [S, R] -sulfoximine infusão (L-BSO), um modelo da doença de Parkinson, que prejudica a transmissão dopaminérgica do corpo estriado. 44 No entanto, estes modelos da doença de Alzheimer e de Parkinson única investigado o efeitos de curto prazo dahipóxico pré-condicionamento. 43,44 Investigando a neuroproteção longo prazo induzida pela RHP pode ser uma futura direção frutífera para a pesquisa. Além disso, a neuroprotecção induzida por RHP pode estender-se para melhorar a integridade da BHE em modelos de rato da doença de Alzheimer, que pode ser analisado com a EB. 45 A análise de dupla TTC e EB seria ainda mais útil no modelo de Parkinson, uma vez que induz lesões estriatais 46 e BBB rompimento, 47, que podem ser quantificados com TTC 48 e EB, 49, respectivamente. Em geral RHP é uma forma simples, poderoso de pré-condicionamento, com grande potencial de translação, uma vez que induz excepcionalmente longo prazo, anti-inflamatória, e efeitos neuroprotectores. A quantificação dual de TTC e EB também pode ser facilmente aplicada a outros estados de doença que envolvem perturbação mitocondrial, a morte celular, e a certificação vazamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
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