Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

Abstract

מודלים של בעלי חיים ניסיוניים של שבץ הם כלים רבות ערך להבנת הפתולוגיה שבץ ופיתוח אסטרטגיות טיפול יעילים יותר. פרוטוקול 2 שבוע לנפשי מראש חוסר חמצן חוזר (RHP) גורם הגנה לטווח ארוך מפני פגיעה במערכת עצבים מרכזית (CNS) במודל של עכברים של שבץ איסכמי מוקדי. RHP מורכב של 9 חשיפות סטוכסטיים להיפוקסיה שמשתנות בשני המשך (2 או 4 שעות) והעצמה (8% ו -11% O 2). RHP מפחית כרכי אוטם, הפרעה דם-מוח מכשול (BBB), ותגובה הדלקתית השבץ-פוסט לשבועות בעקבות החשיפה האחרונה להיפוקסיה, המצביע על אינדוקציה ארוכת טווח של פנוטיפ CNS-מגן אנדוגני. המתודולוגיה לכימות הכפול של אוטם נפח ושיבוש BBB היא יעילה בהערכת הגנת עצבים וכלי דם בעכברים עם RHP או neuroprotectants המשוער אחר. עכברים השוויצריים וובסטר מבוגר גברים היו מותנים מראש על ידי RHP או חשיפות משך-שווה ערך ל 21% O כלומר). חסימת 60 דקות חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) הייתה מושרה 2 שבועות בעקבות חשיפת חוסר חמצן האחרונה. שתי החסימה וreperfusion אושרו על ידי Flowmetry דופלר לייזר transcranial. עשרים ושתיים שעות לאחר reperfusion, אוונס הכחול (EB) הייתה בהזרקה לוריד דרך הזרקה לוריד זנב. 2 שעות מאוחר יותר, בעלי החיים הוקרבו על ידי סעיפי יתר ומוח isoflurane הוכתמו כלוריד 2,3,5- triphenyltetrazolium (TTC). כרכי אוטמים אז היו לכמת. בשלב הבא, EB הופקה מהרקמה מעל 48 שעות כדי לקבוע הפרעה BBB לאחר tMCAo. לסיכום, RHP הוא פרוטוקול פשוט שניתן לשכפל, עם עלות מינימאלית, כדי לגרום להגנה לטווח ארוך אנדוגני עצבים וכלי דם מפציעה שבץ בעכברים, עם פוטנציאל translational למצבי מחלה פרו-דלקתיים אחרים המבוססים על מערכת העצבים המרכזית ומערכתיים.

Introduction

כגורם המוביל למוגבלות מבוגרים והגורם המוביל הרביעי של מוות, שבץ הוא אחת מדינות המחלה המתישות ביותר העומדות בפני האוכלוסייה הבוגרת בארצות הברית. מודלים של בעלי החיים 1 לשבץ לאפשר לחקירה ניסיונית של שיטות חדשות לצמצום פגיעת איסכמית ו שיפור התאוששות שבץ-פוסט. שדרת רומן אחד למחקר translational כזה נפשית מראש. אכשור קד הוא השימוש המכוון של גירוי נזק הלא-מנת להפחית את הנזק שמלאחר מכן, וחמורה יותר, פציעה. 2 נפשית מראש חוסר חמצן הוכח לייצר שינויי pleiotropic במוח המספקים הגנה מפני שבץ בשני in vivo ובניסויים במבחנה . 3 עם זאת, חשיפה יחידה להיפוקסיה מציעה רק neuroprotection לטווח קצר, וישכנע פחות מ -72 שעות של סובלנות נגד איסכמיה בעכברים בוגרים. 4 גם לאחר ארבעה שבועות של חשיפות יומיות 14 שעות להיפוקסיה hypobaric, לין ואח '. FOund neuroprotection שספג רק לנפשי מראש אחד בשבוע. 5 חוזרים חוסר חמצן (RHP) מאופיין בסטיות אקראיות בתדירות, משך, ועוצמת חשיפות חוסר חמצן. בניגוד לאתגר נפשית מראש יחיד, RHP גורם פנוטיפ cerebroprotective שנמשך עד שמונה שבועות בעכברים. 6 RHP מופחת כרכי אוטם, מחסום דם-מוח הפרעה (BBB), דלקת של כלי דם, וdiapedesis יקוציט במשך שבועות לאחר חשיפת חוסר חמצן הסופית . RHP מופחת במיוחד דלקת במוח איסכמי על ידי הפחתה של תאי T, מונוציטים, ואוכלוסיות מקרופאג, תוך שמירה על אוכלוסיות תאי B בחצי כדור איסכמי. 7 למעשה, RHP מושרה פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית בעכברים לפני כל פגיעה במערכת העצבים המרכזית, כולל שבץ. תאי B שטופל RHP המבודדים מעכברים בריאים שטופל RHP הציגו פנוטיפ אנטי דלקתי ייחודי, עם downregulation של שתי מצגת אנטיגן וייצור נוגדנים.ירידה כללית במנגנונים חיסוניים אדפטיבית פרו-דלקתיים גורמת RHP מתודולוגיה מצוינת לגרום לדיכוי חיסוני אנדוגני למחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ספציפיות לא רק, אלא גם דגמי פציעה או מחלה מערכתיות הכוללים פתולוגיה פרו-דלקתית.

RHP מפחית שני האוטם הבא חסימה חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) נפח ושיבוש BBB. מודלים של בעלי חיים של שבץ, כגון tMCAo הנפוץ, לשפר באופן דרמטי את ההבנה של הפתופיזיולוגיה של שבץ, כמו גם את העיצוב של Neurotherapeutics היעיל יותר. ראשון שפותח על ידי אל קואיזומי et., בשנת 1986, 8 הליך tMCAo הוא שיטה נפוצה של גרימת שבץ במכרסמים ואחת מהשיטות המועדפות לחקירת הדלקת הבאה reperfusion. כשיטות לtMCAo להתפתח, השימוש עדכנית יותר של חוטים מצופים סיליקון לצמצם עוד יותר את הסיכון לדימום תת-עכבישים בהשוואה לדגמים אחרים 9,10 </ Sup> ולשפר את האמינות, אם כי למרבה הצער tMCAo לעתים קרובות מייצר וריאציה רחבה בכמויות אוטם. 11-13 רוב המחקרים האלה להתוות אזורי אוטם בחלקים במוח עטרה על ידי צביעה עם כלוריד triphenyltetrazolium 2,3,5- (TTC), נחשב תקן זהב לכימות אוטם כי זה הוא דרך פשוטה וזולה כדי לייצר תוצאות חיות, לשכפול. TTC משמש כמצע של dehydrogenases הנוכחי במיטוכונדריה. כאשר פרוסות מוח נחשפות לפתרון TTC, TTC נלקח באופן סלקטיבי לתאים חיים שבו המוצר שלה שאינן מסיס בהפחתה, formazan, שוקע לצבע אדום עמוק במיטוכונדריה קיימא. בגלל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ברקמה איסכמית, רקמה זו נשארה לבנה, המאפשרת להתמיינות של רקמות פגועות ובריאים. 14

RHP גם מפחית הפרעה BBB בחצי כדור איסכמי. 6 לכן, הכימות הכפול של שלמות BBB בתוך אותה בגשמים כמבוססים TTC נפח אוטם קביעות 15 היו לספק מידע שימושי על היעילות המלאה של הגנת אנדוגני, וקשרים סיבתיים אפשריים בין ההפרעה BBB ואוטם בבעלי חיים שלא טופלו ומטופלים. הזרם של דם היקפי באמצעות BBB שיבש, המשני לשבץ, מגביר אוכלוסיות יקוציט, ציטוקינים פרו-דלקתיים, סטרס חמצונים, בצקת vasogenic, ושינוי המורגי בחצי כדור איסכמי, סופו של דבר להגדיל את שיעורי זיהום ותמותה בחולים עם שבץ איסכמי . 16,17 שיטה נפוצה למדידת ההפרעה BBB במודלים של בעלי חיים היא דרך כימות של אוונס כחול דליפת צבע (EB) לתוך המוח. 15,18-21 EB נקשר באופן סלקטיבי לסרום אלבומין, חלבון כדורי (MW = 65 KDA) שלא לחצות את BBB בבעלי החיים ללא כל פגע. 22 בעקבות שבץ איסכמי, EB מחלחלת למוח, ומאיר ב620 ננומטר, המאפשרת למדידת צפיפות האופטית within perfused parenchyma נפצע. 22 הצפיפות האופטית היא ביחס ישר לחדירות של BBB כאשר EB כבר דהויה של כלי הדם בקליפת המוח שלאחר המוות על ידי זלוף transcardiac. עם העיבוד המיידי של מוח הצבעוני TTC בבעלי חיים עם ממשל EB, שני נפח האוטם ושיבוש BBB ניתן לכמת בצורה יעילה. יש לציין, עם זאת, כי פגיעה עצבית וההפרעה BBB אינם תהליכים מקבילים במוח השבץ-פוסט, 23,24 כך את הבחירה של זמן של הקרבה הוא שיקול חשוב.

הפרוטוקול שלהלן מפרט את שיטת RHP, שיטת tMCAo גרימת חסימת עורקים זמנית שמודלי חסימות אמצע מוחי עורק בחולים אנושיים, ושיטות היסטולוגית הכפולה לקביעת נקודות קצה פציעת שבץ עצבית וכלי דם. TTC מודד מוות של תאים ונזק לרקמות מצטברות, המאפשר לכימות של כרך אוטם כוללUme, בעוד EB מספקת לכימות חצאי המוח של נזק BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) בדרום המרכז הרפואי UT שפועלת לפי המכון הלאומי למדיניות בריאות (NIH) לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים.

1. חוזר חוסר חמצן אכשור קד

  1. עיצוב מותאם אישית ארבע מדידת תצרוכת על רגולטורי גז ולצרף לתאי אינדוקציה 15 L סטנדרטיים עם צינורות PVC כדי לאפשר גז דחוס מהחמצן (2 O) טנקים לזרום לתוך התאים באמצעות נמל כניסה. ראה ציוד וחומרים לפרטים נוספים על עיצוב מותאם אישית.
  2. לחלק עכברים לתוך 2 קבוצות: חוזר חוסר חמצן אכשור קד (RHP) קבוצה, שתקבלנה חשיפות 8% ו -11% O 2, וקבוצת הבקרה, שתקבלנה חשיפות 21% O 2 (אוויר חדר) במקביל. ראה טבלת 1 לשינויים בתדירות, עצימות (8 ו -11% O 2 או 21% O 2), ומשך (2 או 4 שעות) של חשיפות RHP. </ Li>
  3. הסר את מכסה המסנן העליון של כל כלוב ולמקם את הכלוב, עם בקבוקי מים ומזון בשלמות, בתאים מחוברים לO בהתאמה 2 הטנקים שלהם. סגור ולאבטח את המכסה של התא.
    1. פתח את ברז הגז הראשי לטנקים ולהגדיר את הזרימה הראשונית לכל תא אינדוקציה 2 ליטר לדקה (LPM) במשך 5 דקות הראשונות של חשיפה. להפחית את קצב הזרימה לLPM 1 לשארית החשיפה.
    2. בסוף החשיפה, להפחית את הזרימה ל0 LPM ולסגור את שסתום הגז לטנקים.
    3. פתח את המכסים קאמריים ולהחליף את המכסה העליון מסנן בכל כלוב. מניחים את הכלובים בדיור סטנדרטי עד חשיפת חוסר חמצן הבאה.
  4. לרסס את כל חדר אינדוקציה עם NPD (Steris) או חומר חיטוי / מפיג ריח שווה ערך לאחר כל שימוש.
  5. לחשוף 21% ושני עכברי RHP באותו הזמן של היום במהלך שבועיים, כמתואר בטבלה 1.

2. חלוףחסימת עורק המוח אמצעית (tMCAo)

  1. ראה דיון לפרטים נוספים על העיתוי של שבץ בעקבות חשיפת RHP סופית.
  2. הכן מקום עבודה ניתוח ספטית. מקום עבודה שמסביב נקי עם אתנול 70% או חיטוי שווה ערך וחיטוי כל הכלים כירורגיים.
    1. להגדיר את מכשיר הלייזר דופלר Flowmetry (LDF) כדי למדוד שינויים יחסי בזרימת דם במוח (CBF). הפעל את כרית החימום עד 37 מעלות צלזיוס. הפעל את החממה עד 34 מעלות צלזיוס.
  3. הרדימי עכברים עם חשיפה קצרה לתערובת של 4% isoflurane / 70% מס '2/30% O 2 בתא אינדוקציה קטן. אשר הרדמה תקינה על ידי אורח קל צובט את הכף. אם העכבר ייסוג כפתה, להחזיר את העכבר לתא האינדוקציה ולהמשיך חשיפת isoflurane.
  4. הסר עכברים מתא האינדוקציה ההרדמה ולהוסיף במהירות את האף של העכבר בחרטום. פתח את זרימת הגז לחרטום, סגירת זרימה לanesthesia תא אינדוקציה.
    1. מבלי לשנות את NO 70% 2/30% O 2 תערובת גז, לתקן isoflurane על 1.8% כמנת תחזוקה למשך השארית של ההליך. הנשימה צריכה להישאר איטית וקבועה לאורך כל ההליך, אלא אם נשימה הופכת מהירה ורדודה, להגדיל את מינון isoflurane. מינון תחזוקה עשוי להשתנות בין ייצור ציוד ובעלי החיים המשמשים בניסוי.
  5. באמצעות microshaver, לגלח את השיער באזור הזמני בין הפינה של העין ואת האוזן, כמו גם קו האמצע הגחון של הצוואר. הסר פרווה עודפת וליישם חומר סיכה עינית עם מקלון צמר גפן סטרילי כדי לשמור על הקרניות מהתייבשות במהלך ההליך. נגב את אזור חתך עם רפידות אלכוהול וprovidone-יוד ספוגית עם מקלון צמר גפן סטרילי כדי לשמור על תנאים אספטיים.
  6. לנהל משככי כאבים על פי הנחיות כירורגית מכרסמים.
  7. עושה חתך דרך העור הזמני בין העין והאוזן.לחשוף את השרירים temporalis. שימוש במייקרו-מספריים כירורגיות, לחתוך את רצועת שרירים הזמנית ברכס הזמני בתוך השטח של striation שריר הלבן.
    1. דחף בעדינות את חלק הארי השריר רוחבי עם מלקחיים כדי להמחיש את עורק המוח האמצעי (MCA) דרך הגולגולת. לאחר החתך של השריר הזמני, האזור עלול להתמלא בדם. בעדינות להשתמש מקלון צמר גפן כדי לעצור דימום פוטנציאלי.
    2. מקד את קצה הבדיקה LDF לאזור MCA. רשום את הכלי נבחר אזור זה משתנה בין עכברים.
    3. החזק את LDF במקום ומיושר עם הגולגולת עד שטף תאי דם אדום יציב הוא לקרוא ולהקליט ערך זה כCBF הבסיס. CBF בסיס האידיאלי בליזר דופלר Flowmetry הוא> 600 שטף, אבל זה ישתנה עם יצרן. אם CBF הבסיס הוא <400 שטף, זרימת ההקלטה היא סיכוי טוב ביותר מווריד בקרבת מקום, או מיקום לא שלם של החללית על כלי היעד.
  8. לאחר CBF הבסיס הוקם, repositiעל העכבר, כך שהצוואר חשוף. התמיכה ראשה ולשמור על העכבר בהרדמה יציבה מnosecone.
  9. לעשות חתך קו האמצע הגחון מממש מתחת ללסת התחתונה לעצם הבריח.
    1. בעזרת מלקחיים, בוטה לנתח כל fascia השטחי לחשוף את עורק תרדמה המשותף שמאל (CCA). הפרד את המרכז לאמנות עכשווית מרקמת חיבור והעצב התועה.
    2. באופן קבוע ולקשור המרכז לאמנות עכשווית עם תפר 6.0 משי. מניחים את תפר ligating כהפרוקסימלי ככל האפשר כדי לאפשר מספיק מקום להגורם לחסימת מיקום נימה.
    3. לולאה ורופפת לקשור תפר משי 6.0 שני סביב דיסטלי המרכז לאמנות עכשווית לתפר המיסוך. היזהר שלא לחסום את העורק כחוט המיסוך יהיה בהמשך להיות מושחל דרך הראש.
    4. השתמש מהדק areterial serrafine מייקר 8 x 2 מ"מ אור כדי לצבוט דיסטלי המרכז לאמנות עכשווית לתפר משי רופף-קשור. רם בעדינות את המרכז לאמנות עכשווית עם מלקחיים ולעשות חתך אורכי קטן, כהפרוקסימלי לתפר ligating כאפשרי עם 3 Vannas מ"מ.
    5. נושא נימה מצופה סיליקון 12 מ"מ 6.0 מד מיסוך ניילון דרך החתך להיכנס ללומן העורק, ולאחר מכן לקדם אותו כמה מ"מ. באופן רופף להדק את תפר משי הרופף השני סביב קצה חוט המיסוך על מנת להבטיח את זרימת דם לא לדחוף את החוט מהמרכז לאמנות העכשווית ולהסיר את המהדק העורק.
    6. בהסתעפות הראשונה של המרכז לאמנות העכשווית בעורק התרדמה הפנימית (רשפ"ת) ועורק התרדמה החיצונית (ECA), חוט חוט להט המיסוך לסניף תקין של ההסתעפות הראשונה שנכנס לICA.Advance נימה המיסוך 9-10.5 עבר מ"מ תפר המשי השני לתוך העורק השמאלי הפנימי הראשי (רשפ"ת).
    7. זמן קצר לאחר שנכנס ליק"א, לקדם את נימה המיסוך לסניף השמאלי בהסתעפות השנייה בין הרשפ"ת ועורק pterogopalantine (PPA). ויזואליזציה של PPA סביר כך להמשיך עד שאתה מרגיש התנגדות קלה עם מיקום מלא של חוט להט המיסוך.הרמת ICA עם מלקחיים עשויה לעזור לנימת חוט בקלות רבה יותר לסניף השמאלי של birfurcation השני. להדק את תפר המשי השני.
    8. הפעל את העכבר כך החתך מעל MCA גלוי. עם ציוד LDF, לאשר כי CBF חסום באמצעות קריאות LDF. חסימה מוצלחת היא הפחתה> 80% מCBF הבסיס.
    9. לחלוטין להדק וכפול-קשר תפר המשי השני סביב חוט המיסוך כאשר התנוחה הנכונה מושגת. במידת צורך, מעט לדחוף באו לשלוף את חוט להט המיסוך להשיג קריטריוני CBF לחסימה מוצלחת (למשל הפחתה> 80% מבסיס CBF).
    10. סגור את פתיחת הצוואר והראש עם תפרי 6.0 ניילון.
  10. מקום עכברים בחממת C ° 34 למשך החסימה. אורך מומלץ של חסימה הוא 60 דקות, אבל זה משתנה על פי גיל, הבדלי זן תלוי באנטומיה כלי דם במוח, 25 והיקף injury רצוי (קל, בינוני, קשה). ודא שחיות תחזורנה להכרה בתוך דקות של יורד הרדמה.
  11. -להרדים מחדש את החיות עם isoflurane, כמתואר בשלב 2.3, 5 דקות לפני תום תקופת החסימה מוגדר מראש, לפתוח את החתך בקרקפת ולאשר כי זלוף MCA עדיין מופחת באמצעות קריאות LDF transcranial. אם CBF לא מצטמצם במידה מספקת (למשל <CBF בסיס 20%), MCA יש reperfused בשלב מסוים במהלך החסימה והעכבר צריך להיות מחוץ ניסויים נוספים.
  12. פתח את החתך בצוואר קו האמצע ורופף לקשור תפר משי שלישי סביב המרכז לאמנות העכשווית, דיסטלי התפר השני משי אבל הפרוקסימלי להסתעפות המרכז לאמנות עכשווית, כדי להבטיח שעורק התרדמה החיצוני (ECA) יישאר קיימא לאחר נימה מוסרת.
    1. לחתוך או להתיר את הקשר שמחזיק את חוט להט המיסוך (כלומר, תפר משי שני) ולמשוך את חוט להט המיסוך לאט. ברגע שהוסר, לסגור במהירותתפר משי שלישי סביב המרכז לאמנות העכשווית כדי למזער זרימה חוזרת של דם מICA. פעמיים קשר תפר וזה לסגור את החתך עם תפרי 6.0 ניילון.
    2. למקם את העכבר כדי לכמת את הרמה של CBF לאחר 5 דקות של reperfusion. reperfusion המוצלח מוגדר בדרך CBF של> 50% של CBF תחילת המחקר, אך, כעם זרימת חסימה, חוקרים יכולים לקבוע קריטריון שלהם. אם בעלי חיים מפגינים CBF מתחת ל -50% מהבסיס שלהם, סביר להניח MCA הוא "באופן קבוע" יחסום, ובכך מייצג עוד קריטריון הדרת מחקר.
    3. סגור את שני החתכים עם תפרי 6.0 ניילון. לספק מלוח, הרדמה (לידוקאין), ואנטיביוטיקה לפי הנחיות מכרסמים. עם זאת כמה מנות קטנות של אנטיביוטיקה (3 מ"ג / קילוגרם של minocycline) כבר נמצאו להיות שבץ הבא neuroprotective. 26
  13. לאחר שהשיב את התודעה בחממה המחוממת לאחר ניתוח, עכברי מקום בכלוב נקי, סטרילי. לספק foo הלחתוספים תזונתיים או ד לחות תזונתיים ג'ל וצלחת פטרי של מים כמו החיות יהיו מוגבלות ניידות לאחר שבץ. לפקח מקרוב בעלי חיים במהלך התאוששות לכאב לאחר ניתוח מוגזם ומוות.

3. אוונס כחול הזרקה (EB)

  1. הזרק שעה EB 22 לאחר reperfusion וצריך לזרום בזרם הדם לשעה 2 לפני להקריב וצביעת TTC.
  2. תן פתרון EB להזרקה (2% EB מלוחים) ולערבב בעדינות בטמפרטורת חדר. פתרון סינון דרך נייר סינון או לדחוף דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מצורף מזרק קטן כדי להסיר EB שלא נמסה ולאחסן בטמפרטורת חדר.
  3. הכן את כמות הדרושה להזרקת EB (4 מיליליטר / קילו משקל גוף) צייר את הכמות הרצויה של צבע לתוך מזרק אינסולין 0.3 סמ"ק עם מחט מד 29 ולהבטיח שהפתרון הוא בטמפרטורת חדר
    1. לרסן את העכבר באמצעות עוצר תחתית שטוחה. החזק את הזנב כך הווריד לרוחב הוא uppermost. ורידים לרוחב נמצאים משני צדי קו האמצע של הזנב. החזק את קצה הזנב כדי לשמור על העכבר יציב להזרקה.
    2. הכנס את המחט לווריד כ 3.5 מ"מ, נזהר שלא לנקב את הווריד. ודא שהמחט היא ברוח ידי ציור את הבוכנה ומחפש עקבות של דם.
    3. להזריק כל הצבע במהלך דקות 1. אם הפתרון הוא הולך לווריד לא צריך להיות התנגדות מינימאלית כלחץ מוחל על המזרק. לאשר ממשל ורידים מערכתי מוצלח של EB על ידי שינוי צבע מיידי בזנב, הגפיים, והעיניים של העכבר.
    4. הסר את המחט מהזנב והעדינות להפעיל לחץ באמצעות גזה נקייה כדי לעצור את הדימום.
  4. בגין עיתוי כאשר העור של העכבר הופך לכחול. לאפשר EB לזרום לשעה 2 לחדור BBB נחלש.

4. 2,3,5- Triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) מכתים

  • זלוף וצביעת TTC צריך להתרחש 24 שעות לאחר reperfusion.
  • הכן פתרון TTC 2% לפני המועד המיועד להקרבה. הוסף 10 גרם של אבקת TTC 500 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו 0.01 M פוספט (PBS), pH 7.4. פתרון חום עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להקל solubilizing של TTC. זהירות: אבקת TTC ופתרון הם עור, ריאות, וגירוי בעין. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול בחומרים אלה.
    1. ברגע שהאבקה נמסה לגמרי, מייד להעביר לבקבוק, כיסוי בנייר כסף, וחנות על 4 מעלות צלזיוס. TTC והרקמה צבעונית עם TTC הם רגישים לאור.
  • בגיל 24 שעות לאחר tMCAo ושעה 2 לאחר מתן EB, להקריב את החיה עם מנת יתר isoflurane בתא אינדוקציה קטנה. זלוף צריך להתחיל מייד לאחר sacricice כדי למזער autolysis שמתחיל בהיעדר חמצן לאחר מוות.
  • במהירות לאבטח את בעלי החייםעל פלטפורמת קלקר עם אמות תלו באמצעות כפות. חותך חתך רוחב דרך קיר הבטן מקו האמצע ממש מתחת לבית החזה. בזהירות לחתוך דרך הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
    1. התחל משאבת זלוף ב 5 מיליליטר / קצב זרימה דק עם מזרק 60 סמ"ק מלאים בקרח הקר 0.01 M PBS ומחובר למחט עירוי מכונף 27 מד. הנח את קצה המחט על 0.5 סנטימטר לתוך החדר השמאלי של הלב וחתך את אטריום ימין. בהדרגה דם ורידים בדילול צריך לזרום החוצה של אטריום בזלוף עד דם ורידים מופיע חסר צבע. Transcardially perfuse מלוח 30 מיליליטר 0.01 M פוספט (PBS) דרך הלב.
  • הוסף 5 מיליליטר של תמיסת TTC ל -20 בקבוקי נצנץ שקופים.
  • מייד לאחר זלוף, לערוף את בעלי החיים ולנתח את המוח באמצעות מספריים קטנים ומרית במידת צורך. בדוק את המוחות להוציא בעלי חיים שעברו hemorrha תת-עכבישיםGE במעגל ויליס, המשני למיקום תפר. בדוק שחצי הכדור הנגדי לMCA החסום מופיע חיוור, ללא דליפת EB מורגשת או בצקת.
  • יוצקים PBS לתוך מטריצת מוח אקריליק שנועדה להפוך את סעיפי עטרה עבים 1.0 מ"מ של מוח עכבר. מניחים את המוח, צד גב, לתוך המטריצה ​​ויוצקים מייד PBS על המוח. שמור את המוח לח.
    1. הסר את נורות חוש הריח על ידי החדרת להב עבה 0.21 מ"מ נירוסטה לחריץ השני מהצד מקורי של מטריקס.
    2. הסר את המוח הקטן על ידי החדרת להב בחריץ הרביעי מהצד הזנב של מטריקס.
    3. הכנס להב לתוך חריץ אמצע החריצים שנותרו במטריצה. הכנס את הלהבים שנותרו, באופן שווה שחצתה את הרקמה שנותרה על מנת להבטיח רוב אפילו ההפצה של רקמות במהלך החיתוך.
    4. ברגע שכל הלהבים הוכנסו, להוסיף 1-2 טיפות של PBS למוח כדי ללחלח אותו.
    5. הסר את הלהבשל אחד בכל פעם מהמטריצה ​​מתחילה עם האזור מקורי. שמור 7 פרוסות הראשונות לניתוח TTC לאחר tMCAo. השתמש מרית קטנה כדי להעביר בזהירות את הפרוסות מהלהב לבקבוקון המלא-TTC.
  • לאחר כל החלקים נמצאים בבקבוקון, הכובע ואת המקום באמבט מים חם עד הסעיפים להפוך ורוד. בעדינות להפוך את הבקבוק באמבטיה במידת צורך, כדי למנוע חפיפה סעיף, אשר עלול להוביל להכתמה אחידה. לאחר מכן להיפטר TTC ויוצקים פתרון paraformaldehyde 4% לבקבוקון כדי לכסות חלקים במוח כדי לסיים את התגובה הכימית TTC.
  • מייד לסדר את החלקים ב" x 3 "שקופיות זכוכית נקיות 1 ולכוון את החלקים ממקוריים לזנב.
    1. כאשר החלקים מסודרים בשקופית, לסרוק השקופיות באמצעות סורק סטנדרטי. הגדר את הרזולוציה במינימום של 600 dpi לניתוח תמונה. הקפד לכלול את שמו של בעל החיים ושליט מטרי בתמונה הסרוקה.
    2. לוח מחיק השקופיתולסרוק את הצד האחורי כדי להבטיח את כל הנתונים שנאספו.

    • 5. כימות נפח אוטם

    1. לכמת את נפח האוטם באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית (למשל, ImageJ).
    2. סריקת תמונות ברזולוציה גבוהה (למשל 600 dpi) לניתוח נאות. חיתוך תמונות. סטנדרטיזציה של קנה המידה לכל התמונות באמצעות הסרגל מטרי הכלול בתמונה הסרוקה.
    3. חשב את הנפח הכולל של האונה הנגדית באמצעות הנוסחא הבאה. חזור על נוסחה זו כדי לחשב את הנפח הכולל של חצי הכדור ipsilateral.
      סכום של אונה הנגדית הכוללת של כל עובי פרוסה x הפרוסה
    4. חשב את נפח האוטם העקיף. . בקרה לבצקת ipsilateral משבץ על ידי שימוש בחצי הכדור הבריא, הנגדי כביקורת 27 השתמשו בנוסחא הבאה כדי לחשב את נפח האוטם העקיף:
      נפח כולל של אונה הנגדית -
      (Volum סה"כדואר של חצי הכדור ipsilateral -Average נפח של 3 מדידות של אוטם)

    6. מחסום דם-מוח כימות (BBB) ​​Integrity

    1. כדי להתכונן לכימות EB, שוקל ראשון 2.5 אינץ 'שוקל סירות. רשום את המשקל ואת תווית שתי לשקול סירות עבור כל חיה: אחד לחצי כדור ipsilateral ואחד לאונה הנגדית.
    2. לאחר סריקת החלקים הצבעוניים TTC, לחצות כל קטע עם סכין גילוח חד פעמי לאונות ipsilateral ונגדיות. מניחים את החצאים ipsilateral מכל 7 הסעיפים בסירה לשקול ולהקליט את המשקל. חזור לאונה הנגדית.
    3. מייד להעביר את סירות משקל לסט תנור 56 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    4. לשקול את החלקים היבשים. העבר את שני חצאי הכדור לתוך צינורות 1.5 מיליליטר נפרדים microcentrifuge.
      1. לחשב את כמות דרושה לפוראמיד כל חצי הכדור (8 מיליליטר / גרם של רקמה יבשה), ולהוסיף לmicrocentrifug שלהםצינורות דואר. פוראמיד הוא רגיש לאור ולכסות את כל הדגימות שטופל פוראמיד בנייר כסף מנקודה זו ואילך.
      2. העברת צינורות microcentrifuge לחממה מוגדרת 56 מעלות צלזיוס במשך שעה נוספת 48.
    5. לאחר שעה 48, פיפטה את supernatant הכחול לקבוצה נוספת של צינורות microcentrifuge שכותרת. לדחוף רקמה לחלק התחתון של הצינור למקסם את עוצמת הקול של supernatant חילוץ. שמור את הצינורות של supernatant ולהיפטר מכל הרקמה.
    6. הכן דילולים סידוריים מעריכי של EB בפוראמיד לעקומה סטנדרטית. כולל 1 (פוראמיד בלבד) פתרונות ריקים ולאחר מכן 10 מעריכי מ0.125 UG / מיליליטר באמצעות 64 UG / מיליליטר של EB בפוראמיד.
      1. פיפטה 300 μl של דילולים עשו לעקומה סטנדרטית לתוך צלחת 96-היטב. פיפטה 300 μl של supernatant לתוך בארות מקבילות.
      2. מדוד את הספיגה בספקטרופוטומטר ב620 ננומטר.
      3. השווה את העקומה סטנדרטית של דילולים EB עם o ספיגתו דגימות supernatant. הצפיפות האופטית היא ביחס ישר לשלמות של BBB.
      4. תניח את הצפיפות האופטית של האונה הנגדית כרקע ולהשתמש בנוסחא / הנגדית (ipsilateral-הנגדית) כדי לקבוע שינוי קיפול. לפרטים נוספים על ניתוח סטטיסטי לראות אל מרטין ואח., 2010. 18

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    מחקר זה כלל 25 עכברי זכרים השוויצריים וובסטר שהיו 10 שבועות של גיל בתחילת האקראית לRHP (n = 10) או 21% O 2 קבוצות (n = 15). שבועיים לאחר חשיפת RHP הסופית, ניתוחים בוצעו, עם קבוצות שהתעוורו ומתאזנים בין ימים. בעקבות tMCAo, עכבר 1 מת במהלך התאוששות שלאחר ניתוח ועכבר 1 לא נכלל במחקר, כי זה לא עומד בקריטריון CBF reperfusion. שני העכברים נכללו היו מקבוצת 21% O 2. בהתאם להנחיות לאסוף נוסעות, 28 טבלה 2 מראה פרמטרים כירורגית. כרכים עקיפים אוטם, נפיחות חצאי המוח (בצקת כלומר,), ואוונס כחול extravasations (EB) מוצגים באיור 2. כל הנתונים נותחו עם מבחני t מזווגים (ממוצע, סטיית תקן מוצגת), וחריגים מזוהים עם שיעור גילוי שווא פחות מ 1% (GraphPad פריזמה), אשר הסירו 4 חריגים (2 מ -21%, 2 מRHP) מקבוצת נתוני EB.

    התחת = "jove_content"> בקבוצה זו, RHP מופחת כרכי אוטם כמעט בחצי (33.9 ± 23.0 מ"מ 3) לעומת 21% O 2 עכברי -treated (62.6 ± 42.6 מ"מ 3), אך הבדל זה היה בלתי מובהק (p = 0.10). עם זאת, ניתוח מלכתחילה כוח חזה n = 10 לכל קבוצה נדרשה, שלא השיגה את עם העכברים שטופלו RHP לאחר חריגים הוסרו. זה צריך להיחשב בתכנון ניסויים עתידיים באמצעות RHP. לא הייתה שום השפעה על RHP נפיחות חצאי המוח, מדד נגזר מניתוח נפח TTC שיכול להיות מזוהה עם בצקת. 6 עכברים שטופלו RHP הציג מגמה (p = 0.05) בהפחתה של ההפרעה BBB בחצי כדור איסכמי המנורמל ל האונה הנגדית. איור 2 ד מציג מגוון של ערכים לEB דליפה בשתי קבוצות הטיפול.

    איור 1
    איור 1:. תאי RHP-תוכנן מותאם אישית פנל עליון מתאר את תזרים מטרים שהותקן לניטור פרט של זרימת אוויר בעד ארבעה תאים. צינורות בלתי חדירים האוויר מוצג עוזבים את מד הזרימה וחיבור לנמל הכניסה של חדר האינדוקציה 15 L בפנל התחתון. פתח יציאה נשארת פתוחה במהלך RHP כדי לאפשר זרימת אוויר.

    איור 2
    איור 2:.. RHP מפחית כרכי אוטם וBBB שיבוש RHP () מפחית כרכי אוטם על ידי 46% בהשוואה לעכברים לשלוט, אבל יש (ב) לא משפיע על נפיחות חצאי המוח נגזרות מנתוני TTC (ג) באותה חיות, RHP מפחית הפרעה BBB (p = 0.05) כהגדרתו על ידי אוונס הכחול לדלוף מנורמלים לאונה הנגדית. (ד) כתמי הנציג TTC משני O שטופל RHP ו -21% 2

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    חשיפה יחידה להיפוקסיה המערכתית (כלומר, 2 שעות של 11% O 2) בעכברים "זמני" מגנה על המוח מפני tMCAo, 29 כלומר התגובה אפיגנטיים לאתגר נפשית מראש חוסר חמצן הוא קצר-טווח, ואת הפנוטיפ הבסיס משוחזר ב ימים. מצגות חוזרות ונשנות של הגירוי נפשית מראש חוסר חמצן באופן דרמטי להאריך את משך הזמן של פנוטיפ neuroprotective. 6 מחקרים רבים הראו כי התדירות, עוצמה ומשך רכבת הגירוי חוזר על עצמו הם גורמים קריטיים של תגובה זו. לדוגמא, פשוט חוזר על אותה העצמה ומשך של היפוקסיה (חמצן 2 שעות של 11%) 3 פעמים בשבוע (MWF) מעל 2 שבועות לא להאריך את החלון הטיפולי להגנת עצבים וכלי דם מtMCAo, 6 אבל היו מספיק כדי לגרום ארוך סובלנות טווח איסכמי ברשתית. 30 באופן מעניין, אם כי 5 חשיפות להיפוקסיה המערכתית (5 שעות של 8% O 2 </ Sub>) במרווחים 6 ימים המוגנים חוץ נגד tMCAo מושרה 3 ימים לאחר חשיפת חוסר חמצן האחרונה, neuroprotection אבד אם 5 חשיפות חוסר חמצן הונחו בנפרד 3 ימים. 31 הסיבה להבדל זה עדיין לא ברורה, אך ייתכן כי עקב ל משך החמור היפוקסיה ביחס לפרוטוקול זה ו / או זמן התאוששות מספק בין אתגרי חוסר חמצן של חומרה זו.

    בקיצור, טיטרציה של אתגר חוסר חמצן החוזר מעבר לתחומי תדר, גודל, ומשך, נראה קריטי להתפתחות של סובלנות ואילו לא ישכנע פציעה, שלא לדבר על השפעות רקמות ספציפיות ואולי מינים ספציפיות. לדוגמא, 3 מתוך 9 חשיפות RHP כרוכים בחשיפה ל8% O 2 במשך 4 שעות, אם כי 6 שעות של 8% O 2 גורמת למוות עצבי בהיפוקמפוס. 32 לכן, חייבים להיות הקפדה על פרוטוקול RHP ביחס ל משך וחומרה של חשיפות חוסר חמצן כדי לגרום אנדוגניהגנה. למרות ההשפעה הפוטנציאלית של קצב היממה על הגנה מושרה נפשית מראש צריכה חקירה נוספת, 33 חשיפות RHP ביצוע באותו הזמן של יום לעוקבה מסוימת מפחיתה את הסיכון להשפעת בלבול פוטנציאלי. במונחים של מנה-תגובה ויעילות, התרחשה הגנת תיווך RHP החזקה ביותר משבץ מוקדי כאשר tMCAo היה מושרה 2 שבועות בעקבות החשיפה הסופית חוסר חמצן, 3 בתקופה שבי טופל RHP עכברים בריאים להציג פנוטיפ לדיכוי מערכת החיסון (ב היעדר פגיעת איסכמית). 7 נקודת זמן 2 בשבוע זה לא עולה בקנה אחד עם תקופת הגנה מקסימלי מפני פציעות במערכת העצבים המרכזית חריפות אחרות, או במערכות איברים אחרות. שני פרוטוקול RHP, והתכונות הזמניות של התגובה אפיגנטיים, יהיה ללא ספק צריכים אופטימיזציה עבור כל שימוש translational חדש.

    אחת המגבלות הגדולות ביותר של הליך tMCAo היא ההפצה הטרוגנית של VO האוטםlumes, כפי שמוצג על ידי קבוצת נתונים נציג זה. מחזור הביטחונות שניתן על ידי המעגל של ויליס, anastomoses leptomeningeal, וצמתים בטחונות גב יכול להוביל לאוטם כרכים עולים בקנה אחד. 34 וריאציות בין מעגל ויליס בזנים שונים של עכברים, כמו גם את הנוכחות והפתיחות של עורקים אחורי תקשורת, 25 , 35 נוספים יכולים להפחית עקביות של כרכי אוטם בתוך קבוצות. גודל מדגם חזק ושכפול הם לעתים קרובות יש צורך לייצר תוצאות חד-משמעיות ויש לכלול בעיצוב של הניסוי לאחר ההפעלה בהתאם. שיטות אחרות של אינדוקציה שבץ, שיטות איסכמי מוקדי במיוחד דיסטלי כגון חסימה של סניף MCA העיקרי באמצעות חור בר בגולגולת לרוחב, או photothrombosis סניפים מרוחקים של MCA, לעתים קרובות מייצרות פחות וריאציה בנפח פעימה. משיכות Photothrombotic מוגבלות, עם זאת, כפי שהם מייצרים בצקת תאית ו תאית בו זמנית, phenomenon לא ראה בשבץ איסכמי בבני אדם. 36 לעומת זאת, tMCAos יותר ישים ישירות להגדרה הקלינית כמעל 60% מכל מקרי השבץ בבני האדם להתרחש עקב חסימה של עורק המוח האמצעי. 37 לבסוף, ההרדמה שימוש במהלך tMCAo, isoflurane , הוכח לגרום neuroprotection. 38 על מנת לתת דין וחשבון לneuroprotection זה, רמות isoflurane צריכה להיות עקביות בין ניתוחים ובין קבוצות ניסוי טופלו ומטופל, ונשמר ב< 3% להפחתת השפעות נוירו את הפוטנציאל שלה. 39

    הזמן הוא קריטי גם בתהליך צביעת TTC. למרות שיש שונה גדול בספרות השבץ על הזמן שבו ניתן לבצע צביעת TTC לאחר איסכמיה, משתנים משעה 4 עד 7 ימים לאחר שבץ, 18,40 מכתים TTC צריך להתרחש ב24 עד 48 שעות לאחר שבץ על פי רוב כרכי אוטם עקביים וברור שהותוו. יש לי כרכי אוטם TTC דבורהn נמצא לייצב 24 שעות לאחר שבץ אבל אחרי 48 שעות, זרם של מקרופאגים לתוך מוח איסכמי עושה הגדרת נפח האוטם קשה. 14,40 יתר על כן, ההכתמה של רקמת המוח עם TTC צריכה לעקוב הקרבה מייד. עיכוב צביעה יקטין את האיכות של הכתם בגלל מות המיטוכונדריה מוגבר כתוצאה ממוות של בעלי חיים, לא האוטם מוחי. עלייה דומה במוות המיטוכונדריה תתרחש אם המוח לא נשמר לח במהלך החדרת הלהבים. בעוד פרוטוקול זה ממחיש באופן ברור את היתרון של ניתוח אוטם עם כתמי TTC, ניתן להשתמש כתמי immunohistological אחרים לכמת את האוטם הבא tMCAo הנפח. יש לי סגול cresyl או הכתמת fluoro ירקן דרישות זמן פחות נוקשה להכתמה לאחר הקרבה, אבל כתמים הקלאסיים אלה דורשים חלקים דקים מאוד מתקבלים על ידי cryostat או microtome, ולכן דורשים יותר זמן לסיכום וניתוח אינטגרטיבי. 14 יתר על כן, רח 'אלהains לא יכול לשמש בשילוב עם כימות EB של ההפרעה BBB, כפי שפותח על ידי אחר, 15 ומבטל את האפשרות של השוואה ישירה בין נפח אוטם והיושרה BBB במוח נתון. יש לציין שטופל RHP בעלי חיים בדרך כלל הציגו ורוד בניגוד לכרכים לבנים טהורים. 6 כדי למנוע סחף של אוטם בעכברים שטופלו RHP, אנו משתמשים בתקופה קצרה יותר לצביעת TTC כי תוצאות ברקמה בריאה ורוד יותר לעומת לאדום כהה. עיבוד הכחול אוונס יכול גם להכהות את אזור אוטם אוטמים לבנים כל כך טהורים סבירים עם כתמי הכימות כפולים הוצגו בפרוטוקול זה.

    על מנת להשוות כימות EB בתוך ובין קבוצות, כל בעלי החיים חייבים לעבור פעמים במחזור מקבילות לEB. אחרים הזריקו reperfusion מייד לאחר EB ואיפשר EB לזרום לעד 72 שעות, 41 או ב 4 שעות לאחר tMCAo להסתובב במשך 4 שעות, 15 כalternativדואר גישות. הסכום של EB שחוצה את BBB שיבש ונכנס רקמת המוח מייצג הצטברות האינטגרלית של צבע בכריכת אלבומין מזמן הזרקה לעת הקרבה. כך, בשיטה המתוארת במאמר זה חושף את מעמדו של BBB בדיוק בזמן שבין 22 ו -24 שעות של reperfusion, ועלולה להחמיץ פתחים או סגירות של המחסום מוקדם או במאוחר. לעומת זאת, בשיטה המועסקת על ידי אל ואנג ואח. חושף את מעמדו של BBB במשך 72 שעות לאחר שבץ, כולל כל השינויים במצב BBB בזמן הזה שבץ-פוסט 3 יום 42 גם פרוטוקול הוא טוב יותר או גרוע יותר.; אם כי יש עדיין סיכון של "חסר" פתיחה זמנית של BBB על ידי שימוש פעמים במחזור קצר יותר, זה מאפשר לחוקרים לזהות תכונות זמניות ספציפיות של הפתופיזיולוגיה BBB ולשייך אותו עם שיטות אחרות, כפי שמוצגים כאן. אחרים שילבו TTC וEB ידי הזרקת EB intracardially 1 דקות לאחר זלוף transcardial. 18 עם זאת, זו נפגשההוד הניב תוצאות לא עקביות, והוא הרבה יותר מסובך מאשר הליך הפרוטוקול שתואר לעיל.

    אחד מהכיוונים העתידיים המבטיחים ביותר לRHP הוא יישום translational של פרוטוקול נפשית מראש זה למצבי מחלה אחרים. חשיפות חוסר חמצן לסירוגין כבר מצאו להיות מגן בתנאים של מערכת העצבים המרכזית פרו-דלקתיים אחרים מאשר איסכמיה. במודל עכברים של מחלת האלצהיימר, 2 שבועות חשיפות יומיות 4 שעות להיפוקסיה hypobaric הפחיתו את ירידת הערך של שימור זיכרון ואובדן של תאי עצב בקליפת המוח לאחר זריקות תוך-מוחיות של בטא-עמילואיד. 43 היפוקסיה לסירוגין (2 שבועות חשיפות יומיות 15 שעות להיפוקסיה hypobaric ) גם נמצא מגן בחולדות הבאה L-buthionine- [S, R] -sulfoximine עירוי (L-BSO), מודל של פרקינסון שפוגע בשידור דופאמין striatal. 44 עם זאת, מודלים של אלצהיימר ופרקינסון אלה נחקרו רק השפעות קצר טווח שלנפשית מראש חוסר חמצן. 43,44 חקירת neuroprotection לטווח הארוך הנגרם על ידי RHP עשוי להיות כיוון עתידי פורה למחקר. יתר על כן, neuroprotection הנגרם על ידי RHP רשאי להאריך לשלמות שיפרה BBB במודלים של עכברים של מחלת האלצהיימר, שיכול להיות מנותח עם EB. 45 ניתוח TTC וEB הכפול יהיה אפילו יותר שימושי במודל פרקינסון כפי שגורם נגעי striatal 46 וBBB שיבוש, 47 אשר ניתן לכמת עם TTC 48 וEB, 49 בהתאמה. RHP בסך הכל הוא צורה פשוטה, חזקה של נפשית מראש עם פוטנציאל translational גדול כפי שהוא ייחודי גורם לטווח ארוך, אנטי דלקתי, והשפעות נוירו. הכימות הכפול של TTC וEB גם יכול להיות מיושם בקלות למצבי מחלה אחרות הכרוכים בשיבוש המיטוכונדריה, מוות של תאים, ודליפת BBB.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Flowmeters, regulators VetEquip, Inc Specialty order Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
    21% O2 tank AirGas OX USP200
    11% O2 tank AirGas Specialty order
    8% O2 tank  AirGas Specialty order
    15 L induction chambers VetEquip 941454
    Moor Laber Dopper Flow  Moor Instruments  moorVMS-LDF1-HP 0.8 mm diameter probe 
    High Intensity Illuminator  Nikon NI-150
    Zoom Stereo Microscope  NIkon SMZ800 Other surgical microscopes may be used. 
    Kent Scientific Right Temperature CODA Kent Scientific Corporation Discontinued Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
    Hovabator Incubator Stromberg's 2362-E Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
    V010 Anesthesia system  VetEquip 901807 Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
    250 ml isoflurane  Butler Schein NDC-11695
    D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer  Andis  #23905 Replacement blades are available from Andis (#23995)
    Betadine  Fisher Scientific 19-898-867 
    Q-tips Multiple sellers  Catalog number not available 
    Gauze Pads Fisher Scientific 67622
    Surgical drape Fisher Scientific GM300 
    Silk Sutures  Look/Div Surgical Specialties SP115
    Nylon Sutures Look/Div Surgical Specialties SP185
    Durmont #5 forceps (2)  Fine Science Tools  11251-35 Angled 45°
    Surgical Scissors Fine Science Tools  14028-10
    3 mm Vannas Kent Scientific Corporation INS600177 Straight blade
    Hartman Hemostats  Fine Scientific Tools 13002-10
    Occluding filaments Washington University Specialty order Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
    Evans Blue Sigma Aldritch E2129-10G
    Filter Paper  Sigma Aldritch WHA1001150 150 mm, circles, Grade 1 
    Weigh Boats Fisher Scientific 02-202-101 2.5" diameter
    0.9% Sodium Chloride Injection USP  Baxter Pharmaceutics  2B1321
    0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle Becton Dickinson Labware 309301
    Flat bottom restrainer  Braintree Scientific  FB M 2.0" diameter
    TTC Sigma T8877
    10x PBS, pH 7.4 Fisher Scientific BP399-20
    Water Bath Multiple sellers  Catalog number not available  Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
    Styrofoam board Multiple sellers  Catalog number not available 
    Large Syringe Kit PumpSystems Inc P-SYRKIT-LG
    Perfusion Pump PumpSystems Inc NE-300 
    60 cc syringe Fisher Scientific NC9203256
    27 gauge winged infusion set Kawasumi Laboratories, Inc D3K1-25G 1
    20 ml scintillation vial Fisher Scientific 50-367-126
    Stainless steel spatula Fisher Scientific 14-373-25A
    Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal CellPoint Scientific  Catalog number not available 
    0.21 mm stainless steel blades, 25 pk CellPoint Scientific  Catalog number not available  Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
    4% paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology  SC-281692
    Superfrost microscope slides  Fisher Scientific 12-550-15
    HP Scanjet G4050 Multiple sellers  Catalog number not available  Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
    ImageJ  National Institute of Health Catalog number not available 
    Analytical Balance Mettler Toledo  XSE 205U
    Precision Compact Oven   Thermo Scientific  PR305225M
    1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) Denville Scientific  C2170
    Formamide Fisher Scientific BP228-100
    96-well plates Fisher Scientific 07-200-9
    Epoch Microplate Spectrophotometer  BioTek  Catalog number not available 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
    2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
    3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
    4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
    5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
    6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
    7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
    8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
    9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
    10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
    11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
    12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
    13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
    14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
    15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
    16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
    17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
    18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
    19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
    20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
    21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
    22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
    23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
    24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
    25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
    26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
    27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
    28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
    29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
    30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
    31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
    32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
    33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
    34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
    35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
    36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
    37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
    38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
    39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
    40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
    41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
    42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
    43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
    44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
    45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
    46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
    47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
    48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
    49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

    Tags

    רפואה גיליון 99 היפוקסיה נפשית מראש חסימת עורק מוחית חולפת אמצע שבץ neuroprotection שיבוש מחסום דם-מוח
    כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M.,… More

    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M., Ortega, S. B., Plautz, E. J., Kong, X., Gidday, J. M., Stowe, A. M. Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (99), e52675, doi:10.3791/52675 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter