Abstract
I modsætning pattedyr, insekter, såsom Drosophila har flere smag organer. De chemosensory neuroner på benene, snabel, vinger og ovipositor af Drosophila udtrykker smagsmæssige receptorer 1,2, ionkanaler 3-6, og ionotropiske receptorer 7, der er involveret i afsløring af flygtige og ikke-flygtige sensoriske signaler. Disse neuroner direkte kontakt smagsstoffer såsom mad, skadelige stoffer og feromoner, og derfor påvirke mange komplekse adfærd, såsom fodring, æg-lægning og parring. Elektrode optagelser og calcium imaging er ofte blevet brugt i insekter til at kvantificere de neuronale reaktioner fremkaldt af disse smagsstoffer. Men elektrofysiologi kræver specialiseret udstyr og opnå målinger fra en enkelt smag sensillum kan være teknisk udfordrende afhængigt af den celle-type, størrelse og position. Desuden kan enkelt neuron beslutning i Drosophila være vanskeligt at opnå, da smag sensilla houSE mere end én type chemosensory neuron. Den levende calcium imaging her beskrevne fremgangsmåde giver responser af enkelt smagsmæssige neuroner i levende fluer, der skal måles. Denne metode er især velegnet til billeddannelse neuronale reaktioner på lipid feromoner og andre ligand typer, der har lav opløselighed i vandbaserede opløsningsmidler.
Introduction
Dyr er afhængige af olfaktoriske og gustatoriske oplysninger til at mægle beslutninger essentielle for overlevelse og reproduktion. Forstå, hvordan chemosensory tidskoder detekteres og behandles af nervesystemet kræver identifikation af den sensoriske receptor (er) og de tilsvarende kemiske ligander. Drosophila detektere en overvældende række flygtige og ikke-flygtige forbindelser og er en fremragende model til at studere de fysiologiske mekanismer der ligger til grund chemosensation. Mens de olfaktoriske organer opfatter flygtige molekyler er de smagsmæssige organer specialiseret til at opdage forbindelser lav volatilitet. Her præsenteres en metode til direkte at måle neuronale reaktioner fra smag organer Drosophila melanogaster til lav volatilitet, lipofile ligander.
Smagsmæssige organer i flue omfatter forbenene, snabel, og vinger. Fordelt på overfladen af smag organer er hårlignende strukturer kendt som sensilla der reagerer på sugars, bitter, salte, vand og feromoner 8. Den sensilla er blevet klassificeret morfologisk i smag børster og smag pegs 9. Der er omkring 31 smag børstehår på labellum der er klassificeret i den lange (L-typen), kort (s-type) og mellemprodukt (I-type) morfologier. 'L' og 's' sensilla hus 4 sensoriske neuroner, der reagerer fysiologisk til sukker (S celle), lav salt (L1 celle), høj salt og bitre forbindelser (L2 celle) og vand (W celle) 10 , 11. Jeg'et sensilla hus 2 sensoriske neuroner, hvoraf den ene reagerer både til lav salt og sukker, mens de andre reagerer på høje salt 12. Der er ca. 41 smag sensilla hos mænd og 26 sensilla hos kvinder fordelt på hver af forbenene. For både mænd og kvinder, der er 21 sensilla på midleg, og omkring 22 sensilla på bagbenene 13. Smagssansen neuroner omgivet af smagen sensilla på benene er også classified i L1, L2, W og S-typer.
En standardmetode til måling af elektrisk aktivitet fra enkelte neuroner anvender ekstracellulære eller intracellulære elektroder til registrering ion flow. Elektrodemålinger tillader neuronal funktion, der skal undersøges i ikke-modelorganismer såsom Drosophila arter, møl, og bier, som mangler omfattende genetiske værktøjer til neural mærkning. Men mens elektrofysiologiske metoder er blevet rutinemæssigt anvendes til at måle aktiviteten fra Drosophila smag sensilla 4,13,14, anvender denne metode giver flere tekniske udfordringer. Først smage børster skal identificeres på grundlag af morfologi og rumlig placering. Ved identifikation, kan elektrofysiologiske målinger blive hæmmet af den lille størrelse af sensilla, begrænset tilgængelighed på grund af position, og vanskeligheder med at anvende kontrollerede mængder af en kemisk stimulus til en smag børster. Ligeledes kan stimulering af sensilla generere signaler fra mere end énneuronal typen 15. For det andet, kan påvisning af elektriske signaler beskæmmes af baggrundsstøj som følge af mekaniske vibrationer og støj fra elektronisk udstyr. For det tredje kan anvendelsen af en skærpet elektrode beskadige flue præparat, hvis det anvendes forkert 14. Endelig samling af en elektrofysiologi rig kræver specialiserede elektroniske komponenter til stimulus levering, signaloptagelse og dataanalyse og kan være dyrt.
I D. melanogaster har tilgængeligheden af genetisk kodede værktøjer lettet udviklingen af billeddannelsesteknikker, der tillader svarene fra små populationer af neuroner, der skal undersøges. En sådan fremgangsmåde er anvendelsen af den CaLexA reporter 16. Ved denne fremgangsmåde er gensekvenser, der koder for LexA-VP16 transkriptionsfaktor og et calcium- følsom protein NFAT smeltet sammen. Calcium aktivering af proteinphosphatase calcineurin katalyserer de-phosphorylering af NFAT og til gengæld facilitaTES sin import ind i kernen. Inde i kernen, LexA domæne binder til en LexAop-DNA-bindende motiv, der styrer ekspressionen af et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter, hvilket tillader langvarig identifikation af funktionelt aktiverede neuroner. Den tilgang er blevet anvendt med succes til måling af, specifikke olfaktoriske glomeruli i antennal lap efter eksponering af levende fluer til et lugtstof 16. For nylig blev fysiologiske reaktioner af IR52c smagsmæssige receptor neuroner målt fra levende fluer ved hjælp CaLexA 7. Men for denne undersøgelse, var det nødvendigt at alder fluer i op til 6 uger, der kan forbedre GFP transkription. Mens immunfarvning med et anti-GFP antistof kan bruges til at sætte skub i CaLexA signal, vil denne metode kræver vævsfiksering, hvilket udelukker muligheden for live-cell imaging.
Den genetisk indkodede calcium indikator protein GCaMP er også blevet flittigt brugt til at studere neuronale reaktioner på en rækkearter 17. Proteinet GCaMP fluorescerer med lav intensitet før neuronal stimulation. Anvendelse af en stimulus udløser en handling potentiale i neuron, hvilket resulterer i tilstrømningen af Ca 2+. GCaMP, bundet til Ca2 +, undergår en konformationel ændring, får det til at fluorescere med lysere intensitet (figur 1). En nyligt udviklet enkelt neuron calcium imaging fremgangsmåde blev anvendt til at identificere glucose som liganden for forbenet specifikke Gr61a gustatoriske neuroner 18. I denne undersøgelse blev dissekeret forben fra transgene Drosophila udtrykker GCaMP i Gr61a smagsmæssige neuroner dækket med et lag af agarose før billeddannelse. brugen af dissekerede væv, kan dog forårsage eventuel nedtrapning af GCaMP udtryk, hvilket begrænser måling tid og påvisning følsomhed. Hertil kommer, agarose kan begrænse følsomhed på grund af høje baggrundsniveauer af fluorescens og dets lysspredningsegenskaber.
To løse nogle af disse ulemper, beskriver vi brugen af GCaMP-medieret calcium imaging at optage fysiologiske reaktioner fra forben og snabel smagsmæssige neuroner i intakte dyr. Vi viser de fysiologiske reaktioner i Gr68a og ppk23 neuroner udtrykker genetisk kodet GCaMP5G 19 til en Drosophila lipid feromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale reaktioner måles ved kvantificering af stigning i fluorescens af GCaMP5G signal under feromon stimulation. I denne protokol, er neuroner afbildet med en samlet varighed på 120 sek, hvilket er tilstrækkeligt til at differentiere mønstre af neuronal aktivering i individuelle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Kryds Gal4 3,22 driver linje til UAS-GCaMP5G 19 fluer (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Tillad indlægget til at vokse ved 25 ° C.
Bemærk: Generering flyver med flere kopier af Gal4 eller UAS-GCaMP transgener kan bidrage til at forbedre det fluorescerende signal intensitet. En tidligere udgave af UAS-GCaMP transgen (UAS-GCaMP3) viste meget svag fluorescensintensitet, når det udtrykkes under kontrol af den Gr68a-Gal4 driver.- Indsamle og separat ved sex nyligt eclosed voksne fluer og hæve ved 25 ° C.
Bemærk: baseline niveau GCaMP5G fluorescens er optimal i fluer alderen 14-28 dage. Isolering fluer efter køn udelukker muligheden for sociale interaktioner, der kan påvirke de neurale reaktioner.
- Indsamle og separat ved sex nyligt eclosed voksne fluer og hæve ved 25 ° C.
- Bedøver en flue under en mild strøm af CO 2.
- Fastgør fly til et dækglas ved først at placere en lille dråbe neglelak i centrum af en 0,17 mm dækglas. Anbring forsigtigt en flue på sin side på dråbe klar neglelak og sikre, at hele dråbe er dækket af fluen.
- Udfør trin 1.5 og 1.6 under en dissekere stereomikroskop, der anvendes ved 8X forstørrelse.
- Brug en våd pensel til at forlænge et forben af fluen. Fastgør forbenet i position ved at placere to tynde strimler af tape over første og femte tarsal segmenter (figur 2A). Dette vil udsætte haseled segmenter T2-T4 for imaging (figur 2B).
- Til billedet neuroner på snabel, placere en tynd stribe tape over talerstolen af snabel at eksponere labellum (figur 2C, D).
- Tegn en hydrofob barriere rundt fluen med en PAP pen for at forhindre opløsning i at strømme over dækglasset overflade. Foretag målinger inden for 30 minutter af montering.
2. Udarbejdelse af StimulusLøsning
- Fortynd lipofile ligander (såsom CH503, anvendt i denne undersøgelse) i en PBST-opløsning: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
- Lav en 1 mg / ml stamopløsning af liganden ved hjælp af PBST. Forbered alle efterfølgende fortyndinger af stamopløsningen hjælp PBST.
Bemærk: Afhængig af opløseligheden af liganden af interesse, kan forskellige opløsningsmidler være nødvendig for at opløse liganden. Opløseligheden af CH503 i forskellige opløsningsmidler er beskrevet i tabel 1. I modsætning til andre opløsningsmidler, havde PBST ikke medføre en stigning i fluorescens.
- Lav en 1 mg / ml stamopløsning af liganden ved hjælp af PBST. Forbered alle efterfølgende fortyndinger af stamopløsningen hjælp PBST.
3. Stimulering af Gustatory neuroner og Image Acquisition
- Anvendelse af en 10 pi pipette anbringes 10 pi PBST onto haseled segmenter.
Bemærk: Dette trin fugter ben og forhindrer tarsal segmenter glider. - Brug et optisk system, der har et kamera af sufficient hastighed og følsomhed for at opnå god fluorescenssignal med høj tidsmæssig opløsning.
Bemærk: Til denne undersøgelse anvendte vi en roterende skive konfokal mikroskop og en sCMOS kameraet (se Materialer List). - Vælg den specifikke tarsal segment og neuroner, der skal afbildes. Erhverve tre pre-stimulation konfokale Z-stakke.
- Ideelt set, erhvervelse brug indstillinger, der er hurtige nok til at tillade maksimal tid opløsning, mens du stadig fange hele cellen volumen. Indstillinger Eksempel erhvervelse er: 200 ms eksponering, udsmidningen 2 x 2 og 6 x 0,5 um 2 optiske sektioner, fanget hver 2 sek.
Bemærk: Immobiliserede benene er blevet afbildet med succes i op til 10 min, ved 30 sekunder intervaller, uden mærkbar blegning af GCaMP signal. Ved længere optagetider, at benene holdes meget fast på plads på dækglasset. - Optimer lasereffekt for højeste signal-til-støj kan opnås med minimal fotoblegning under hele imaging regime. For eksperimenterne beskrevet her, skal du bruge en 491 nm diode laser (100 mW) ved 30% transmission for billedbehandling både Gr68a og ppk23 smagsmæssige neuroner på benene og snabel. Brug 2 x 2 Binning at give mulighed for hurtigere lukkertider og stadig opnå tilstrækkelig rumlig opløsning.
Bemærk: strømindstillinger Laseren blev optimeret til at tillade detektering af fluorescerende forandring lige fra en 1,2 til 4,5 gange forøgelse.
- Ideelt set, erhvervelse brug indstillinger, der er hurtige nok til at tillade maksimal tid opløsning, mens du stadig fange hele cellen volumen. Indstillinger Eksempel erhvervelse er: 200 ms eksponering, udsmidningen 2 x 2 og 6 x 0,5 um 2 optiske sektioner, fanget hver 2 sek.
- Afpipetteres 10 pi af stimulus opløsningen på haseled segmenter. For kontrolforsøg, tilføje yderligere 10 pi PBST. erhverve straks 117 post-stimulations billeder.
Bemærk: Antallet af post-stimulation billeder optaget er baseret på den tid, hvor maksimal ændring i fluorescens blev nået (ca. 2 minutter).- KRITISK STEP: Mens pipettering løsning på forberedelse, ikke at røre fluen med pipettespidsen da dette vil medføre forbenet til at flytte ud af position.
Bemærk: Du kan også brugeen mikromanipulator til nøjagtig positionering en glaskapillar indeholdende stimulus tæt på tarsal segmentet, der skal afbildes. Lever kontrollerede mængder af stimulus ved anvendelse af et intracellulært mikroinjektion Dispenser ifølge producentens anvisninger.
- KRITISK STEP: Mens pipettering løsning på forberedelse, ikke at røre fluen med pipettespidsen da dette vil medføre forbenet til at flytte ud af position.
4. Billedbehandling og Analyse: Kvantificering af svaret
- Åbn en række konfokale Z-stakke hjælp Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 eller ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 billedanalyse og behandling software.
- Foretag en sum intensitet projektion af alle seks Z skiver for hver af de 120 tidspunkter.
- Vælg "Stack" under "Image". Endvidere skal du vælge "Z projektion" og indtaste "1" som start skive og "4" som stop-skive. For projektion, skal du vælge R20, sum skiver "fra rullemenuen, og vælg" Alle tidsrammer ".
- Definer området af interesse (ROI) ved hjælp af frihånd markeringsværktøjet til at tegne en afgrænsning omkring en celle krop eller neuronal projektion. Klik på "Analyze" etiket og vælg "ROI Manager" under "Tools".
- Kvantificer fluorescensen af ROI ved at vælge "Set målinger" valgmulighed under "Analyser" menuen og markere afkrydsningsfelterne for integreret tæthed, område, mener og maksimal grå værdi og etiket. Vælg derefter "More" under lederen menuen ROI, og vælg "Multi foranstaltning" valgmulighed yderligere.
Bemærk: Dette vil generere en popup boks med værdier for hver af de valgte parametre. - Kontroller den maksimale grå værdier for at sikre, at ingen af de pixels har nået mætning (f.eks 65.535 for en 16-bit-kamera).
BEMÆRK: forsøgene vist i thans papir, reaktioner blev målt enten fra celle organer eller neuronale projektioner, afhængigt af hvor der blev observeret den maksimale stigning i bf / F. - Beregne den maksimale relative ændring i fluorescens (bf / F) på tidspunkt t er som følger:
- Subtrahere baggrund fluorescens fra hver F (celle) værdi. For at kvantificere baggrundsfluorescens, måle den integrerede tæthed af en ROI af tilsvarende størrelse og form fra et område af forbenet (eller snabel) blottet for detekterbare neuroner.
- For at kvantificere den post-stimulation fluorescens, F (celle) t, måle den integrerede tæthed af ROI af cellelegemet eller proces på tidspunkt "t" efter stimulering.
- For at kvantificere den præ-stimulation fluorescens, F (celle) t = 0, analysere præ-stimulus billeder af cellelegemet eller proces på samme måde sompost-stimulation signal. Brug den gennemsnitlige integrerede tæthed af 3 billeder at bestemme F (celle) t = 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Indikatoren for GCaMP calcium blev genetisk udtrykt ved hjælp Gr68a-Gal4 eller ppk23-Gal4 chauffører. Forskellige populationer af forbenet neuroner og ikke-neurale støtteceller mærkes af hver driver (Figur 3A-C). Ligand-specifikke reaktioner på lipofile feromon CH503 blev observeret i Gr68a-Gal4 og ppk23-Gal4 celler, der udtrykker GCaMP (figur 3D). Den relative ændring i fluorescens intensitet GCaMP5G signal (bf / F) og øget med højere koncentrationer af CH503 (figur 3E). Interessant nok kan den 5 ng dosis CH503 undertrykke neurale respons.
Gr68a og ppk23 neuroner udstillet forskellige reaktionsmønstre. Gr68a neuroner viste en tonic mønster af neuronal respons (figur 3F), mens ppk23 neuroner viste en fasiske, oscillerende reaktion (figur 3G). Svar fra ppk23 neuroner i snabel var enLSO målt ved hjælp af denne forberedelse og udstillet en kombination af fasiske og oscillerende reaktioner (Figur 3H).
Figur 1:. Grundprincip GCaMP calcium imaging teknik GCaMP5G er genetisk udtryk i Gal4 -mærkede celler og fluorescerer med lav intensitet før neuronal stimulation. Anvendelse af en stimulus udløser en handling potentiale i neuron og forårsager Ca 2+ tilstrømning. GCaMP5G, når bundet til Ca2 +, undergår en konformationel ændring, hvilket resulterer i øget fluorescens (bf), der ændrer sig over tid. Basisliniefluorescensen (F) betegner fluorescerende signal intensitet før stimulation.
Figur 2: Montering en levende flue til afbildning af forbenet eller proboscis neuroner.(A) Montering forbenet: en 3,2x billede af en levende mandlig flue, der viser forbenene fastgjort til dækglasset med tape. (B) En 40X billede af fluen, der viser hvert af de haseled segmenter (T1-5) og placeringen af båndet over den første tarsal segment og på den femte haseled segmenter. (C) Montering af snabel: et stykke tape er placeret over talerstolen for at eksponere spidsen af snabel. (D) Den pipettespids til stimulus tilføjelse holdes lidt over flue og ikke komme i direkte kontakt med præparatet.
Figur 3:. Feromon-induceret neurale reaktioner i GCaMP-udtrykkende neuroner (A) Skematisk af den mandlige forben af Drosophila viser de rumlige positioner af Gr68a-Gal4 mærkede celler på haseled segmenter T2-4. Ikke-neurale celler (identificeret på basis af størrelse og form) er colored gul. (B) Rå fluorescerende billede af den mandlige forben viser neurale og støtte celler mærket af Gr68a-Gal4 driver. Scale bar = 50 um. (C) Skematisk af den mandlige forben af Drosophila viser de rumlige positioner af ppk23-Gal4 mærkede celler på haseled segmenter T2-4. (D) Respons af Gr68a- og ppk23 udtrykkende T4 neuroner til CH503 (kemiske struktur vist ovenfor). Den gennemsnitlige bf / F reaktion på CH503 blev sammenlignet med den gennemsnitlige bf / F efter anvendelse af PBST opløsningsmiddel alene; T-test med ulige varians (for Gr68a) eller Mann-Whitney-test (for ppk23): * p <0,05, *** p <0,001. Fejllinjer skildrer sem Statistisk power = 0,93. (E) En dosisafhængig ændring i Δ F / F er observeret i Gr68a neuroner i T4. T-test med ulige varians: ** p <0,01, *** p <0,001. Statistisk magt = 0,86-0,96. (F (G) En farvekodet tidsforløb viser en oscillerende, fasisk respons i GCaMP fluorescens efter CH503 stimulering (500 ng) af ppk23-udtrykkende neuroner. Positionerne af neuroner på forbenet er vist i den rå fluorescerende billede (til venstre). Målestokken: 10 um; tidsskala: 0-96 sek. Den ledsagende linje graf viser en sprængning svar fra en ppk23 neuron til stimulation med 500 ng CH503. Røde pil viser det tidspunkt, hvor den stimulus blev tilsat. Den maksimale RespoNSE forekommer ved 76 sek. (H) En farvekodet tidsforløbet af ppk23 udtrykker neuroner på snabel viser en sent debuterende tonic respons fra cellen kroppen og en oscillerende reaktion fra en axonal projektion efter CH503 stimulering (500 ng). Positionerne af cellerne er vist i den rå fluorescerende billede (til venstre). Scale bar = 10 um; tidsskala: 0-96 sek. Gengivet med tilladelse fra Shankar, S., et al. Neuropeptidet tachykinin er afgørende for feromon detektion i et smags- neurale kredsløb. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Klik her for at se en større version af dette tal.
| opløsningsmiddel 1,2 | Opløselighed CH 5 0 3 3 | Er opløsningsmidlet alene udløser neuronal aktivitet? 4 |
| 0,1% PBST | JA | INGEN |
| 100% Ethanol | JA | JA |
| 100% hexan | JA | JA |
| 10% Ethanol | INGEN | (Ikke testet) |
| 10% hexan | INGEN | (Ikke testet) |
| 100% DMSO | JA | JA |
| 10% DMSO | JA | JA |
| 0,4% DMSO | JA | JA |
| 0,2% DMSO | JA | JA |
Tabel 1:. Opløselighed af CH 5 0 3 i forskellige opløsningsmidler 1 DMSO:. Dimethylsulfoxid 2 ethanol, hexan, og DMSO-opløsninger blev i fortyndet med dH2O (vol / vol) 3 Opløselighed af CH503 i 0,2% DMSO blev begrænset. kun til 250 ng / ml. 4 Stigning i bf / F med opløsningsmiddel alene svarede til obserub efter stimulering med feromon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en metode til at udføre levende calcium billeddannelse af Drosophila perifere neuroner i 2 forskellige sanseorganer. Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende reaktioner i Gr68a-neuroner induceret af feromon ligand CH503 var dosisafhængig og kvantitativ. Det var også muligt at skelne forskellige neurale reaktionsmønstre såsom fasiske og tonic svar.
Neuroner viser fasiske reaktioner menes at ske en hurtig tilpasning til kontinuerlige stimuli. Denne type af reaktion er blevet forbundet med lugt detektion 25 og frembringelsen af rytmiske motoriske aktivitet mønstre 26. I modsætning hertil neurale svingninger, som er blevet beskrevet i mange sensoriske systemer, menes at synkronisere flere indgange på en enkelt postsynaptisk websted og til at give bestemte funktioner om stimulus 27. Den molekylære basis for svingninger forbundet med ppk23 neuroner endnu ikke er blevet rapporteret, at vores knowledge. I andre typer af exciterbare celler viser oscillerende reaktioner er hyppigheden af oscillationerne blevet vist at være reguleret af en proces kaldet calcium-induceret calciumfrigivelse 28. I denne proces er calcium frigivet fra interne lagre under styring af den sekundære messenger inositoltriphosphat, og hyppigheden af dets frigivelse er afhængig af styrken af det eksterne stimulus. Indsigt i den molekylære basis for tonic neuronale reaktioner er blevet opnået fra undersøgelser af ilt sensing receptorer af C. elegans 29. En forlænget stigning i calciumniveauer i neuroner viste sig at være medieret af L-typen spændingsafhængige calciumkanaler, ryanodine og inositoltriphosphat signalveje 29. Det vil være vigtigt at fastslå, om lignende mekanismer spiller en rolle i svarene fra ppk23 neuroner.
Levende calcium imaging kan tilpasses på flere måder til undersøgelse af andre populationer af
Adskillige tekniske considerationer er bydende nødvendigt at opnå stabile billeder og en nøjagtig måling af tidsforløbet for fysiologiske reaktioner. For det første skal forbenet være sikkert anbragt da fluen udviser kraftig bevægelse ved tilsætning af opløsningen, hvilket kan være en kilde til variation mellem præparater. Selvom bad anvendelse af feromon løsning tillader liganden at nå alle smagssansen sensilla på den udsatte haseled segmenter, kan nogle af opløsningen flyde mod andre dele af den monterede præparat. Også kunne forbenet potentielt drive væk, når der tilsættes opløsning. For det andet, for nøjagtigt billede næsten øjeblikkelig stigning i fluorescens, er det vigtigt at genoptage billeddannelse umiddelbart efter tilsætning af stimulus da nogle neuroner viser en hurtig og maksimal reaktion inden for 4 sekunders stimulering. Alternativt kan en kontinuerlig tidsserie kan påbegyndes forud for tilsætning af stimulus opløsning, og den nøjagtige tidspunkt, hvor stimulus indgives kan markeres.
lass = "jove_content"> blev der observeret to kilder til falsk positive svar. For det første kan opløsningsmidlet selv inducerer fluorescerende responser selv i fravær af en ligand. Den PBST opløsningsmiddel forårsagede en sådan reaktion i nogle ppk23-Gal4 mærkede celler. Desuden DMSO, et almindeligt anvendt opløsningsmiddel til polære og upolære molekyler, inducerede også et svar i nogle Gr68a-Gal4 mærkede neuroner. Det er derfor vigtigt at fastslå, om opløsningsmidlet selv inducerer et fluorescerende signal og for at vælge et opløsningsmiddelsystem med lav baggrund aktivitet. For det andet blev en stærk fasisk-type i ikke-neurale støtteceller observeret til opløsningsmidlet PBST alene. Den Gr68a-Gal4 driver udtrykkes i både neuroner og støtteceller, der synes at omgive nogle af neuroner og i almindelighed er større, amorphously formet, og mangler synlige fremspring. Det er derfor vigtigt at skelne neurale fra ikke-neuronale reaktioner for hver Gal4 linje, når du vælger ROIs.
_content "> En væsentlig begrænsning ved denne metode er, at den samme flue præparatet ikke kan anvendes til successive eksperimenter for at teste forskellige koncentrationer eller typer af ligander, medmindre den påførte stimulus først fjernes omhyggeligt fra overfladen af dækglasset. Desuden er denne metode kan ikke anvendes til high throughput billeddannelse af flere fluer på en gang, på grund af den høje forstørrelse nødvendige til visualisering af Drosophila-neuroner, og behovet for hurtig erhvervelse og høj tidsopløsning. Endelig kræver denne fremgangsmåde tilgængeligheden af genetiske værktøjer til transgen genekspression , hvilket begrænser anvendelsen primært til større modelorganismer.Alt i alt er denne fremgangsmåde en lettere alternativ til cellulære optagelser med elektroder og kræver ikke specialiseret instrumentering. Derudover, i modsætning til andre genetisk indkodede reportere såsom CaLexA dyret holdes i live gennem hele billeddannelse tillader fysiologiske reaktioner, der skal måles i real-tid med høj følsomhed i fluer i alle aldre. Denne funktion kan potentielt give til screening af aldersrelaterede afhængige reaktioner på ligander eller sammenligning af neurale reaktioner følgende ændringer i sociale forhold eller reproduktive tilstand. Desuden kan vedvarende optagelser udføres i mindst 10 min uden indlysende fotoblegning eller nedtrapning af GCaMP signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
