Abstract
포유 동물과는 달리, 이러한 초파리와 같은 곤충은 여러 맛 기관이있다. 다리, 코, 날개 초파리의 산란관의 화학 감각 뉴런 미각 수용체 1,2, 이온 채널 3-6, 휘발성 및 비 휘발성 감각 큐의 검출에 참여하는 이온 성 수용체 (7)를 표현한다. 이 신경 세포는 직접 식품, 유해 물질 및 페로몬 등 tastants 문의 따라서 이러한 공급, 달걀 누워와 결합 많은 복잡한 행동에 영향을 미친다. 전극 기록 칼슘 촬상 널리 이러한 tastants 의해 유발 된 신경 세포 반응을 정량화하는 곤충에 사용되어왔다. 그러나, 전기 생리학은 세포 유형, 크기 및 위치에 따라 기술적으로 어려울 수있는 하나의 맛 sensillum 특화된 장비 및 구하는 측정을 필요로한다. 또한, 초파리에서 단일 신경 세포 해상도는 맛 sensilla 허우 때문에 달성하기가 어려울 수 있습니다화학 감각 신경 세포의 자체 이상의 유형입니다. 여기에 설명 된 실시간 칼슘 이미징 법 라이브 파리 단일 미각 뉴런의 반응을 측정 할 수있다. 이 방법은 수성 용매에 대한 낮은 용해도를 지질 페로몬 및 기타 리간드 유형의 연결 반응을 영상화에 특히 적합하다.
Introduction
동물들은 생존과 재생에 필수적인 의사 결정을 중재하는 후각과 미각 정보에 의존합니다. 감지 신경계에 의해 처리하는 방법을 화학 감각 단서 이해하는 감각 수용체 (들) 및 해당 화학 리간드의 확인이 필요합니다. 초파리는 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 엄청난 다양성을 감지하고 생리를 연구하기에 좋은 모델입니다 메커니즘은 chemosensation을 기본. 후각 기관은 휘발성 분자를 감지하는 동안, 미각 기관은 낮은 휘발성 화합물을 검출하는 전문으로하고 있습니다. 여기서는 직접 저 휘발성 친 리간드 초파리 melanogaster의 맛 기관에서 신경 반응을 측정하는 방법을 제시한다.
파리의 미각 기관은 앞다리, 코, 날개 등이 있습니다. S 응답 sensilla 알려진 모발 형 구조는 미각 기관의 표면에 분포ugars, 쓴 맛, 소금, 물, 페로몬 8. sensilla 맛 강모으로 형태 학적으로 분류 된 맛은 9 쐐기. 긴 (L 형)으로 분류 된 labellum에 약 31 맛 강모, 짧은 (S 형) 및 중간 (i 형) 모폴로지가 있습니다. 설탕에 생리 학적 반응하는 'L'과 '의'sensilla 집 4 감각 뉴런 (S 셀), 저염합니다 (L1 세포), 높은 소금과 쓴맛 화합물 (2 계층 셀) 및 물 (승 전지) (10) 11. 다른 응답 동안 높은 소금 (12)에 낮은 소금과 설탕에 모두 응답 하나의 '난'sensilla 집이 감각 뉴런,. 남성의 약 41 맛 sensilla와 앞다리에 각각 분산 여성 26 sensilla이 있습니다. 둘 다 남성과 여성의 경우, midleg 21 sensilla 및 뒷다리 (13)에 대해 22 sensilla있다. 다리에 맛 sensilla로 둘러싸인 미각 신경 세포도 다 있습니다L1, L2, W 및 S 타입으로 lassified.
단일 뉴런에서 전기적 활성도를 측정하기위한 하나의 표준 방법은 이온 흐름을 기록하는 세포 또는 세포의 전극을 사용한다. 전극 측정은 신경 기능은 초파리 종, 나방, 신경 라벨링에 대한 광범위한 유전 적 도구가 부족 꿀벌로 비 모델 생물에서 공부 할 수 있습니다. 전기 생리 학적 방법을 일상적으로이 방법을 적용 4,13,14 sensilla 초파리 맛의 활동을 측정하는 데 사용되었지만 그러나, 여러 기술적 과제를 제시한다. 먼저, 칫솔모가 형태학 및 공간적 위치에 기초하여 식별되어야 맛. 식별되면, 전기 생리 학적 측정은 sensilla의 작은 크기에 의해 방해 될 수 의한 위치로 액세스 가능성을 제한 및 맛 화학적 자극 제어 된 양을 적용하는데 어려움이 모. 또한 sensilla의 자극은 하나 이상의 신호를 생성 할 수있다신경 세포 유형 15. 둘째, 전기 신호의 검출은 전자 기기로부터의 기계적인 진동과 노이즈로 인한 배경 잡음에 의해 혼동 될 수있다. 잘못 사용되는 경우 14 번째, 날카롭게 전극의 사용은 플라이 제조를 손상 할 수있다. 마지막으로, 전기 생리학 장비를 조립하는 자극 전달, 신호 기록 및 데이터 분석을위한 특수한 전자 부품을 필요로하고 비용이 많이들 수있다.
D.에서 melanogaster의 유전자 인코딩 툴의 가용성은 뉴런의 작은 집단의 반응을 조사 할 수 있도록 영상 기술의 발달을 촉진 하였다. 하나의 이러한 접근은 CaLexA 기자 (16)의 사용이다. 이 방법에서는 LEXA-VP16 전사 인자 및 칼슘 민감성 NFAT 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 융합된다. 단백질 포스파타제 칼시 뉴린의 칼슘 활성화 차례, facilita에서 NFAT의 탈 인산화를 촉진하고핵으로의 수입을 TES. 핵 내부에서 LEXA 도메인 따라서 기능적으로 활성화 된 뉴런의 지속적인 식별을 허용, 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자의 발현을 지시하는 LexAop-DNA 결합 모티프에 결합한다. 이 접근법은 취기 (16)에 라이브 파리 노광 다음 더듬이 로브 특정 후각 사구체의 응답을 측정하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 최근 IR52c 미각 수용체 신경의 생리적 반응은 CaLexA 7을 사용하여 실시간 파리에서 측정 하였다. 최대 6 주 GFP의 전사를 향상시키기위한 그러나,이 연구를 위해,이 나이에 파리에 필요했다. 항 GFP 항체로 면역 염색하면 CaLexA 신호를 강화하는데 사용될 수 있지만,이 방법에 따라서, 라이브 세포 이미징을위한 가능성을 배제 조직의 고정을 필요로한다.
유 전적으로 인코딩 된 칼슘 표시기 단백질 GCaMP는 광범위의 숫자에 신경 반응을 연구하는 데 사용되었습니다종 17. 단백질 GCaMP은 신경 자극하기 전에 낮은 강도와 형광. 자극의 적용은 칼슘의 유입의 결과로 신경 세포의 활동 전위를 트리거합니다. 칼슘 결합 GCaMP, 그것은 밝게 강도 (그림 1)과 형광 원인, 구조적 변화를 겪는다. 최근에 개발 된 단일 뉴런 칼슘 촬상 방법은 앞다리 특정 Gr61a의 미각 신경 (18)에 대한 리간드로서 포도당을 식별하는 데 사용 하였다. 본 연구에서는 Gr61a의 미각 뉴런 GCaMP 발현 형질 전환 초파리 해부 앞다리는 촬상 전에 아가의 층으로 덮었다. 그러나, 해부 조직의 사용에 따라서 측정 시간 및 검출 감도를 제한 GCaMP 발현의 최종 런을 일으킬 수있다. 또한, 아가로 인해 높은 형광 배경 레벨 및 광 산란 특성에 감도를 제한 할 수 있습니다.
티ㅇ 이러한 단점들을 해결, 우리는 앞다리와 코 그대로 동물의 미각 신경 세포의 생리적 반응을 기록하는 GCaMP 매개 칼슘 이미징의 사용을 설명합니다. 우리는 초파리 지질 페로몬 유 전적으로 인코딩 GCaMP5G 19 발현 생리 Gr68a의 반응과 ppk23 뉴런 (3 R, (11) Z 19 Z) -3- 아세 톡시 11,19-octacosadien -1- 올 (CH503) 20 표시 21. 신경 반응은 페로몬 자극 동안 GCaMP5G 형광 신호의 증가를 정량함으로써 측정된다. 이 프로토콜에서, 신경 세포에서 신경 개별 활성화 패턴을 구별하기에 충분한 120 초 총 지속 기간 동안 영상화된다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- (; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1,118w) UAS-GCaMP5G (19) 파리에 GAL4 3,22 드라이버 라인을 교차. 십자가가 25 ° C에서 성장 할 수 있습니다.
참고 : 생성은 형광 신호 강도를 향상하는 데 도움이 할 수있는 GAL4 또는 UAS-GCaMP 유전자의 여러 복사본으로 날아갑니다. Gr68a-GAL4 드라이버의 제어하에 발현 될 때 UAS-GCaMP 트랜스 (UAS-GCaMP3)의 이전 버전들은 매우 약한 형광 강도를 나타내었다.- 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다.
참고 : GCaMP5G의 개화의 기준 레벨이 14~28일 세 사이 파리에 최적입니다. 섹스에 의해 파리를 분리하면 신경 반응에 영향을 미칠 수있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제.
- 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다.
- CO 2의 온화한 기류 하에서 비행을 마취.
- f를를 부착LY 먼저 0.17 mm의 커버 슬립의 중심 매니큐어의 작은 방울을 배치하여 유리 커버 슬립에 관한 것이다. 부드럽게 명확한 매니큐어의 드롭 옆에 비행을 배치하고 전체 드롭이 즉시 적용되어 있는지 확인합니다.
- 8 배의 배율로 사용되는 해부 실체 현미경 아래 단계 1.5 및 1.6를 수행합니다.
- 파리의 앞다리를 확장 젖은 붓을 사용합니다. 첫 번째와 다섯 번째 눈꺼풀 세그먼트 (그림 2A)를 통해 테이프의 두 개의 얇은 스트립을 배치하여 위치에 앞다리를 고정합니다. 이 영상 (그림 2B)에 대한 눈꺼풀 부분을 T2-T4를 노출합니다.
- 프로보 시스에 이미지 뉴런 위해, labellum (그림 2C, D)를 노출하는 코의 연단을 통해 테이프의 얇은 스트립을 배치합니다.
- 커버 슬립 표면 위로 흐르는에서 솔루션을 방지하기 위해 PAP 펜으로 비행 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 설치 후 30 분 이내에 측정을합니다.
자극 2. 준비해결책
- 친 유성 리간드를 희석 PBST 용액 (예 : 본 연구에서 사용 CH503 등) : 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 0.1 % 트리톤 X-100 (V / V ); pH가 7.4.
- PBST를 사용하여 리간드를 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 만든다. PBST를 사용하여 모액의 모든 연속 희석액을 준비한다.
주 : 관심있는 리간드의 용해도에 따라 다양한 용매는 리간드를 용해 필요할 수있다. 다양한 용매 CH503의 용해도는하기 표 1에 기재되어있다. 다른 용매는 달리 PBST 형광의 증가를 생성하지 않았다.
- PBST를 사용하여 리간드를 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 만든다. PBST를 사용하여 모액의 모든 연속 희석액을 준비한다.
미각 신경 및 이미지 획득 3. 자극
- 10 μL의 피펫을 사용하여 눈꺼풀 세그먼트에 PBST 10 μl를 배치합니다.
참고 :이 단계는 다리를 습하게하고 표류에서 눈꺼풀 세그먼트를 방지 할 수 있습니다. - SU의 카메라를 지닌 광학 시스템을 사용fficient 속도와 감도가 높은 시간 해상도에서 좋은 형광 신호를 달성했다.
참고 :이 연구에서 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경과 sCMOS 카메라 (자료 목록 참조)를 사용했다. - 특정 눈꺼풀 세그먼트와 신경 세포를 선택하는 이미징합니다. 세 가지 사전 자극 공 촛점 Z - 스택을 획득.
- 이상적으로, 사용 취득 설정이 여전히 셀 전체 볼륨을 캡처하는 동안 최대 시간 해상도를 허용하기에 충분히 빠르다. 예를 획득 설정은 다음과 같습니다 매 2 초를 캡처 × 2 2, 6 × 0.5 μm의 2 광학 부분을, 비닝 200 밀리 초 노출.
주 : 고정화 다리는 GCaMP 신호를 식별 할 수있는 표백으로 30 초 간격으로 최대 10 분 동안 성공적으로 묘화하고있다. 긴 녹화 시간의 경우, 다리가 커버 슬립의 위치에 아주 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. - 높은 신호대 전체 IMA 동안 최소 광표백로 달성을위한 레이저 출력을 최적화정권 카. 여기에 설명 된 실험을 위해, 영상 30 %의 전송에 다리와 코에 Gr68a 및 ppk23의 미각 신경 세포를 모두 491 nm의 다이오드 레이저 (100 mW의)를 사용합니다. 여전히 충분한 공간 해상도를 달성하면서 짧은 노출 시간을 허용하는 2 × 2 비닝 (binning)을 사용합니다.
주 : 레이저 출력 설정은 1.2 내지 4.5 배 증가의 범위에서 형광 변화의 검출을 허용하도록 최적화되었다.
- 이상적으로, 사용 취득 설정이 여전히 셀 전체 볼륨을 캡처하는 동안 최대 시간 해상도를 허용하기에 충분히 빠르다. 예를 획득 설정은 다음과 같습니다 매 2 초를 캡처 × 2 2, 6 × 0.5 μm의 2 광학 부분을, 비닝 200 밀리 초 노출.
- 피펫 눈꺼풀 세그먼트 상에 자극 용액 10 μL. 제어 실험을 위해, PBST의 또 다른 10 μl를 추가합니다. 즉시 117 이후 자극 이미지를 수집.
참고 취득한 후 자극 매수의 형광의 최대 변화에 도달 한 시간의 양 (약 2 분)에 기초한다.- 중요한 단계 :이 앞다리 위치에서 이동하게하기 때문에 준비에 솔루션을 피펫 팅하는 동안, 피펫 팁으로 비행을 터치하지 않습니다.
참고 : 또는 사용정확하게 눈꺼풀 부분에 자극 가까이를 포함하는 유리 모세관을 배치하는 미세 조작기는 이미지화된다. 제조자의 지시에 따라 세포 마이크로 인젝션 디스펜서를 이용하여 자극의 볼륨 조절을 제공한다.
- 중요한 단계 :이 앞다리 위치에서 이동하게하기 때문에 준비에 솔루션을 피펫 팅하는 동안, 피펫 팁으로 비행을 터치하지 않습니다.
4. 이미지 처리 및 분석 : 응답의 정량화
- 피지 (사용 공 촛점 Z - 스택의 일련의 열기 http://fiji.sc/Fiji ) 23 또는 ImageJ에 ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) (24) 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를.
- 120의 시점마다 여섯 Z 슬라이스의 합계 강도 투영을 만든다.
- "이미지"에서 "스택"옵션을 선택합니다. 또한, "Z 투사"옵션을 선택하고 정지 슬라이스로 시작 슬라이스 및 "4"로 "1"을 입력합니다. 프로젝션 타입의 경우, R을 선택20; 합 조각 모든 시간 프레임을 "풀다운 메뉴에서, 그리고 선택" ".
- 셀 몸이나 신경 돌기 주위에 경계를 그립니다 자유 선택 도구를 사용하여 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 은 "분석"레이블을 클릭하고 "도구"에서 "투자 수익 (ROI) 관리자"옵션을 선택합니다.
- 은 "분석"메뉴 아래의 "설정 측정"옵션을 선택하고 통합 밀도, 지역의 상자를 선택하여 투자 수익 (ROI)의 형광을 정량화 평균과 최대 회색 값과 레이블입니다. 그 후, 투자 수익 (ROI) 관리자 메뉴에서 "추가"옵션을 선택하고, 또한 "멀티 측정"옵션을 선택합니다.
참고 :이 선택한 각 매개 변수에 대한 값을 팝업 상자를 생성합니다. - 화소의 중에 포화 도달 했으므로되도록하여 최대 계조 값을 확인 (예를 들어, 16 비트의 카메라 65535).
참고 : 실험을 위해 t에 표시그의 종이, 응답은 ΔF / F의 최대 증가가 관찰되었다 위치에 따라 세포 기관 또는 신경 돌기에서 어느 측정 하였다. - 다음과 같은 시점 t에서 형광 (ΔF / F)의 최대 상대적인 변화를 계산이다 :
- 각 F (셀) 값에서 빼기 배경 형광. 배경 형광을 정량화하기 위해, 감지 뉴런없는 앞다리 (또는 코)의 영역에서 동등한 크기와 모양의 ROI의 통합 밀도를 측정한다.
- 포스트 자극 형광 F (셀) t 정량화 자극 후의 시각 "t"에서 전지 본체 또는 프로세스의 ROI의 집적 밀도를 측정한다.
- 예비 자극 형광을 정량하기 위해, F (셀) t = 0, 동일한 방법으로 상기 전지 본체 또는 프로세스의 사전 자극 이미지를 분석포스트 자극 신호. F (셀) t = 0을 결정하기 위해 3 이미지의 평균 집적 밀도를 사용합니다.
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Representative Results
GCaMP 칼슘 표시기는 유 전적으로 Gr68a-GAL4 또는 ppk23-GAL4 드라이버를 사용하여 표현 하였다. 앞다리 신경 세포와 비 신경 지원 세포의 고유 한 인구는 각 드라이버 (그림 3A-C)에 의해 표시된다. 친 유성 페로몬 CH503 리간드에 특이 적 반응 Gr68a-GAL4 관찰하고 ppk23-GAL4 세포 GCaMP (도 3D)을 표현. 상대적인 GCaMP5G 신호 (ΔF / F)의 형광 강도의 변화는 CH503 (그림 3E)의 높은 농도로 증가했다. 흥미롭게 CH503의 5 NG 도즈는 신경 반응을 억제 할 수있다.
Gr68a 및 ppk23 뉴런 다른 응답 패턴을 나타냈다. ppk23 신경 세포는 phasic, 진동 응답 (그림 3G)를 보여 반면 Gr68a 신경 세포는 신경 세포 응답의 강장제 패턴 (그림 3 층)를 보여 주었다. 프로보 시스에 ppk23 뉴런의 응답이 있었던LSO이 제제를 사용하여 측정하고 phasic 및 진동 응답 (도 3H)의 조합을 나타냈다.
그림 1 :. GCaMP 칼슘 이미징 기술의 기본 원리 GCaMP5G 유전자 GAL4 표현되어 세포 - 표지 및 신경 자극 이전에 낮은 강도와 형광. 자극의 적용은 신경 세포의 활동 전위를 유발하고 칼슘 유입을 발생합니다. 일단 칼슘 결합 GCaMP5G은 경시 변화 증가 형광 (ΔF)의 결과, 구조적 변화를 겪는다. 베이스 라인 형광 (F)는 이전의 자극에 형광 신호 강도를 의미한다.
그림 2 : 앞다리 또는 코 뉴런의 이미징 라이브 파리를 장착.테이프로 커버 슬립 체결 앞다리를 도시 라이브 남성 플라이의 3.2X 화상 (A) 앞다리 실장. 눈꺼풀 세그먼트 (T1-5) 및 제 눈꺼풀 세그먼트 위의 다섯 번째 눈꺼풀 부분에 테이프의 위치를 각각 나타내는 (B) 파리의 40X 이미지. 테이프 조각은 코의 선단을 노출 연단 위에 배치되어 프로보 시스 실장 (C). (D) 자극 추가에 대한 피펫 팁은 파리보다 약간 개최 및 준비와 직접 접촉하지 않습니다.
그림 3 :. GCaMP 발현 뉴런의 페로몬에 의한 신경 반응은 Gr68a-GAL4의 공간적 위치를 보여주는 초파리의 남성 앞다리의 (A) 도식은 눈꺼풀 세그먼트 T2-4에 세포를 표지. 비 - 신경 세포 (크기 및 형상에 기초하여 식별)은 공동 있습니다노란 lored. (B)를 Gr68a-GAL4 드라이버 표지 신경 및 지원 세포를 보여주는 남성 앞다리의 원시 형광 이미지입니다. 스케일 바는 50 μm의 =. 의 공간적 위치를 나타내는 초파리의 남성 앞다리의 (C) 도식 ppk23는-GAL4 눈꺼풀 세그먼트 T2-4에 세포를 표지. (D) CH503에 Gr68a- 및 ppk23 발현 T4 뉴런의 응답 (화학 구조는 위 그림 참조). CH503에 대한 응답의 평균 ΔF / F는 평균 ΔF 비교 / PBST의 F 다음 응용 프로그램은 단독 용매 하였다 불평등 (Gr68a에 대한) 분산 또는 (ppk23에 대한) 맨 - 휘트니 테스트와 학생의 t- 테스트 : * P <0.05, *** p <0.001. 오차 막대는 SEM 통계 전력을 묘사 = 0.93. (E) Δ F / F에서 용량 의존적 변화가 T4에서 Gr68a 뉴런에서 관찰된다. 동일하지 않은 분산과 학생 t 테스트 : ** p <0.01, *** p <0.001. 통계 전력 = 0.86-0.96. (F (G)는 진동을 나타내는 색으로 구분 시간 코스, ppk23 발현 뉴런의 CH503 자극 (500 NG) 다음 GCaMP 형광의 phasic 응답. 앞다리의 뉴런의 위치는 원료 형광 화상 (왼쪽)에 도시된다. 스케일 바 : 10 μm의; 시간 스케일 : 0-96 초. 첨부 선 그래프는 CH503의 500 NG에 의한 자극에 ppk23 신경 세포에서 파열 응답을 보여줍니다. 빨간 화살표는 자극이 첨가되는 시간을 나타낸다. 피크 RESPONSE는 76 초에서 발생한다. (H) 세포체에서 후기 발병 토닉 응답 및 CH503 자극 (500 NG)에 후속하는 축삭 돌기에서 진동 응답을 보여주는 코에 ppk23 발현 뉴런의 색으로 구분 시간 코스. 셀의 위치는 원료 형광 화상 (왼쪽)에 도시된다. 스케일 바는 10 μm의 =; 시간 스케일 : 0-96 초. 등 쉔카, S., 허가를 재현. 신경 펩타이드의 타 키키 닌은 미각 신경 회로 페로몬 감지를 위해 필수적이다. 도이 :. 10.7554 / eLife.06914 (2015) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용제 1, 2 | CH (5)의 용해도 0 ~ 3 세 | 용매를 단독으로 트리거 신경 세포의 활동을합니까? (4) |
| 0.1 % PBST | 예 | 아니 |
| 100 % 에탄올 | 예 | 예 |
| 100 % 헥산 | 예 | 예 |
| 10 % 에탄올 | 아니 | (테스트하지) |
| 10 % 헥산 | 아니 | (테스트하지) |
| 100 % DMSO | 예 | 예 |
| 10 % DMSO | 예 | 예 |
| 0.4 % DMSO | 예 | 예 |
| 0.2 % DMSO | 예 | 예 |
표 1 :. 다양한 용매에 CH 5 0 3의 용해도 1 DMSO :. 디메틸은 설폭 사이드 2 에탄올, 헥산, 및 DMSO 솔루션에 DH 2로 희석 하였다 O는 (v / v)의 0.2 % DMSO에 CH503의 3 용해도가 제한되었다. 만에 250 NG / ㎖. 혼자 용매 ΔF / F 4 증가는 obser에 해당했다페로몬과 자극에 VED.
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Discussion
우리는 여기에 2 개의 다른 감각 기관에 초파리 주변 신경 세포의 라이브 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 칼슘 2 +는 CH503은 용량 의존적 양적했다 페로몬 리간드에 의해 유도 Gr68a - 뉴런에서 GCaMP 형광 반응을 -evoked. 이 같은 phasic와 토닉 응답 등의 다른 신경 응답 패턴을 식별하는 것이 가능했다.
phasic 반응을 나타내는 신경 연속 자극에 빠른 적응을 할 수 있도록 믿어진다. 이러한 형태의 응답이 냄새 검출 (25) 및 리듬 운동 활동 패턴 (26)의 생성과 관련되어있다. 대조적으로, 다양한 감각 기관에 기술 된 신경 진동은 단일 시냅스 사이트에 다수의 입력을 동기화하고, 자극 (27)에 대해 고유의 기능을 전달하는 것으로 생각된다. ppk23 뉴런과 관련된 진동의 분자 적 기초는 아직 우리 KN에보고되지 않은owledge. 진동 응답을 도시 흥분성 세포의 다른 유형에서, 상기 진동의 주파수는 칼슘 - 유도 된 칼슘 증가 (28)이라고하는 공정에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이 과정에서 칼슘 이차 메신저 이노시톨 트리 포스페이트의 제어하에 내부 저장소에서 방출하고, 그 방출 주파수는 외부 자극의 강도에 의존한다. 토닉 신경 반응의 분자 적 기초에 대한 통찰력은 C.의 산소 감지 수용체에 대한 연구에서 얻은되었습니다 엘레 29. 신경 세포 내 칼슘 농도에서의 장시간 증가는 L 형 전압 게이트 된 칼슘 채널, ryanodine 및 이노시톨 포스페이트 신호 전달 경로 (29)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 유사한 메커니즘 ppk23 신경 세포의 반응에 중요한 역할을 여부를 확인하는 것이 중요 할 것입니다.
라이브 칼슘 이미징은 다른 집단 연구를위한 여러 가지 방법으로 구성 될 수있다
여러 기술 conside배급량 안정적인 화상을 얻는 것이 정확하게 생리적 반응의 시간 경과를 측정하는 것이 필수적이다. 플라이는 제제 간의 편차의 원인이 될 수있는 용액의 첨가에 격렬한 운동을 나타낸다 때문에 우선, 앞다리 안전하게 배치해야한다. 페로몬 용액 욕 애플리케이션 리간드가 노출 된 눈꺼풀 세그먼트 미각 sensilla 모두에 도달 할 수 있지만, 용액의 일부는 장착 제제의 다른 부분으로 흐를 수있다. 용액을 첨가하는 경우 또한, 앞다리 잠재적 표류 할 수있다. 둘째, 정확하게 이미지는 근처에 순간적인 형광의 증가, 일부 신경 세포가 자극을 4 초 이내에 신속하고 최대 응답을 표시하기 때문에 자극을 첨가 한 후 바로 촬영을 다시 시작하는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 연속적인 시계열 자극 용액 및 자극이 표시 될 수 투여되는 정확한 시점을 추가하기에 앞서 개시 될 수있다.
아가씨 = "jove_content은"> 거짓 긍정적 인 반응의 두 가지 소스가 관찰되었다. 우선, 용매 자체도 리간드의 부재 하에서 형광 반응을 유도 할 수있다. PBST 용매 일부 ppk23-GAL4 표지화 된 세포의 이러한 반응을 일으켰다. 또한, DMSO, 극성 및 무극성 분자 일반적으로 사용되는 용매는 일부 Gr68a-GAL4 표지 뉴런에서 반응을 유도. 또한, 용매 자체가 형광 신호를 유발 여부를 확인하기 위해 저 배경 활성을 갖는 용매 계를 선택하는 것이 필수적이다. 둘째, 비 신경지지 세포에서 강한 phasic 형 응답 단독 용매 PBST로 관찰되었다. Gr68a-GAL4 드라이버가 뉴런의 일반 일부를 둘러싸도록 표시 뉴런 모두 지원 세포에서 발현되며, amorphously 모양 크고, 가시 돌기 부족하다. 로아를 선택할 때 각 GAL4 라인에 대한 비 신경 세포의 반응에서 신경을 차별화하는 것이 중요하다.
_content는 ">이 방법의 하나의 중요한 한계는 동일한 플라이 제제인가 자극 제 완전히 커버 슬립의 표면으로부터 제거되지 않는 서로 다른 농도 또는 리간드의 유형을 테스트하는 연속적인 실험에 사용될 수 없다는 것이다. 또한,이 방법 인해 초파리 뉴런의 시각화에 필요한 고배율, 빠른 획득 및 높은 시간 해상도에 대한 요구로, 한 번에 여러 개의 파리의 높은 처리량의 촬상에 사용될 수 없다. 마지막으로,이 방법은 형질 전환 유전자 발현을위한 유전자 공구의 이용을 필요 따라서 주로 주요 모델 생물로 응용 프로그램을 제한.전부,이 방법은 전극을 사용하여 세포 녹음에 쉽게 대안입니다 전문 장비가 필요하지 않습니다. 또한, 이러한 CaLexA 다른 유전자 부호화 기자 달리, 동물을 다시 측정 할 생리적 반응을 허용 촬상 걸쳐 생존 유지모든 연령의 파리에서 높은 감도와 알 - 시간. 이 기능은 잠재적으로 리간드 또는 사회적 조건이나 생식 상태의 변화를 다음과 신경 반응의 비교에 연령에 따라 응답의 심사를 위해 허용 할 수 있습니다. 또한, 유지 기록 명백한 광표백 또는 GCaMP 신호의 협없이 최소 10 분 동안 수행 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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