Abstract
I motsetning til pattedyr, insekter slik som Drosophila har flere smaksorganer. De chemosensory nevroner på beina, snabel, vinger og ovipositor av Drosophila uttrykke smaksreseptorer 1,2, ionekanaler 3-6, og ionotrope reseptorer 7 som er involvert i deteksjon av flyktige og ikke-flyktige sanse signaler. Disse nervecellene direkte kontakt tastants som mat, skadelige stoffer og feromoner og derfor påvirke mange komplekse atferd som fôring, egg-legging og mating. Elektrode opptak og kalsium bildebehandling har vært mye brukt i insekter å kvantifisere nevrale responser fremkalt av disse tastants. Imidlertid krever elektro spesialisert utstyr og å innhente målinger fra en enkelt smak sensillum kan være teknisk utfordrende avhengig av celletype, størrelse og posisjon. I tillegg kan enkelt Nevron oppløsningen i Drosophila være vanskelig å oppnå siden smak sensilla house mer enn én type chemosensory nervecellen. Det levende kalsium avbildningsmetode som er beskrevet her kan reaksjoner fra enkeltsmaks nevroner i levende fluer som skal måles. Denne fremgangsmåte er særlig egnet for avbilding av neuronal respons på lipid feromoner og andre ligand-typer som har lav løselighet i vannbaserte løsningsmidler.
Introduction
Dyr er avhengige av olfactory og gustatory informasjon å formidle avgjørelser avgjørende for overlevelse og reproduksjon. Å forstå hvordan chemosensory signaler blir detektert og behandlet av nervesystemet krever identifikasjon av den sensoriske reseptor (er) og de tilsvarende kjemiske ligander. Drosophila detektere en forbløffende rekke av flyktige og ikke-flyktige forbindelser og er en utmerket modell for å studere de fysiologiske mekanismer underliggende chemosensation. Mens luktorganer oppfatter flyktige molekyler, blir smaksorganene spesialisert til å detektere lave volatilitet forbindelser. Her presenterer vi en metode for å direkte måle nerve svar fra smaksorganene Drosophila melanogaster til lav volatilitet lipofile ligander.
Gustatory organer i fly inkluderer forbena, snabel og vinger. Fordelt på overflaten av smaksorganene er hår-lignende strukturer kjent som sensilla som reagerer på sugars, bitter, salt, vann og feromoner 8. Den sensilla er klassifisert morfologisk inn smaks bust og smak plugger 9. Det er ca 31 smaks bustene på labellum som er klassifisert i den lange (l-type), kort (s-type) og middels (i-type) morfologi. "L" og "s" sensilla hus 4 sensoriske nevroner som reagerer fysiologisk til sukker (S celle), lav salt (L1 celle), høy salt og bitre forbindelser (L2 celle) og vann (W celle) 10 , 11. 'I' sensilla huset 2 sensoriske nevroner, hvorav den ene reagerer både lite salt og sukker, mens andre reagerer på høy salt 12. Det er ca 41 smak sensilla hos menn og 26 sensilla hos kvinner fordelt på hver av forbena. For både menn og kvinner, er det 21 sensilla på midleg, og ca 22 sensilla på bakben 13. De smaks nevroner omsluttet av smaken sensilla på beina er også classified inn L1, L2, W og S-typer.
En standard metode for måling av elektrisk aktivitet fra enkelt nevroner bruker ekstracellulære eller intracellulære elektroder til posten ion flyt. Elektrodemålinger tillate neuronal funksjon å bli studert i ikke-modellorganismer som Drosophila arter, møll, og bier som mangler omfattende genetiske verktøy for nevrale merking. Men mens elektrofysiologiske metoder har blitt rutinemessig brukt for å måle aktivitet fra Drosophila smak sensilla 4,13,14, bruke denne tilnærmingen presenterer flere tekniske utfordringer. Først smake bust må identifiseres basert på morfologi og romlig plassering. Ved identifikasjon, kan elektrofysiologiske målinger bli hindret av den lille størrelsen på sensilla, begrenset tilgjengelighet på grunn av stilling, og vanskeligheter med å anvende kontrollerte volumer av en kjemisk stimulans til en smak bust. Dessuten kan stimulering av sensilla generere signaler fra mer enn ettnevronale type 15. For det andre kan påvisning av elektriske signaler forvirres av bakgrunnsstøy som følge av mekaniske vibrasjoner og støy fra elektronisk utstyr. For det tredje, kan bruk av en skjerpet elektrode skade flue preparat, hvis det brukes feil 14. Til slutt, montering en elektrofysiologi rigg krever spesialiserte elektroniske komponenter for stimulans levering, signal opptak, og dataanalyse, og kan være kostbart.
I D. melanogaster, har tilgjengeligheten av genetisk kodede verktøy muliggjort utvikling av avbildningsteknikker som tillater responsene til små populasjoner av neuroner som skal studeres. En slik metode er bruken av rapportør CaLexA 16. I denne metoden, blir gensekvenser som koder for lexa-VP16 transkripsjonsfaktor og en kalsiumfølsom protein NFAT smeltet sammen. Kalsium aktivering av proteinfosfatasen kalsineurin katalyserer de-fosforylering av NFAT og, i sin tur, facilitaTES sin import til kjernen. Inne i kjernen, den lexa domene bindes til en LexAop-DNA-bindende motiv som dirigerer ekspresjonen av et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter, og dermed gir vedvarende identifikasjon av funksjonelt aktiverte neuroner. Tilnærmingen har vært brukt med hell til å måle responsen til spesifikke olfactory glomeruli i antennal lapp etter eksponering av levende fluer til en odorant 16. Nylig ble det fysiologiske responser av IR52c smaks reseptor nerveceller målt fra levende fluer ved hjelp CaLexA 7. Men for denne studien, var det nødvendig å alder fluer i opptil 6 uker, for å forbedre GFP transkripsjon. Mens immunofarging med et anti-GFP-antistoff kan anvendes for å øke CaLexA signal, vil denne fremgangsmåte kreve vev fiksering, og dermed utelukker muligheten for levende celle avbildning.
Den genetisk kodede kalsium indikatorprotein GCaMP har også blitt mye brukt til å studere neuronal respons på en rekkearter 17. Proteinet GCaMP fluoresces med lav intensitet før nervestimulering. Bruk av en stimulus utløser et aksjonspotensial i nervecellen, noe som resulterer i tilstrømningen av Ca 2+. GCaMP, bundet til Ca 2+, gjennomgår en konformasjonsendring, forårsaker den til å fluorescere med lysere intensitet (figur 1). En nylig utviklet single-nevron kalsium bildebehandling tilnærming ble brukt til å identifisere glukose som ligand for forben spesifikke Gr61a smaks nevroner 18. I denne studien ble dissekert forben fra transgene Drosophila uttrykker GCaMP i Gr61a smaks nevroner dekket med et lag av agarose før bildebehandling. Imidlertid kan bruken av dissekerte vev forårsake eventuelt trekk av GCaMP ekspresjon, noe som begrenser måletiden og deteksjonsfølsomheten. I tillegg agarose kan begrense følsomhet på grunn av høye bakgrunnsnivåer av fluorescens og dens lysspredningsegenskaper.
To ta opp noen av disse ulempene, beskriver vi bruk av GCaMP-mediert kalsium bildebehandling for å registrere fysiologiske responser fra forben og snabel smaks nevroner av intakte dyr. Vi viser de fysiologiske responsene til Gr68a og ppk23 neuroner som uttrykker genetisk kodet GCaMP5G 19 til en Drosophila lipid feromon, (3-R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoksy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronal responser måles ved å kvantifisere økningen i fluorescens over den GCaMP5G signal i løpet av feromon stimulering. I denne protokollen blir neuroner avbildes for en total varighet på 120 sekunder, som er tilstrekkelig til å skille mønstre av neuronal aktivering i individuelle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Kryss Gal4 3,22 driver linje til UAS-GCaMP5G 19 fluer (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). La korset for å vokse ved 25 ° C.
Merk: generere flyr med flere kopier av Gal4 eller UAS-GCaMP transgener kan bidra til å forbedre den fluorescerende signal intensitet. En tidligere versjon av UAS-GCaMP transgene (UAS-GCaMP3) viste meget svak fluorescens intensitet når den uttrykkes under kontroll av den Gr68a-Gal4 driver.- Samle og separat etter sex nylig eclosed voksne fluer og heve ved 25 ° C.
Merk: baseline nivå av GCaMP5G florescence er optimal i fluer i alderen mellom 14-28 dager. Isolere fluer etter kjønn utelukker muligheten for sosiale interaksjoner som kan påvirke de nevrale responser.
- Samle og separat etter sex nylig eclosed voksne fluer og heve ved 25 ° C.
- Anesthetize en flue under en mild strøm av CO 2.
- Fest fly til et glass dekkglass ved først å plassere en liten dråpe av neglelakk i sentrum av en 0,17 mm dekkglass. Stikk forsiktig en flue på sin side på slipp av klar neglelakk og sikre at hele fallet er dekket av fly.
- Utfør trinn 1,5 og 1,6 under en dissekere stereo, brukt på 8X forstørrelse.
- Bruk en våt pensel til å forlenge en forben av flua. Fest forben i posisjon ved å plassere to tynne strimler av tape over første og femte tarsal segmenter (Figur 2A). Dette vil utsette tarsal segmenter T2-T4 for imaging (figur 2B).
- Til bilde nevroner på snabel, plassere en tynn stripe av tape over talerstolen for snabel å avsløre labellum (figur 2C, D).
- Tegn en hydrofob barriere rundt fly med en PAP penn for å hindre løsning fra strømmer over dekkoverflaten. Gjør målinger innen 30 minutter av montering.
2. Utarbeidelse av StimulusLøsning
- Fortynn lipofile ligander (for eksempel CH503, anvendt i denne studien) i en PBST løsning: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
- Gjør en 1 mg / ml stamløsning av liganden ved hjelp av PBST. Forbered alle etterfølgende fortynninger av stamløsningen ved hjelp PBST.
Merk: Avhengig av løseligheten av liganden av interesse, kan forskjellige løsningsmidler være nødvendig for å oppløse liganden. Løseligheten av CH503 i forskjellige løsningsmidler, er beskrevet i tabell 1. I motsetning til andre oppløsningsmidler, har PBST ikke produsere en økning i fluorescens.
- Gjør en 1 mg / ml stamløsning av liganden ved hjelp av PBST. Forbered alle etterfølgende fortynninger av stamløsningen ved hjelp PBST.
3. Stimulering av Gustatory nevroner og Image Acquisition
- Ved hjelp av en 10 mL pipette, legger 10 mL av PBST på tarsal segmenter.
Merk: Dette trinnet fukter ben og hindrer tarsal segmenter fra drivende. - Bruk en optisk system som har et kamera av sufficient hastighet og sensitivitet for å oppnå god fluorescens signal med høy tidsoppløsning.
Merk: For denne studien brukte vi en roterende disk confocal mikroskop og en sCMOS kameraet (se Materials List). - Velg den spesifikke tarsal segmentet og nevroner som skal avbildes. Acquire tre pre-stimulering confocal Z-stabler.
- Ideelt bruk oppkjøps innstillinger som er raske nok til å tillate maksimal tidsoppløsning samtidig fange hele cellen volum. Innstillinger eksempel oppkjøp er: 200 ms eksponering, binning 2 x 2 og 6 x 0,5 mikrometer 2 optiske seksjoner, fanget hver 2 sek.
Merk: Immobiliserte bena har blitt avbildet med hell i opp til 10 minutter, ved 30 sek intervaller, med ingen merkbar bleking av GCaMP signal. For lengre opptakstid, sørge for at bena holdes meget godt på plass på dekkglass. - Optimallasereffekt som sørger for et signal-til-støy kan oppnås med minimal fotobleking i løpet av hele imaging regime. For forsøkene beskrevet her, kan du bruke en 491 nm diodelaser (100 mW) på 30% overføring for bildebehandling både Gr68a og ppk23 smaks nevroner på beina og snabel. Bruk 2 x 2 binning for å tillate kortere eksponeringstider samtidig oppnå tilstrekkelig romlig oppløsning.
Merk: strøminnstillinger laser ble optimalisert for å tillate påvisning av fluorescerende endring som strekker seg fra et 1.2- til 4.5-dobling.
- Ideelt bruk oppkjøps innstillinger som er raske nok til å tillate maksimal tidsoppløsning samtidig fange hele cellen volum. Innstillinger eksempel oppkjøp er: 200 ms eksponering, binning 2 x 2 og 6 x 0,5 mikrometer 2 optiske seksjoner, fanget hver 2 sek.
- Pipetter 10 mL av stimulus løsning på tarsal segmenter. For kontrollforsøk, legge til en annen 10 mL av PBST. Umiddelbart erverve 117 post-stimulering bilder.
Merk: Antallet post-stimulering bilder ervervet er basert på hvor mye tid der maksimal endring i fluorescens ble nådd (ca. 2 min).- KRITISK STEP: Mens pipettering løsning på forberedelse, ikke å ta på direkten med pipettespissen siden dette vil føre til at forben å flytte ut av posisjon.
Merk: Du kan også brukeen mikromanipulator for nøyaktig å posisjonere en glasskapillar inneholdende stimulus nær tarsal segment som skal avbildes. Lever kontrollerte mengder stimuli ved hjelp av en intracellulær mikroinjeksjon dispenser i henhold til produsentens instruksjoner.
- KRITISK STEP: Mens pipettering løsning på forberedelse, ikke å ta på direkten med pipettespissen siden dette vil føre til at forben å flytte ut av posisjon.
4. Bildebehandling og analyse: Kvantifisering av Respons
- Åpne en serie av confocal Z-stabler ved hjelp av Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 eller ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 bildeanalyse og prosessering programvare.
- Lag en sum intensitet projeksjon av alle seks Z skiver for hver av de 120 tidspunkter.
- Velg "Stack" under "Image". Videre velger du "Z projeksjon" og skriv "1" som start skive og "4" som stoppskive. For projeksjon type, velger R20, sum skiver "fra rullegardinmenyen, og velg" Alle tidsrammer ".
- Definer regionen av interesse (ROI) ved hjelp av verktøyet for frihåndsutvalg for å trekke en grense rundt en celle kropp eller nevronale projeksjon. Klikk på "Analyze" etiketten og velg "ROI leder" under "Verktøy".
- Kvantifisere fluorescens av ROI ved å velge "Set målinger" alternativet under "Analyze" -menyen og merke av i boksene for integrert tetthet, område, mener og maksimal grå verdi og etikett. Deretter velger du "Mer" under ROI Behandling-menyen, og videre velger "Multi tiltaket" alternativet.
Merk: Dette vil generere en popup boks med verdier for hver av de utvalgte parametre. - Sjekk de maksimale gråtoneverdiene for å sikre at ingen av de bildeelementer har nådd metning (f.eks, 65 535 for en 16-bit-kamera).
MERK: For forsøkene vist på thans papir, responser ble målt enten fra celle organer eller nevrale projeksjoner, avhengig av hvor den maksimale økningen i AF / F ble observert. - Beregn den maksimale relative endringen i fluorescens (AF / F) ved tidspunkt t er som følger:
- Trekk bakgrunn fluorescens fra hver F (celle) verdi. For å kvantifisere bakgrunnsfluorescens, måle den integrerte tettheten av en avkastning av tilsvarende størrelse og form fra et område av forben (eller snabel) blottet for detekterbare neuroner.
- For å kvantifisere post-stimulering fluorescens, F (celle) t, måle den integrerte tetthet av avkastningen av cellekroppen eller prosessen på tidspunkt "t" etter stimulering.
- For å kvantifisere den pre-stimulering fluorescens, F (celle) t = 0, analysere pre-stimulus bilder av cellekroppen eller prosess på samme måte sompost-stimulering signal. Bruk midlere integrerte tetthet på 3 bilder for å bestemme F (celle) t = 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den GCaMP kalsium indikatoren ble genetisk uttrykkes ved hjelp ppk23-GAL4 drivere Gr68a-Gal4 eller. Distinkte populasjoner av forbenet nevroner og ikke-nevrale støtte celler er merket med hver driver (figur 3A-C). Ligand-spesifikke svar på lipofile feromon CH503 ble observert i Gr68a-Gal4 og ppk23-GAL4 celler uttrykker GCaMP (figur 3D). Den relative endringen i fluorescens intensiteten av GCaMP5G signal (AF / F) og økte med høyere konsentrasjoner av CH503 (figur 3E). Interessant nok, kan den 5 ng dose av CH503 undertrykke neural respons.
Gr68a og ppk23 nevroner utstilt forskjellige reaksjonsmønster. Gr68a nevroner viste en tonic mønster av nerveaktivitet (figur 3F), mens ppk23 nevroner viste en phasic, oscillerende respons (figur 3G). Svarene fra ppk23 nevroner i snabel var enLSO målt ved bruk av dette preparatet, og viste en kombinasjon av fasisk og oscillerende responser (Figur 3H).
Fig. 1: Grunnleggende prinsipp GCaMP kalsium avbildningsteknikk GCaMP5G er genetisk uttrykt i Gal4 -merket celler og fluorescerer med lav intensitet før neuronal stimulering. Bruk av en stimulus utløser et aksjonspotensial i nervecellen og fører Ca 2+ tilstrømningen. GCaMP5G, når det er bundet til Ca 2+, gjennomgår en konformasjonsendring, noe som resulterer i øket fluorescens (AF), som endrer seg over tid. Grunnlinjen fluorescens (F) viser til fluorescerende signal intensitet før stimulering.
Figur 2: Montering av et levende flue for avbildning av forben eller snabel nevroner.(A) Montere forben: en 3.2x bilde av et levende mannlig fly, viser forbena festet til dekkglass med tape. (B) En 40X bilde av fly, som viser hver av de tarsal segmenter (T1-5), og plassering av båndet over den første tarsal segmentet og på den femte tarsal segmenter. (C) Montering snabel: et stykke tape er plassert over talerstolen for å eksponere tuppen av snabel. (D) pipette for stimulans tillegg holdes litt over fly og ikke ta direkte kontakt med preparatet.
Figur 3:. Pheromone-indusert nevrale responser i GCaMP-uttrykker nevroner (A) Skjematisk av den mannlige forben av Drosophila viser romlige posisjoner Gr68a-Gal4 merket celler på tarsal segmenter T2-4. Non-nevrale celler (identifisert basert på størrelse og form) er colored gul. (B) Raw fluorescerende bilde av den mannlige forben viser nevrale og støtte celler merket med Gr68a-Gal4 driver. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Skjematisk av den mannlige forben av Drosophila viser romlige posisjoner ppk23-Gal4 merket celler på tarsal segmenter T2-4. (D) Response av Gr68a- og ppk23-uttrykker T4 nevroner til CH503 (kjemisk struktur vist ovenfor). Den gjennomsnittlige AF / F som respons på CH503 ble sammenlignet med den gjennomsnittlige AF / F etter påføring av PBST oppløsningsmiddel alene; T-test med ulik varians (for Gr68a) eller Mann-Whitney test (for ppk23): * p <0.05, *** p <0,001. Feilfelt skildre sem Statistiske strøm = 0,93. (E) En doseavhengig endring i Δ F / F observert i Gr68a nevroner i T4. T-test med ulik varians: ** p <0.01, *** p <0,001. Statistiske strøm = 0,86 til 0,96. (F (G) En fargekodet tidsforløp viser en oscillasjon, phasic respons i GCaMP fluorescens følgende CH503 stimulering (500 ng) av ppk23-uttrykke nevroner. Posisjonene av neuronene på forben er vist i den rå fluoriserende bilde (til venstre). Skala: 10 mikrometer; tidsskala: 0-96 sek. Den medfølgende linjediagram viser en sprengning svar fra en ppk23 nervecelle til stimulering av 500 ng av CH503. Rød pil indikerer det tidspunkt ved hvilket den stimulus ble tilsatt. Toppen RespoNSE skjer på 76 sek. (H) En fargekodet tidsforløpet av ppk23-uttrykke nevroner på snabel viser en sen-utbruddet tonic respons fra cellekroppen og en oscillerende svar fra en aksonal projeksjon følgende CH503 stimulering (500 ng). Posisjonene til de celler som er vist i den rå fluoriserende bilde (til venstre). Scale bar = 10 mikrometer; tidsskala: 0-96 sek. Gjengitt med tillatelse fra Shankar, S., et al. Den neuropeptide tachykinin er avgjørende for feromon deteksjon i en smaks neural krets. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Solvent 1,2 | Løseligheten av CH 5 0 3 3 | Har væsken alene trigger neuronal aktivitet? 4 |
| 0,1% PBST | JA | NEI |
| 100% etanol | JA | JA |
| 100% heksan | JA | JA |
| 10% etanol | NEI | (Ikke testet) |
| 10% heksan | NEI | (Ikke testet) |
| 100% DMSO | JA | JA |
| 10% DMSO | JA | JA |
| 0,4% DMSO | JA | JA |
| 0,2% DMSO | JA | JA |
Tabell. 1: Løselighet av CH 5 0 3 i forskjellige løsningsmidler 1 DMSO:. Dimetylsulfoksid 2 etanol, heksan, og DMSO-løsningene ble igjen fortynnet med dH 2 O (v / v) 3 Løselighet av CH503 i 0,2% DMSO var begrenset. bare til 250 ng / ml. 4 Økning i AF / F med løsningsmiddel alene, var ekvivalent med den som dialektikkendret ved stimulering med feromon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en metode for å opptre live kalsium avbildning av Drosophila perifere nerveceller i 2 forskjellige sanseorganer. Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende responser i Gr68a-nerveceller indusert ved hjelp av feromonet liganden CH503 var doseavhengig og kvantitative. Det var også mulig å skjelne ulike nevrale reaksjonsmønstrene som phasic og tonic svar.
Nerveceller viser phasic svar antas å tillate rask tilpasning til kontinuerlig stimuli. Denne type reaksjon er blitt assosiert med lukt deteksjon 25 og generering av rytmiske motoriske aktivitet mønstre 26. I kontrast, nevrale svingninger, som har blitt beskrevet i mange sansesystemer, antas å synkronisere flere innganger på en enkelt postsynaptiske nettstedet og for å formidle spesifikke funksjoner om stimulus 27. Den molekylære basis for svingninger i forbindelse med ppk23 neuroner har enda ikke blitt rapportert, til vår knowledge. I andre typer av eksiterbare celler som viser svingnings responser, har frekvensen til oscillasjonene vist seg å være regulert av en prosess kalt kalsium-indusert kalsium-frigjøring 28. I denne fremgangsmåten blir kalsium frigjøres fra indre lagre under kontroll av den sekundære budbringer inositol-trifosfat, og frekvensen for dens frigjøring er avhengig av styrken av den ytre stimulus. Innsikt i det molekylære grunnlaget for tonic nevrale responser har fått fra studier av oksygenfølereseptorer i C. elegans 29. En langvarig økning i kalsiumnivået i nerveceller ble funnet å være formidlet av L-type kalsiumkanaler spennings gated, ryanodine og inositol-trifosfat signalveier 29. Det vil være viktig å avklare om liknende mekanismer spiller en rolle i svarene fra ppk23 nerveceller.
Levende kalsium bildebehandling kan tilpasses på flere måter for studier av andre populasjoner av
Flere tekniske considerasjoner er viktig å få stabile bilder og å måle tiden løpet av fysiologiske reaksjoner. For det første må forben bli støtt siden flue oppviser kraftig bevegelse ved tilsetning av oppløsningen, som kan være en kilde til variasjon mellom preparater. Selv bad anvendelse av feromon løsningen gjør liganden å nå alle de smaks sensilla på utsatte tarsal segmenter, kan noen av løsningen strømme mot andre deler av montert forberedelse. Dessuten kan den forben potensielt drive bort når oppløsningen tilsettes. For det andre, for å nøyaktig bilde nesten momentan økning i fluorescens, er det viktig å gjenoppta avbildning umiddelbart etter tilsetning av stimulus siden noen nevroner viser en rask og maksimal respons innen 4 sekunder etter stimulering. Alternativt kan en kontinuerlig tidsserie settes i gang før tilsetning av stimulus-løsning, og det nøyaktige tidspunkt ved hvilket stimulus blir administrert kan merkes.
lass = "jove_content"> To kilder til falske positive svar ble observert. For det første kan oppløsningsmidlet selv indusere fluorescerende responser selv i fravær av en ligand. Den PBST oppløsningsmiddel forårsaket en slik reaksjon i noen ppk23-Gal4 merkede celler. I tillegg, DMSO, et vanlig anvendt løsningsmiddel for polare og upolare molekyler, også indusert en reaksjon i noen Gr68a-Gal4 merkede nevroner. Det er derfor viktig å bestemme hvorvidt oppløsningsmiddelet i seg selv induserer en fluoriserende signal og for å velge et oppløsningsmiddelsystem med lav bakgrunnsaktivitet. For det andre, ble en sterk fasisk-type respons i ikke-nevrale celler observert støtte til løsningsmidlet PBST alene. Den Gr68a-Gal4 driver er uttrykt i både nevroner og støtte celler som synes å omslutte noen av nevroner og generelt er større, amorft formet, og mangler synlige anslag. Det er derfor viktig å skille nevrale fra ikke-nevronale responser for hvert Gal4 linje ved valg ROIs.
_content "> En viktig begrensning ved denne metode er at den samme fly fremstillingen ikke kan brukes for etterfølgende eksperimenter for å teste forskjellige konsentrasjoner eller typer av ligander, med mindre det påførte stimulus blir først grundig fjernet fra overflaten av dekkglass. I tillegg er denne fremgangsmåte kan ikke brukes for høy gjennomstrømning avbildning av flere fluer på en gang, på grunn av høy forstørrelse som er nødvendig for visualisering av Drosophila neuroner, og behovet for hurtig anskaffelse og høy tidsoppløsning. til slutt krever denne metoden tilgjengeligheten av genetiske verktøy for transgen genekspresjon , og dermed begrense søknad i første rekke til større modellorganismer.Alt i alt er denne fremgangsmåte et enklere alternativ til cellulære opptak med elektroder og som ikke krever spesialisert instrumentering. I tillegg, i motsetning til andre genetisk kodede reportere som CaLexA, blir dyret holdt i live i hele avbildnings slik at fysiologiske responser som skal måles i real-tid med høy følsomhet i fluer i alle aldre. Denne funksjonen kan potensielt tillate screening av aldersavhengig respons på ligander eller sammenligning av nevrale responser følgende endringer i sosiale forhold eller reproduktiv tilstand. Videre kan opprettholdes opptakene gjøres i minst 10 minutter uten åpenbar fotobleking eller oversikt over GCaMP signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
