Abstract
Memeliler aksine, örneğin Drosophila olarak böcekler birden tat organları vardır. Bacaklar, burnumun, kanat ve Drosophila ovipositor üzerine nöronların tat reseptörleri 1,2, iyon kanalları 3-6 ve uçucu ve uçucu olmayan duyusal ipuçlarının saptanmasında katılan iyonotropik reseptörler 7 ifade eder. Bu nöronlar doğrudan gıda, zararlı maddeler ve feromonlar gibi tat yoğunluğu arttırıcı başvurun ve bu nedenle bu tür beslenme, yumurtlama ve çiftleşme gibi birçok karmaşık davranışlar etkilemektedir. Elektrot kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yaygın olarak bu tat yoğunluğu arttırıcı tarafından uyarılmış nöronal yanıtları ölçmek için böcekler kullanılmaktadır. Ancak, elektrofizyoloji hücre tipi, boyutu ve konumuna bağlı olarak teknik olarak zor olabilir, tek bir tat Sensillum gelen özel ekipman ve elde ölçümleri gerektirir. Buna ek olarak, Drosophila tek nöron çözünürlüğü tat Sensilla hou beri elde etmek zor olabilirkimyasal duyu nöron se birden fazla türü. Burada anlatılan canlı kalsiyum görüntüleme yöntemi canlı sinekler tek tat nöronların yanıtları ölçülecek sağlar. Bu yöntem, su bazlı çözücüler içinde düşük çözünürlüğe sahip, lipid feromonlar ve diğer ligand türlerine nöronal yanıtları görüntüleme için özellikle uygundur.
Introduction
Hayvanlar hayatta kalma ve üreme için gerekli kararları arabuluculuk koku ve tat bilgilere güveniyor. Algılanabilir ve sinir sistemi tarafından nasıl işlendiğini kimyasal duyu ipuçları anlama duyu reseptör (ler) ve karşılık gelen kimyasal ligand tanımlanmasını gerektirir., Drosophila uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin şaşırtıcı bir dizi tespit etmek ve fizyolojik olarak incelenmesi için mükemmel bir modeldir mekanizmalar chemosensation altında yatan. koku organları uçucu moleküller algıladıkları iken, tat organları düşük volatilite bileşikleri tespit etmek için uzman bulunmaktadır. Burada, doğrudan düşük volatilite, lipofilik ligandlara Drosophila melanogaster tat organlarından nöronal tepkilerini ölçmek için bir yöntem mevcut.
sinek tat organları kol, burnumun ve kanatları dahil. s yanıt Sensilla olarak bilinen saç benzeri yapılar tat organları yüzeyi üzerinde dağıtılırugars, bitters, tuzlar, su ve feromonlar 8. Sensilla tat kıllar içine morfolojik tasnif edilmiş ve tat 9 mandal. uzun (L-tip) sınıflandırılır labellum yaklaşık 31 tat kılların kısa (S-tipi) ve ara madde (I-tipi) morfolojileri vardır. Şeker fizyolojik yanıt 'L' ve 'S' Sensilla evi 4 duyu nöronları (S hücresi), düşük tuzlu (L1 hücresi), tuz ve acı bileşikleri (L2 hücre) ve su (W hücresi) 10 11. Diğer cevaplarından ise yüksek tuz 12 düşük tuz ve şeker hem tepki biri 'i Sensilla evi 2 duyusal nöronlar,. erkeklerde yaklaşık 41 tat Sensilla ve Ön ayakların her dağıtılmış kadınlarda 26 Sensilla vardır. Her iki erkek ve kadınlarda, midleg 21 Sensilla ve hindleg 13 yaklaşık 22 Sensilla vardır. ayakları üzerinde tat Sensilla çevrili tat nöronlar da c vardırL1, L2, W ve S tipe lassified.
tek nöronların elektrik aktivitesini ölçmek için bir standart yöntem iyon akışını kaydetmek için hücre dışı ya da hücre içi elektrotlar kullanır. Elektrot ölçümleri nöronal fonksiyonu, Drosophila türüne, kelebekler ve nöral etiketleme için geniş genetik araçları yoksun arılar gibi non-model organizmaların incelenmesi gereken sağlar. Elektrofizyolojik yöntemler rutin bu yaklaşımı uygulayarak, 4,13,14 Sensilla Drosophila tadı aktivitesini ölçmek için kullanılır olmuştur Bununla birlikte, birçok teknik zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kıllar morfolojisi ve uzamsal yere göre tespit edilmesi gerekir tadı. kimlik üzerine, elektrofizyolojik ölçümler, Sensilla küçük boyutu ile engellenmiş olabilir pozisyona bağlı erişilebilirlik sınırlıdır ve bir tat kimyasal uyarıcı kontrollü hacimleri uygulayarak zorluk kıl. Ayrıca, Sensilla uyarılması birden fazla sinyal oluşturabilirnöronal tip 15. İkinci olarak, elektrik sinyallerinin tespiti elektronik cihazların mekanik titreşim ve gürültü kaynaklanan arka plan gürültüsünü tarafından eleştirilmiştir olabilir. Yanlış 14 kullanıldığı takdirde Üçüncü olarak, bir bilenmiş elektrodun kullanılması, sinek hazırlık zarar verebilir. Son olarak, bir elektrofizyoloji teçhizat montaj uyaran teslim sinyal kayıt ve veri analizi için özel elektronik bileşenleri gerektirir ve masraflı olabilir.
D. melanogaster, genetik olarak kodlanmış araçların kullanılabilirliği nöronların küçük popülasyonlarının yanıtları okudu izin görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu tür bir yaklaşım CaLexA raportör 16 kullanımıdır. Bu yöntemde, LexA-VP16 transkripsiyon faktörü ve kalsiyuma duyarlı bir protein NFAT kodlayan gen dizileri birbirine birleştirilir. protein fosfataz calcineurin'in kalsiyum aktivasyon dönüş, facilita içinde, NFAT de-fosforilasyon katalize veçekirdeğin içine ithal TES. çekirdeğin içinde, LexA alan, böylece, işlevsel aktif nöronların sürekli teşhisine izin veren, yeşil flüoresan proteini (GFP) raportörün ifadesini yöneten bir LexAOp-DNA bağlanma motifi ile bağlanır. Yaklaşım odorant 16 canlı sinek maruz kaldıktan sonra antennal lobda özel koku glomerulusların tepkisini ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, IR52c tat reseptör nöronların fizyolojik yanıtlar CaLexA 7 kullanılarak canlı sinekler ölçüldü. 6 haftaya kadar GFP transkripsiyonu geliştirmek için Ancak, bu çalışma için, bu yaş sinekler gerekliydi. Bir anti-GFP antikoruyla immün CaLexA sinyali artırmak için kullanılabilir, ancak bu durumda, yöntem, canlı hücre görüntüleme olasılığını engelleyen, doku fiksasyon gerektirir.
genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi proteini GCaMP da kapsamlı bir dizi nöronal yanıtları incelemek için kullanılmıştırtürler 17. Protein GCaMP nöronal uyarım önce düşük yoğunluklu fluoresces. Uyarıcı uygulanması Ca2 + akışı ile sonuçlanır nöron bir eylem potansiyeli tetikler. Ca + 2 bağlı GCaMP, bu daha parlak yoğunluk (Şekil 1) ile floresan neden konformasyonel değişime uğrar. Son yıllarda geliştirilmiş olan tek nöron kalsiyum görüntüleme yaklaşımı ön ayağı belirli bir Gr61a tat nöronlar 18 için ligand olarak glükoz tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada, Gr61a tat nöronlarda GCaMP eksprese Drosophila kesilerek ön bacakları görüntüleme önce agaroz tabakası ile kaplanmıştır. Bununla birlikte, kesilerek doku kullanımı, böylece ölçüm süresi ve saptama hassasiyetini sınırlayıcı GCaMP ifade nihai özet neden olabilir. Buna ek olarak, agaroz, yüksek floresan arka plan seviyeleri ve ışık saçma özelliklerine duyarlılık sınırlayabilir.
To Bu sakıncalardan bazılarının ele, biz ön ayağın ve burnumun bozulmamış hayvanların tat nöronlar gelen fizyolojik yanıtları kaydetmek için GCaMP aracılı kalsiyum görüntüleme kullanımını tarif eder. Biz, bir Drosophila lipit feromon genetik olarak kodlanmış GCaMP5G 19 ifade eden fizyolojik Gr68a cevaplan ve ppk23 nöronlar, (3R, 11 Z, 19 Z) -3-asetoksi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503), 20 göstermektedir 21. Nöronal tepkiler feromon uyarımı esnasında GCaMP5G sinyalinin floresanstaki artışı miktarının ile ölçülür. Bu protokolde, nöronlar bireysel hücrelerin nöronal aktivasyon kalıplarını ayırt etmek yeterlidir 120 sn, toplam süresi görüntülenmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- (P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118 w) UAS-GCaMP5G 19 sinekler Gal4 3,22 sürücü çizgiyi. Çapraz 25 ° C'de büyümeye olanak sağlar.
Not: Yaratma floresan sinyal yoğunluğu arttırmak için yardımcı olabilir Gal4 veya UAS-GCaMP transgenlerin birden fazla kopya ile uçar. Gr68a-Gal4 sürücünün kontrolü altında eksprese edildiği zaman, UAS GCaMP transgeni (UAS GCaMP3) daha önceki bir versiyonu çok zayıf floresan yoğunluk gösterdi.- Toplayın ve seks yeni eclosed yetişkin sinekler tarafından ayrı ve 25 ° C'de yükseltmek.
Not: GCaMP5G çiçeklenme bazal seviyesi 14-28 gün arasında değişen sinekler uygunudur. Cinsiyete göre sinekler Yalıtımlı nöral yanıtları etkileyebilir sosyal etkileşimler olasılığını engeller.
- Toplayın ve seks yeni eclosed yetişkin sinekler tarafından ayrı ve 25 ° C'de yükseltmek.
- CO 2 hafif bir akımı altında bir sinek uyutmak.
- f takınly ilk 0,17 mm lamel merkezinde oje küçük bir damla koyarak bir cam lamel. Yavaşça net oje damla üzerinde yan bir sinek yerleştirin ve tüm damla anında kapsamında olduğundan emin olun.
- 8X büyütme kullanılan bir diseksiyon stereomikroskop altında adımları 1.5 ve 1.6 gerçekleştirin.
- sineğin bir ön bacağını uzatmak için ıslak bir fırça kullanın. Birinci ve beşinci tarsal kesimleri (Şekil 2A) üzerinden bant iki ince şeritler yerleştirerek pozisyonda ön bacağını elde edin. Bu görüntüleme (Şekil 2B) için tarsal segmanları T2 T4 gösterecektir.
- Burnumun görüntü nöronlar, labellum (Şekil 2C, D) maruz burnumun kürsüden üzerinde bant ince bir şerit yerleştirin.
- lamel yüzeyi üzerinde akan çözelti önlemek için bir PAP kalem ile anında yaklaşık bir hidrofobik bariyer çizin. Montaj 30 dakika içinde ölçüm yapmak.
Stimulus 2. HazırlıkÇözüm
- Lipofilik ligandlan seyreltik PBST solüsyonu (örneğin, bu çalışmada kullanılan CH503 gibi): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4,% 0.1 Triton X-100 (v / v ); pH 7.4.
- PBST kullanarak ligand 1 mg / ml stok çözelti yapmak. PBST kullanarak stok çözeltisi Müteakip tüm seyreltiler hazırlanır.
Not: ilgi ligandın çözünürlüğüne bağlı olarak, farklı çözücüler ligandın çözülmesi için gerekli olabilir. Çeşitli çözücüler içinde CH503 çözünürlüğü Tablo 1'de tarif edilmektedir. Diğer çözücüler farklı olarak, PBST floresansta bir artış sağlamamıştır.
- PBST kullanarak ligand 1 mg / ml stok çözelti yapmak. PBST kullanarak stok çözeltisi Müteakip tüm seyreltiler hazırlanır.
Tat Nöronlar ve Image Acquisition 3. stimülasyonu
- 10 ul pipet kullanarak tarsal kesimleri üzerine PBST 10 ul yerleştirin.
Not: Bu adım bacak nemlendirir ve sürüklenen gelen tarsal segmentleri engeller. - su bir kameraya sahip bir optik sistemini kullanınfficient hız ve hassasiyet yüksek zaman çözünürlüğü iyi floresan sinyal elde etmek.
Not: Bu çalışma için biz dönen bir disk konfokal mikroskop ve bir sCMOS kamera (Malzeme listesi bakınız). - Belirli tarsal segment ve nöronlar seçin yansıması. üç ön stimülasyon konfokal Z-yığınlarının edinin.
- İdeal olarak, kullanım edinme ayarları hala tüm hücre hacmi çekerken maksimum süre çözünürlüğü izin verecek kadar hızlı. Örnek edinme ayarları şunlardır: her 2 saniyede yakalanan x 2 2 ve 6 x 0,5 mikron 2 optik bölümleri, binning 200 msn pozlama.
Not: İmmobilize bacak GCaMP sinyalinin hiç bir farkedilebilir ağartılması ile, 30 saniye aralıklarla, en fazla 10 dakika için başarılı bir şekilde görüntülenmiştir edilmiştir. uzun kayıt süreleri için, bacaklar lamel yerinde çok sıkı tutulur emin olun. - en yüksek sinyal-gürültü bütün ima boyunca en az photobleaching ile elde için lazer gücünü optimizerejimi ging. Burada tarif edilen deneyler için, görüntüleme için% 30 iletim de bacaklar ve burnumun üzerinde Gr68a ve ppk23 tat nöronlar hem 491 nm diyot lazer (100 mW) kullanın. hala yeterli uzaysal çözünürlüğü elde ederken kısa pozlama süreleri için izin vermek için 2 x 2 binning kullanın.
Not: lazer gücü ayarlar 1.2- 4.5 katlık bir artışa kadar fluoresan değişim saptanmasına olanak tanınması için optimize edilmiştir.
- İdeal olarak, kullanım edinme ayarları hala tüm hücre hacmi çekerken maksimum süre çözünürlüğü izin verecek kadar hızlı. Örnek edinme ayarları şunlardır: her 2 saniyede yakalanan x 2 2 ve 6 x 0,5 mikron 2 optik bölümleri, binning 200 msn pozlama.
- Pipet tarsal kesimleri üzerine uyarıcı çözeltisinin 10 ul. Kontrol deneyleri için PBST bir 10 ul ekle. Hemen 117 sonrası uyarım görüntüler elde.
Not: edinilen sonrası stimülasyon görüntülerin sayısı floresan maksimal değişiklik ulaşıldı edildiği süreyi (yaklaşık 2 dakika) dayanmaktadır.- KRİTİK ADIM: Bu ön ayağı konumunun dışına hareket etmesine sebep olacağından hazırlama çözüm pipetleme iken, pipet ile sinek dokunmak yok.
Not: Alternatif olarak, kullanımıdoğru tarsal segment uyaran yakın içeren bir cam kılcal konumlandırmak için bir mikromanipülatör yansıması. üreticinin talimatlarına göre bir hücre içi mikroenjeksiyon dağıtıcı kullanarak uyaran kontrol birimleri verin.
- KRİTİK ADIM: Bu ön ayağı konumunun dışına hareket etmesine sebep olacağından hazırlama çözüm pipetleme iken, pipet ile sinek dokunmak yok.
4. Görüntü İşleme ve Analiz: Tepki sayısallaştırılması
- Fiji (kullanarak konfokal Z-yığınlarının bir dizi aç http://fiji.sc/Fiji ) 23 veya ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 görüntü analizi ve işleme yazılımı.
- 120 kez noktalarının her biri için altı Z dilim toplamı yoğunluklu projeksiyonu yapın.
- "Image" altında "Yığın" seçeneğini seçin. Ayrıca, "Z projeksiyon" seçeneğini seçin ve durdurma dilim olarak başlangıç dilim ve "4" olarak "1" girin. projeksiyon tipi için, R seçin20; toplamı dilimleri Tüm zaman dilimlerini "açılır menüden, ve seçim" ".
- bir hücrenin vücuda ya da nöronal projeksiyon etrafında bir sınır çizmek için serbest seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgesini tanımlar. "Analiz" etiketi tıklayın ve "Araçlar" altında "ROI yöneticisi" seçeneğini seçin.
- , "Analiz" menüsü altında, "Set ölçümler" seçeneğini seçerek ve entegre yoğunluğu, alan için kutuları işaretleyerek ROI floresan ölçmek ortalama ve maksimum gri değer ve etiket. Ardından, YG yöneticisi menüsü altında "Diğer" seçeneğini seçin ve daha sonra "Çok önlem" seçeneğini seçin.
Not: Bu, seçilen parametrelerin her biri için değerleri ile bir pop-up kutusu oluşturur. - Piksel hiçbirinin doygunluğa ulaşmıştır sağlamak için maksimum gri değerleri kontrol (örneğin, 16-bit kamera 65.535).
Not: deneylerde, T gösterilenonun kağıt, yanıtlar kadar taşınmış / F maksimal artış gözlendi yere bağlı olarak hücre gövdeleri veya nöronal projeksiyonları, gelen ya ölçüldü. - Aşağıdaki gibi bir zaman noktasında t floresan (mesafe kadar taşınmış / F) maksimum bağıl değişim hesaplamak:
- Her bir F (hücre) değerinden Çıkar eşiğe. Arka plan floresan ölçmek için, tespit edilebilir nöronların yoksun ön ayağın (ya da hortum) bir alandan eşdeğer boyut ve şekilde bir ROI entegre yoğunluğunu ölçer.
- Post-stimülasyon floresan, F (hücre) t ölçmek için uyarılmasından sonra zaman noktası "t" hücre gövdesinin veya sürecin ROI entegre yoğunluğunu ölçmek.
- Ön stimülasyon floresan ölçmek için, F (hücre) t = 0, aynı şekilde olarak hücre gövdesi veya sürecin öncesi uyaran görüntüleri analizPost-stimülasyon sinyali. F (hücre) t = 0 belirlemek için 3 görüntülerin ortalama entegre yoğunluğunu kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GCaMP kalsiyum göstergesi genetik Gr68a-Gal4 veya ppk23-Gal4 sürücüleri kullanarak ifade edildi. Kol nöronlar ve nöral olmayan destek hücrelerinin ayrı nüfus her sürücü (Şekil 3A-C) tarafından sınıflandırılmıştır. Lipofilik feromon CH503 ligand spesifik yanıtlar Gr68a-Gal4 gözlendi ve ppk23-Gal4 hücreleri GCaMP (Şekil 3D) ifade. Görece GCaMP5G sinyali (kadar taşınmış / F) flüoresan yoğunluğundaki değişim ve CH503 (Şekil 3E) ve daha yüksek konsantrasyonları ile artmıştır. İlginçtir, CH503 5 ng dozu nöral cevabı baskılayabilir.
Gr68a ve ppk23 nöronlar farklı tepki desenleri sergilendi. Ppk23 nöronlar fazik, titreşimli yanıt (Şekil 3G) göstermişlerdiriii Gr68a nöronların uyarılması, nöronal tepkisinin bir tonik desen (Şekil 3F) göstermiştir. burnumun içinde ppk23 nöronlardan gelen tepkiler vardı birLSO Bu hazırlık kullanılarak ölçülmüş ve fazik ve salınımlı yanıtları (Şekil 3H) içindeki bir kombinasyonunu arzetmiştir.
Şekil 1:. GCaMP kalsiyum görüntüleme tekniğinin temel prensibi GCaMP5G genetik Gal4 ifade edilir hücreleri -etiketli ve nöronal uyarım öncesinde düşük yoğunluklu fluoresces. Bir uyaranın uygulama nöron bir aksiyon potansiyeli tetikler ve Ca 2+ akını neden olur. Bir kez Ca2 + bağlanmış GCaMP5G, zamanla değişen yüksek floresan (kadar taşınmış) ile sonuçlanan, yapısal bir değişiklik olur. Taban floresans (F) önceden uyarılmasına flüoresan sinyal yoğunluğu ifade eder.
Şekil 2: ön ayağı veya hortum nöronların görüntüleme için canlı sinek Montaj.Bant ile lamel sabitlenmiş ön ayaklarını gösteren canlı bir erkek sinek bir 3.2X görüntüsü (A) ön bacağını montajı. Tarsal kesimleri (T1-5) ve ilk tarsal segmentte üstünde ve beşinci tarsal bölümlerine ilişkin bant yerleştirme her gösteren (B) sinek A 40X görüntü. Bant bir parça burnumun ucu açığa çıkarmak için kürsüden üzerine yerleştirilir: burnumun Montaj (C). (D) uyaran eklenmesi için pipet sinek biraz üzerinde tutulur ve hazırlık ile doğrudan temas yapmaz.
Şekil 3:. GCaMP salgılayan nöronların Feromon kaynaklı sinir tepkiler Gr68a-Gal4 uzamsal konumunu gösteren Drosophila erkek ön ayağın (A) şematik tarsal segmentler T2-4 Hücreler etiketli. Nöral olmayan hücreler (boyut ve şekline göre tanımlanmış) coSarı lored. (B) Gr68a-Gal4 sürücüsü tarafından etiketli sinir ve destek hücreleri gösteren erkek ön ayağın Ham floresan görüntü. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Mekansal konumlarını gösteren Drosophila erkek ön ayağın (C) şematik ppk23-Gal4 tarsal segmentler T2-4 üzerinde hücreleri etiketli. (D) CH503 ile Gr68a- ve ppk23 eksprese eden T4 nöronların Yanıt (kimyasal yapısı yukarıda gösterilen). CH503 cevaben ortalama mesafe kadar taşınmış / F ortalama mesafe kadar taşınmış göre / PBST F aşağıdaki uygulama tek başına çözücü edildi; Eşit olmayan (Gr68a için) varyans ya da (ppk23 için), Mann-Whitney testi ile Student t-testi: * P <0.05, *** P <0.001. Hata çubukları sem İstatistiksel güç tasvir = 0.93. (E) Δ F / F doza bağlı değişiklik T4 Gr68a nöronlarda görülmektedir. eşitsiz varyans ile Student t-testi: ** p <0.01, *** p <0.001. İstatistiksel güç = 0,86-0,96. (F (G) salınımlı bir gösteren bir renk kodlu zaman ki, ppk23 ifade nöronlar CH503 stimülasyonu (500 ng) aşağıdaki GCaMP floresan fazik yanıt. ön ayağın ilgili nöronların pozisyonları ham floresan görüntü (sol) gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 10 um; zaman ölçeği: 0-96 sn. Ekteki çizgi grafiği CH503 500 ng tarafından uyarılmaya bir ppk23 nöron bir patlama tepkisini gösterir. Kırmızı ok uyaran ilave edildiği zaman gösterir. zirve RESPOnse 76 sn oluşur. (H) hücre gövdesinden bir geç başlangıçlı tonik tepkisi ve CH503 stimülasyonu (500 ng) Aşağıdaki bir akson projeksiyondan bir salınım tepki gösteren burnumun üzerinde ppk23 ifade nöronlar bir renk kodlu zamanlı ders. hücre pozisyonları ham floresan görüntü (sol) gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 10 mikron =; zaman ölçeği: 0-96 sn. Ark Shankar, S., izni ile çoğaltılmıştır. nöropeptid takikinin bir tat nöral devrede feromon tespiti için gereklidir. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Çözücü 1,2 | CH 5 Çözünürlük 0 3 3 | Solvent tek başına tetikleyici nöronal aktivitenin var mı? 4 |
| % 0.1 PBST | EVET | HAYIR |
| % 100 Etanol | EVET | EVET |
| % 100 Hekzan | EVET | EVET |
| % 10 Etanol | HAYIR | (test edilmedi) |
| % 10 Heksan | HAYIR | (test edilmedi) |
| % 100 DMSO | EVET | EVET |
| % 10 DMSO | EVET | EVET |
| % 0.4 DMSO | EVET | EVET |
| % 0.2 DMSO | EVET | EVET |
Tablo 1:. Çeşitli çözücüler içinde CH 5 0 3 Çözünürlük 1 DMSO:. Dimetil sülfoksit 2 etanol, heksan ve DMSO çözeltileri içinde dH 2 ile seyreltilmiştir O (hac / hac)% 0.2 DMSO içinde CH503 3 Çözünürlük sınırlıydı. sadece 250 ng / ml olmuştur. sadece solventle kadar taşınmış / F 4 artırdığı glikozu eşdeğerdirferomonu ile stimülasyon üzerine ved.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada 2 farklı duyu organları Drosophila periferik nöronların canlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ca + 2 CH503 doza bağımlı ve nicel olduğu feromon ligand ile uyarılan Gr68a-nöronlarda GCaMP fluoresan yanıt -evoked. Böyle fazik ve tonik yanıtlar gibi farklı nöral yanıt desenleri ayırt etmek de mümkündü.
Fazik tepkiler gösteren nöronlar sürekli uyaranlara hızlı uyum sağlamak olduğuna inanılmaktadır. Yanıtın Bu tip koku algılama 25 ve ritmik motor aktivite desen 26 üretimi ile ilişkili bulunmuştur. Buna karşılık, birçok duyu sistemleri tarif edilmiştir nöral salınımlar, tek bir postsinaptik site üzerine çoklu girişler senkronize etmek ve uyarıcı 27 hakkında belirli özellikleri iletmek düşünülmektedir. ppk23 nöronlarla ilgili salınım moleküler temeli henüz kN, bildirilmemiştirowledge. Titreşimli yanıtlarını gösteren uyarılabilir hücrelerin diğer tiplerinde, salınım frekansı, kalsiyum kaynaklı kalsiyum çıkışının 28 adı verilen bir işlem ile düzenlendiği gösterilmiştir. Bu işlemde, kalsiyum sekonder haberci inositol trifosfat kontrolü altında iç depolardan çıkarılmış ve serbest sıklığı dış uyarıcı gücüne bağlıdır edilir. Tonik nöronal tepkilerin moleküler temeli içine Insights C. oksijen algılama reseptörleri üzerinde çalışmalardan elde edilmiştir elegans 29. Nöronlar içindeki kalsiyum seviyelerinde bir artış uzun L-tipi voltaja bağımlı kalsiyum kanalları, riyanodin, ve inositol trifosfat sinyal yolları 29 aracılık ettiği bulunmuştur. Benzer mekanizmaların ppk23 nöronların yanıtlarında rol oynayan olmadığını belirlemek için önemli olacaktır.
Canlı kalsiyum görüntüleme diğer popülasyonlarının çalışması için çeşitli yollarla uyarlanabilir
Çeşitli teknik düşünüldüğüerzak sabit görüntüler elde etmek ve doğru bir fizyolojik tepkilerin zaman ders ölçmek için zorunludur. Uçucu preparatlar arasında değişkenlik kaynağı olabilir çözeltisi ilave edilmesi üzerine güçlü bir hareket sergiler yana İlk olarak, ön ayağı sağlam bir şekilde yerleştirilmelidir. feromon çözeltisinin banyo uygulaması ligandı maruz tarsal bölümlerine ilişkin tat Sensilla tüm ulaşmasını sağlayan rağmen, çözümün bazı monte hazırlama diğer bölgelerinde doğru akabilir. çözeltisi ilave edildiğinde Ayrıca, ön ayağı potansiyel sürüklenip olabilir. İkinci olarak, doğru görüntü neredeyse anlık floresanstaki artış, bazı nöronlar stimülasyon 4 saniye içinde hızlı ve maksimum tepki gösterir çünkü uyarıcı ilavesinden hemen sonra görüntüleme devam etmek için önemli. Seçenek olarak ise, sürekli bir zaman serisi uyaran çözeltisi ve uyaran işaretlenebilir tatbik edildiği hassas zaman noktası eklemeden önce başlatılabilir.
lass = "jove_content"> yalancı pozitif tepkiler İki kaynak gözlendi. İlk olarak, çözücü, kendisine da bir ligandın yokluğunda fluoresan yanıt uyarabilir. PBST Çözücü bir ppk23-Gal4 işaretli hücrelerin böyle bir cevaba yol açtı. Buna ek olarak, DMSO, polar ve apolar molekülleri için yaygın olarak kullanılan çözücü, bazı Gr68a-Gal4 etiketli nöronların bir yanıt uyarmıştır. Solvent kendisi floresan sinyal teşvik edip etmediğinin belirlenmesi ve düşük arka plan aktivitesi olan bir çözücü sistemi seçmek için elzemdir. İkinci olarak, sigara sinir destek hücreleri güçlü bir fazik tipi cevabı, tek başına çözücü, PBST gözlenmiştir. Gr68a-Gal4 sürücüsü nöronların ve genel olarak bir çevreleyen görünür iki nöron ve destek hücrelerde ifade edilir, şekilsiz şeklinde, daha büyük olan ve görünür projeksiyonlar yoksundur. İB'leri seçerken her Gal4 hattı için nöronal olmayan yanıtlardan nöral ayırt etmek önemlidir.
_content "> Bu yöntemin bir önemli bir sınırlama, aynı uçucu hazırlanması uygulanan uyaran önceden iyice lamel yüzeyden sürece farklı konsantrasyonlarda veya ligandlar türlerini test etmek için art arda deneyler için kullanılamaz olmasıdır. Buna ek olarak, bu yöntem, nedeniyle Drosophila nöronların görselleştirme için gerekli olan yüksek büyütme ve hızlı edinim ve yüksek zaman çözünürlüğü için ihtiyaç, bir kerede birden fazla sinek yüksek verimlilik görüntüleme için kullanılamaz. Son olarak, bu yöntem transgenik gen ifadesi için genetik araçlarının kullanılabilirliğini gerektirir böylece öncelikle ana model organizmaların uygulamayı sınırlayan.Özet olarak, bu yöntem, elektrotlar kullanarak hücre kayıtları için daha kolay bir alternatif ve özel cihazlar gerekli değildir. Buna ek olarak, CaLexA gibi diğer genetik olarak kodlanmış muhabir farklı olarak, hayvan yeniden ölçülebilir fizyolojik tepkileri izin görüntüleme boyunca canlı tutulurHer yaştan sinekler yüksek hassasiyetle el-time. Bu özellik, potansiyel ligandlar veya sosyal koşullar ya da üreme durumuna değişiklikleri aşağıdaki nöral yanıtların karşılaştırmak için yaşa bağlı tepkilerin taraması için izin verebilir. Ayrıca, uzun süreli kayıtlar belirgin ışıkla ağartma ya GCaMP sinyali bir özet olarak en az 10 dakika süreyle gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
