Abstract
على عكس الثدييات والحشرات مثل ذبابة الفاكهة لديها عدة أجهزة طعم. الخلايا العصبية حسي كيميائي على الساقين، خرطوم، والأجنحة وحامل البيض من ذبابة الفاكهة تعبر عن مستقبلات الذوقية 1،2، القنوات الأيونية 3-6، ومستقبلات ionotropic 7 التي تشارك في الكشف عن العظة الحسية المتطايرة وغير المتطايرة. هذه الخلايا العصبية الاتصال مباشرة tastants مثل المواد الغذائية والمواد الضارة والفيرومونات، وبالتالي تؤثر على العديد من السلوكيات المعقدة مثل التغذية، وضع البيض والتزاوج. التسجيلات الكهربائي والتصوير الكالسيوم وقد استخدمت على نطاق واسع في الحشرات لقياس الاستجابات العصبية التي حركها هذه tastants. ومع ذلك، الكهربية يتطلب معدات متخصصة وقياسات الحصول على من sensillum وطعم واحد يمكن أن يكون تحديا تقنيا تبعا لنوع الخلايا، حجم، وموقف. وبالإضافة إلى ذلك، القرار الخلايا العصبية واحد في ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون من الصعب تحقيقها منذ هوى طعم الشعيراتحد ذاته أكثر من نوع واحد من الخلايا العصبية حسي كيميائي. طريقة التصوير الكالسيوم الحية وصفها هنا يسمح استجابات الخلايا العصبية الذوقية واحدة في الذباب الحية لقياسها. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة لتصوير الاستجابات العصبية للالفيرومونات الدهون وأنواع يجند الأخرى التي لديها القابلية للذوبان في المذيبات انخفاض المياه القائمة.
Introduction
الحيوانات تعتمد على المعلومات الشمية والذوقية للتوسط القرارات الضرورية من أجل البقاء والتكاثر. فهم كيفية العظة حسي كيميائي يتم الكشف عنها ومعالجتها من قبل الجهاز العصبي يتطلب تحديد مستقبلات الحسية (ق) وبروابط كيميائية المقابلة. ذبابة الفاكهة كشف مجموعة متنوعة مذهلة من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة والتي تشكل نموذجا ممتازا للدراسة الفسيولوجية الآليات الكامنة chemosensation. في حين أن أجهزة الشم تنظر الجزيئات غير المستقرة، وأجهزة الذوقية المتخصصة للكشف عن المركبات تقلبات منخفضة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لقياس مباشرة الاستجابات العصبية من أجهزة طعم ذبابة الفاكهة إلى المنخفض التقلب، بروابط محبة للدهون.
وتشمل أجهزة الذوقية من ذبابة اليدين، خرطوم، والأجنحة. وزعت على السطح من أجهزة طعم لا يشبه الهياكل الشعر المعروفة باسم الشعيرات التي تستجيب إلى sugars، والبيرة، والأملاح والماء والفيرومونات 8. تم تصنيف الشعيرات شكليا إلى شعيرات طعم ومذاق أوتاد 9. وهناك حوالي 31 شعيرات الذوق على labellum التي يتم تصنيفها إلى طويلة (ل-نوع)، قصيرة (الصورة من نوع) والمتوسطة (ط من نوع) الأشكال التضاريسية. و'ل' و 'S' الشعيرات منزل 4 الخلايا العصبية الحسية التي تستجيب من الناحية الفسيولوجية للسكر (الخلية S)، قليل الملح (الخلية L1)، الملح العالية والمركبات المريرة (الخلية L2) والمياه (الخلية W) 10 11. و'ط' بيت 2 الخلايا العصبية الشعيرات الحسية، واحدة من الذي يستجيب على حد سواء لانخفاض الملح والسكر، في حين أن يستجيب أخرى إلى الملح ارتفاعه 12. هناك ما يقرب من 41 الشعيرات الذوق في الذكور و 26 من الإناث الشعيرات في توزيعها على كل من اليدين. لكل من الذكور والإناث، وهناك 21 الشعيرات على midleg، وحوالي 22 الشعيرات على hindleg 13. الخلايا العصبية الذوقية المحاطة الشعيرات الذوق على الساقين هي أيضا جlassified إلى أنواع L1، L2، W و S.
واحد طريقة معيارية لقياس النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية واحدة يستخدم أقطاب الخلية أو الخلايا لتسجيل تدفق أيون. تسمح قياسات الكهربائي وظيفة الخلايا العصبية التي يتعين دراستها في الكائنات غير النموذجية مثل الأنواع ذبابة الفاكهة، العث، والنحل التي تفتقر إلى أدوات جينية شاملة لوضع العلامات العصبية. ومع ذلك، في حين أن الطرق الكهربية استخدمت بشكل روتيني لقياس النشاط من ذبابة الفاكهة طعم الشعيرات 4،13،14، وتطبيق هذا النهج يقدم العديد من التحديات التقنية. أولا، تذوق الشعر الخشن لا بد من تحديد القائمة على التشكل والموقع المكاني. على تعريف وقياس الكهربية يمكن يعوقه حجم صغير من الشعيرات، وسهولة الوصول محدودة بسبب الموقف، وصعوبة في تطبيق مجلدات تسيطر على التحفيز الكيميائي لتذوق الشعر الخشن. أيضا، وتحفيز الشعيرات قد تولد إشارات من أكثر من واحدنوع الخلايا العصبية 15. الثانية، والكشف عن إشارات كهربائية يمكن أن تتغير نتيجة للضجيج في الخلفية الناتجة عن الاهتزازات الميكانيكية والضوضاء من المعدات الإلكترونية. ثالثا، استخدام القطب شحذ يمكن أن تلحق الضرر إعداد الطاير، إذا ما استخدمت بشكل غير صحيح (14). وأخيرا، وتجميع وتلاعب الكهربية يتطلب المكونات الإلكترونية المتخصصة لتقديم الحوافز، وتسجيل إشارة، وتحليل البيانات ويمكن أن يكون مكلفا.
في د. البطن، وقد سهلت توافر أدوات ترميز وراثيا لتطوير تقنيات التصوير التي تسمح ردود المجموعات الصغيرة من الخلايا العصبية التي يتعين دراستها. أحد هذه التوجهات هو استخدام لمراسل CaLexA 16. في هذه الطريقة، وتنصهر تسلسل الجينات التي تشفر عامل النسخ LexA-VP16 والكالسيوم حساسة NFAT البروتين معا. تفعيل الكالسيوم من الكالسينيورين بروتين الفوسفاتيز يحفز-الفسفرة دي من NFAT، وبدوره، facilitaقسم التدريب والامتحانات وارداتها إلى النواة. داخل النواة، يربط المجال LexA لعزر ملزمة LexAop الحمض النووي التي توجه التعبير مراسل الأخضر بروتين فلوري (GFP)، مما يتيح تحديد المستدام من الخلايا العصبية تنشيط وظيفيا. وقد استخدم النهج بنجاح لقياس استجابة من الكبيبات حاسة الشم محددة في الفص antennal بعد التعرض للذباب حية إلى الرائحة 16. مؤخرا، تم قياس الاستجابات الفسيولوجية للIR52c الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية من الذباب الحية باستخدام CaLexA 7. ومع ذلك، من أجل هذه الدراسة، كان من الضروري أن الذباب العمر لمدة تصل إلى 6 أسابيع لتعزيز GFP النسخ. في حين المناعية مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP يمكن استخدامها لتعزيز إشارة CaLexA، فإن هذا الأسلوب يتطلب تثبيت الأنسجة، مما يحول دون إمكانية التصوير الخلية الحية.
كما استخدمت الكالسيوم البروتين مؤشر GCaMP المشفرة وراثيا على نطاق واسع لدراسة استجابات الخلايا العصبية في عدد منالأنواع 17. وGCaMP البروتين تتفلور مع كثافة منخفضة قبل لتحفيز الخلايا العصبية. تطبيق التحفيز يؤدي إمكانات العمل في الخلايا العصبية، مما أدى إلى تدفق الكالسيوم 2+. GCaMP، منضما إلى الكالسيوم 2+، يخضع لتغيير متعلق بتكوين، الامر الذي ادى الى يتألق مع كثافة أكثر إشراقا (الشكل 1). تم استخدام نهج التصوير الكالسيوم الخلايا العصبية واحدة وضعت مؤخرا لتحديد الجلوكوز كما يجند لالرجل الاماميه محددة الخلايا العصبية الذوقية Gr61a 18. في هذه الدراسة، تمت تغطية اليدين تشريح من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا معربا عن GCaMP في الخلايا العصبية الذوقية Gr61a مع طبقة من الاغاروز قبل التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام تشريح الأنسجة يمكن أن يسبب المتهدمة في نهاية المطاف التعبير GCaMP، مما يحد من قياس الوقت وحساسية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، الاغاروز يمكن أن تحد من حساسية بسبب مستويات خلفية عالية من مضان وخصائص تشتت الضوء فيها.
تس معالجة بعض من هذه العيوب، وصفنا استخدام التصوير الكالسيوم بوساطة GCaMP لتسجيل الاستجابات الفسيولوجية من الرجل الاماميه وخرطوم الخلايا العصبية الذوقية للحيوانات سليمة. نقدم لك مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية للGr68a والخلايا العصبية ppk23 معربا عن المشفرة وراثيا GCaMP5G 19 إلى الدهن فرمون ذبابة الفاكهة، (3 R، 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11،19-octacosadien-1-را (CH503) 20، 21. يتم قياس الاستجابات العصبية عن طريق قياس الزيادة في مضان من إشارة GCaMP5G خلال التحفيز فرمون. في هذا البروتوكول، ويتم تصوير الخلايا العصبية لمدة إجمالية قدرها 120 ثانية، وهو ما يكفي لتمييز أنماط تفعيل الخلايا العصبية في الخلايا الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
التحضير 1. عينة
- عبور خط GAL4 3،22 سائق لUAS-GCaMP5G 19 الذباب (ث 1118؛ P {20XUAS-الحبس الاحتياطي، GCaMP5G} attP40). السماح للصليب أن تنمو في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
ملاحظة: توليد يطير مع نسخ متعددة من الجينات المحورة GAL4 أو UAS-GCaMP يمكن أن تساعد على تعزيز كثافة إشارة الفلورسنت. أظهر إصدار سابق من التحوير UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ضعيف جدا كثافة مضان عندما أعرب تحت سيطرة السائق Gr68a-GAL4.- جمع ومنفصلة حسب الجنس eclosed حديثا الذباب الكبار وزيادة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
ملاحظة: المستوى الأساسي من GCaMP5G تنوير هو الأمثل في الذباب الذين تتراوح أعمارهم بين 14-28 يوما. عزل الذباب حسب الجنس يحول دون إمكانية التفاعلات الاجتماعية التي قد تؤثر على الاستجابات العصبية.
- جمع ومنفصلة حسب الجنس eclosed حديثا الذباب الكبار وزيادة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- تخدير ذبابة تحت تيار خفيف من CO 2.
- إرفاق ولاي لساترة الزجاج عن طريق وضع أول قطرة صغيرة من طلاء الأظافر في وسط ساترة 0.17 مم. وضع بلطف ذبابة على جانبها على قطرة من طلاء الأظافر واضحة والتأكد من أن الانخفاض بأكمله تغطيها الطاير.
- تنفيذ الخطوات 1.5 و 1.6 تحت مجهر تشريحي تشريح، وتستخدم في 8X التكبير.
- استخدام الفرشاة المبللة على مد الرجل الاماميه من الطيران. تأمين الرجل الاماميه في الموقف من خلال وضع اثنين من شرائح رقيقة من الشريط فوق الأولى والخامسة قطاعات الجفن (الشكل 2A). وهذا فضح شرائح الجفن T2-T4 للتصوير (الشكل 2B).
- إلى الخلايا العصبية الصورة على خرطوم الفيل، ضع شريطا ضيقا من الشريط على المنصة للخرطوم لفضح labellum (الشكل 2C، D).
- رسم حاجز مسعور حول الطاير مع القلم PAP لمنع الحل من التدفق على سطح ساترة. إجراء قياسات في غضون 30 دقيقة من تصاعد.
2. إعداد خطة التحفيزحل
- تمييع بروابط محبة للدهون (مثل CH503، المستخدمة في هذه الدراسة) في حل PBST: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 0.1٪ تريتون X-100 (ت / ت )؛ ودرجة الحموضة 7.4.
- جعل 1 ملغ / مل محلول المخزون من يجند باستخدام PBST. إعداد جميع التخفيفات لاحقة من محلول المخزون باستخدام PBST.
ملاحظة: اعتمادا على ذوبان يجند من الفائدة، قد تكون هناك حاجة المذيبات المختلفة إلى حل يجند. ووصف ذوبان CH503 في المذيبات المختلفة في الجدول 1. وخلافا لغيرها من المذيبات، لم PBST لا ينتج زيادة في مضان.
- جعل 1 ملغ / مل محلول المخزون من يجند باستخدام PBST. إعداد جميع التخفيفات لاحقة من محلول المخزون باستخدام PBST.
3. تحفيز الخلايا العصبية ذوقي والحصول على الصور
- باستخدام pipettor 10 ميكرولتر، ضع 10 ميكرولتر من PBST على قطاعات عظم الكعب.
ملاحظة: يرطب هذه الخطوة الساق ويمنع قطاعات الجفن من الانجراف. - استخدام نظام بصري أن يحتوي على كاميرا من سوسرعة fficient وحساسية لتحقيق إشارة مضان جيدة في قرار الأوان.
ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة كنا قرص الغزل المجهر متحد البؤر وكاميرا sCMOS (انظر قائمة المواد). - اختيار شريحة والخلايا العصبية الرصغي محددة للتصوير. الحصول على ثلاثة قبل التحفيز مبائر Z-المداخن.
- من الناحية المثالية، إعدادات استخدام الاستحواذ، والتي هي سريعة بما يكفي للسماح قرار الوقت القصوى في حين لا يزال الاستيلاء على حجم الخلية بأكملها. ضبط اكتساب سبيل المثال هي: 200 التعرض مللي ثانية، binning 2 × 2 و 6 × 0.5 ميكرون 2 المقاطع البصرية، والقبض على كل 2 ثانية.
ملاحظة: تم تصوير الساقين مشلول بنجاح لمدة تصل إلى 10 دقيقة، في 30 ثانية فترات، مع تبييض لا يمكن تمييزه من إشارة GCaMP. للمرة تسجيل أطول، تأكد من أن الساقين وعقد بحزم شديد في مكان على ساترة. - تحسين قوة الليزر لأعلى إشارة إلى الضوضاء يمكن تحقيقه مع الحد الأدنى من photobleaching من خلال معهد العالم العربي بأكملهجينج النظام. لوصف التجارب هنا، استخدم 491 نانومتر ليزر ديود (100 ميغاواط) في نقل 30٪ للتصوير على حد سواء Gr68a والذوقية ppk23 الخلايا العصبية على الساقين وخرطوم. استخدام 2 × 2 binning للسماح مرات التعرض أقصر في حين لا يزال تحقيق القرار المكانية كافية.
ملاحظة: تم الأمثل إعدادات الطاقة ليزر للسماح للكشف عن تغيير الفلورسنت تتراوح بين زيادة 1.2- إلى 4.5 أضعاف.
- من الناحية المثالية، إعدادات استخدام الاستحواذ، والتي هي سريعة بما يكفي للسماح قرار الوقت القصوى في حين لا يزال الاستيلاء على حجم الخلية بأكملها. ضبط اكتساب سبيل المثال هي: 200 التعرض مللي ثانية، binning 2 × 2 و 6 × 0.5 ميكرون 2 المقاطع البصرية، والقبض على كل 2 ثانية.
- ماصة 10 ميكرولتر من الحل التحفيز على قطاعات عظم الكعب. لتجارب السيطرة، إضافة 10 ميكرولتر آخر من PBST. على الفور الحصول على 117 وصور ما بعد التحفيز.
ملاحظة: يعتمد عدد الصور بعد التحفيز حصلت على مقدار الوقت الذي تم التوصل التغيير القصوى في مضان (حوالي 2 دقيقة).- خطوة حاسمة: في حين pipetting لحل بشأن إعداد ولا للمس ذبابة مع طرف ماصة لأن هذا سوف يسبب الرجل الاماميه للخروج من الموقف.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدموmicromanipulator لوضع بدقة الشعرية زجاجية تحتوي على مقربة من الحوافز للقطاع الرصغي إلى أن تصوير. تسليم وحدات التخزين التي تسيطر عليها من التحفيز باستخدام موزع حقن مكروي داخل الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- خطوة حاسمة: في حين pipetting لحل بشأن إعداد ولا للمس ذبابة مع طرف ماصة لأن هذا سوف يسبب الرجل الاماميه للخروج من الموقف.
4. معالجة الصور والتحليل: الكمي للاستجابة
- فتح سلسلة من مبائر Z-مداخن باستخدام فيجي ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 أو يماغيج ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) تحليل 24 صورة وبرامج معالجة.
- جعل إسقاط مبلغ الشدة من جميع شرائح Z ستة لكل نقطة من النقاط الزمنية 120.
- حدد الخيار "المكدس" تحت عنوان "صورة". وعلاوة على ذلك، حدد الخيار "Z الإسقاط" وأدخل "1" شريحة بداية و "4"، كما توقف شريحة. لنوع الإسقاط، حدد R20؛ شرائح المبلغ "من القائمة المنسدلة، واختيار" جميع الأطر الزمنية ".
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام أداة التحديد مرفوعة لرسم الحدود حول جسم الخلية أو الخلايا العصبية الإسقاط. انقر على علامة "تحليل" وحدد الخيار "مدير العائد على الاستثمار" تحت عنوان "أدوات".
- قياس مضان من العائد على الاستثمار عن طريق تحديد الخيار "تعيين القياسات"، ضمن القائمة "تحليل" والتحقق من صناديق لكثافة متكاملة، منطقة، يعني والحد الأقصى لقيمة الرمادي والتسمية. ثم، حدد الخيار "المزيد" ضمن القائمة مدير العائد على الاستثمار، وزيادة تحديد خيار "مقياس متعدد".
ملاحظة: هذا سيولد مربع منبثقة مع القيم لكل من المعلمات المحدد. - تحقق أقصى قدر من القيم الرمادية لضمان أن أيا من بكسل وقد وصل إلى درجة التشبع (على سبيل المثال، 65535 لكاميرا 16 بت).
ملاحظة: للحصول على هذه التجارب هو مبين في رتم قياس ورقته، والاستجابات إما من أجسام الخلايا العصبية أو إسقاطات، تبعا للمكان الذي لوحظ زيادة القصوى في ΔF / F. - حساب التغير النسبي الأقصى في مضان (ΔF / F) في وقت نقطة ر هي كما يلي:
- مضان خلفية طرح من كل (الخلية) قيمة F. لقياس مضان الخلفية، وقياس كثافة متكاملة من العائد على الاستثمار من حجم يعادل وشكل من منطقة من الرجل الاماميه (أو خرطوم) يخلو من الخلايا العصبية التي يمكن اكتشافها.
- لتحديد ر بعد التحفيز مضان، F (الخلية)، وقياس كثافة متكاملة من العائد على الاستثمار من خلايا الجسم أو عملية في وقت نقطة "تي" بعد التحفيز.
- لقياس مضان قبل التحفيز، F (الخلية) ر = 0، تحليل الصور قبل التحفيز من خلايا الجسم أو عملية في نفس الطريقة كماإشارة بعد التحفيز. استخدام كثافة متكاملة يعني من 3 صور لتحديد F (الخلية) ر = 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأعرب عن مؤشر الكالسيوم GCaMP وراثيا باستخدام Gr68a-GAL4 أو السائقين ppk23-GAL4. وصفت السكان متميزة من الخلايا العصبية والخلايا الرجل الاماميه الدعم غير العصبية من قبل كل سائق (الشكل 3A-C). وقد لوحظت ردود يجند محددة لCH503 فرمون دهون في Gr68a-GAL4 والخلايا ppk23-GAL4 التعبير عن GCaMP (الشكل 3D). التغير النسبي في كثافة مضان من إشارة GCaMP5G (ΔF / F) وارتفع مع تركيزات أعلى من CH503 (الشكل 3E). ومن المثير للاهتمام، والجرعة 5 نانوغرام من CH503 قد يكبت الإستجابة العصبية.
Gr68a والخلايا العصبية ppk23 عرضت أنماط استجابة مختلفة. وأظهرت الخلايا العصبية Gr68a نمط منشط للاستجابة الخلايا العصبية (الشكل 3F)، في حين أظهرت ppk23 الخلايا العصبية وطورية، والاستجابة متذبذبة (الشكل 3G). وكانت الردود من الخلايا العصبية ppk23 في خرطوم لقياس يسوتو باستخدام هذا المستحضر وعرضت مجموعة من الردود طورية ومتذبذبة (الشكل 3H).
الشكل 1: المبدأ الأساسي للتقنية التصوير الكالسيوم GCaMP وأعرب عن GCaMP5G وراثيا في GAL4 -labeled الخلايا وتتفلور مع كثافة منخفضة قبل لتحفيز الخلايا العصبية. تطبيق التحفيز يؤدي إمكانات العمل في الخلايا العصبية ويسبب الكالسيوم 2+ تدفق. GCaMP5G، مرة واحدة متجهة إلى الكالسيوم 2+، يخضع لتغيير متعلق بتكوين، مما أدى إلى زيادة مضان (ΔF)، والذي يتغير مع مرور الوقت. ويشير مضان خط الأساس (F) لشدة إشارة الفلورسنت قبل التحفيز.
الشكل 2: تصاعد ذبابة الحية للتصوير من الرجل الاماميه أو خرطوم الخلايا العصبية.(A) تصاعد الرجل الاماميه: صورة 3.2X من ذبابة الذكور الحية، والتي تبين اليدين تثبيتها على ساترة مع الشريط. (ب) صورة و40X من ذبابة، والتي تبين كل من قطاعات الجفن (T1-5) ووضع شريط فوق قطعة الرصغي الأول وعلى قطاعات الجفن الخامسة. (ج) تركيب خرطوم: يتم وضع قطعة من الشريط على المنصة لفضح غيض من خرطوم. (D) غيض ماصة لإضافة حافز يقام أعلى قليلا الطاير ولا يجعل الاتصال المباشر مع التحضير.
الرقم 3: الردود التي يسببها فرمون العصبية في GCaMP، معربا عن الخلايا العصبية (A) تخطيطي الرجل الاماميه الذكور من ذبابة الفاكهة تبين مواقع المكانية للGr68a-GAL4 صفت الخلايا على شرائح الجفن T2-4. الخلايا غير العصبية (التي تم تحديدها على أساس الحجم والشكل) هي التعاونlored الأصفر. (ب) صورة الفلورسنت الخام من الرجل الاماميه الذكور تظهر الخلايا العصبية والدعم وصفت من قبل برنامج تشغيل Gr68a-GAL4. شريط النطاق = 50 ميكرون. (C) تخطيطي من الرجل الاماميه الذكور من ذبابة الفاكهة تبين مواقع المكانية للppk23-GAL4 المسمى الخلايا على شرائح الجفن T2-4. (D) استجابة Gr68a- والخلايا العصبية T4، معربا عن ppk23 إلى CH503 (التركيب الكيميائي أظهرت أعلاه). وتمت مقارنة متوسط ΔF / F ردا على CH503 إلى متوسط ΔF / F التطبيق التالي من PBST مذيب وحدها؛ الطالب اختبار t مع التباين عدم المساواة (لGr68a) أو اختبار مان ويتني (لppk23): * ف <0.05، *** ع <0.001. أشرطة الخطأ تصور ووزارة شؤون المرأة قوة إحصائية = 0.93. (E) تغير تعتمد على الجرعة في Δ F / F لوحظ في الخلايا العصبية Gr68a في T4. الطالب اختبار t مع تباين غير المتكافئ: ** ف <0.01 ***، ف <0.001. القوة الإحصائية = 0،86-0،96. (F (G) دورة الوقت مرمزة تظهر بطريقة اهتزازية، والاستجابة طوري في GCaMP مضان بعد التحفيز CH503 (500 نانوغرام) من الخلايا العصبية، معربا عن ppk23. وتظهر مواقف الخلايا العصبية على الرجل الاماميه في الصورة الفلورية الخام (يسار). شريط الحجم: 10 ميكرون. النطاق الزمني: 0-96 ثانية. ويبين خط الرسم البياني المصاحب استجابة انفجار من الخلايا العصبية ppk23 إلى التحفيز من قبل 500 نانوغرام من CH503. السهم الأحمر يشير إلى الوقت الذي تم إضافة التحفيز. ذروة RESPOيحدث NSE في 76 ثانية. (H) دورة الوقت مرمزة من الخلايا العصبية، معربا عن ppk23 على خرطوم يبدون استجابة منشط في وقت متأخر من بداية من خلايا الجسم واستجابة متذبذبة من إسقاط المحاور التالية التحفيز CH503 (500 نانوغرام). وتظهر مواقف الخلايا في صورة الفلورسنت الخام (يسار). شريط النطاق = 10 ميكرون. النطاق الزمني: 0-96 ثانية. مستنسخة بإذن من شانكار، S.، وآخرون. وtachykinin نيوروبيبتيدي أمر ضروري للكشف عن فرمون في الدائرة العصبية الذوقية. دوى:. 10،7554 / eLife.06914 (2015) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1،2 المذيبات | ذوبان CH 5 0 3 3 | هل وحده الزناد نشاط الخلايا العصبية المذيبات؟ 4 |
| 0.1٪ PBST | نعم فعلا | لا |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | نعم فعلا | نعم فعلا |
| 100٪ الهكسين | نعم فعلا | نعم فعلا |
| 10٪ إيثانول | لا | (لم تختبر) |
| 10٪ الهكسين | لا | (لم تختبر) |
| 100٪ DMSO | نعم فعلا | نعم فعلا |
| 10٪ DMSO | نعم فعلا | نعم فعلا |
| 0.4٪ DMSO | نعم فعلا | نعم فعلا |
| 0.2٪ DMSO | نعم فعلا | نعم فعلا |
الجدول 1: الذوبان من CH 5 0 3 في مختلف المذيبات 1 DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد وفي المخفف 2 الإيثانول، الهكسان، والحلول DMSO مع DH 2 O (ت / ت) 3 الذوبان من CH503 في 0.2٪ DMSO كان محدودا. كان فقط إلى 250 نانوغرام / مل. 4 زيادة في ΔF / F مع المذيبات وحدها يعادل ذلك obserفيد على التحفيز مع فرمون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف طريقة لأداء التصوير الكالسيوم الحية من الخلايا العصبية الطرفية ذبابة الفاكهة في 2 مختلفة الحواس. كا 2+ -evoked الردود الفلورسنت GCaMP في Gr68a الخلايا العصبية الناجمة عن يجند فرمون كانت CH503 الجرعة التي تعتمد على والكمية. كان من الممكن أيضا أن نتبين مختلف أنماط الاستجابة العصبية مثل طورية وردود منشط.
ويعتقد أن الخلايا العصبية تظهر ردود طوري يتيح التكيف السريع للمؤثرات مستمرة. وقد ارتبط هذا النوع من الاستجابة مع الكشف عن رائحة 25 و توليد أنماط النشاط الحركي الإيقاعي 26. في المقابل، التذبذبات العصبية، التي تم وصفها في العديد من الأنظمة الحسية، ويعتقد أن لمزامنة مدخلات متعددة على موقع واحد بعد المشبكي ونقل ملامح محددة حول الحوافز 27. لم يتم إبلاغ الأساس الجزيئي للاهتزازات المرتبطة الخلايا العصبية ppk23، لدينا KNowledge. في أنواع أخرى من الخلايا منفعل تظهر ردود متذبذبة، وقد تبين من وتيرة التذبذب إلى أن ينظم عملية تسمى الناجم عن الكالسيوم إطلاق الكالسيوم 28. في هذه العملية، يتم تحرير الكالسيوم من مخازن الداخلية تحت سيطرة الثانوية ثلاثي رسول اينوزيتول، وتواتر صدوره يعتمد على قوة الحافز الخارجي. وقد اكتسبت نظرة ثاقبة الأساس الجزيئي للاستجابات الخلايا العصبية منشط من الدراسات على مستقبلات الاستشعار الاوكسجين من C. ايليجانس 29. تم العثور على الزيادة التي طال أمدها في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا العصبية ليتم بوساطة L-نوع الجهد قنوات بوابات الكالسيوم، ryanodine، ومسارات اينوزيتول ثلاثي الفوسفات مما يشير إلى 29. وسيكون من المهم للتأكد مما إذا آليات مماثلة تلعب دورا في استجابات الخلايا العصبية ppk23.
التصوير الكالسيوم الحية يمكن تكييفها في عدة طرق لدراسة السكان الآخرين
العديد من conside الفني حصص أمر لا بد منه للحصول على صور ثابتة ولقياس بدقة مدار الساعة من الاستجابات الفسيولوجية. أولا، الرجل الاماميه يجب أن تكون في وضع آمن منذ الطاير المعارض حركة نشطة على إضافة محلول، التي يمكن أن تكون مصدرا للاختلاف بين الاستعدادات. على الرغم من أن تطبيق حمام من حل فرمون يسمح يجند للوصول إلى جميع من الشعيرات الذوقية على قطاعات الجفن المكشوفة، وبعض من الحل يمكن أن تتدفق نحو أجزاء أخرى من إعداد محمولة. أيضا، يمكن أن الرجل الاماميه يحتمل أن ينجرف بعيدا عند إضافة محلول. ثانيا، بدقة صورة شبه لحظية زيادات في مضان، فمن المهم لاستئناف التصوير مباشرة بعد إضافة الحافز منذ بعض الخلايا العصبية تظهر الاستجابة السريعة والقصوى في غضون 4 ثوان من التحفيز. بدلا من ذلك، سلسلة زمنية متواصلة يمكن أن تبدأ قبل إضافة حل التحفيز، ونقطة زمنية دقيقة الذي يدار الحوافز يمكن أن تكون علامة.
معشوقة = "jove_content"> لوحظ مصدران من ردود الفعل الإيجابية الكاذبة. أولا، المذيب نفسه يمكن أن تحدث ردود الفلورسنت حتى في حالة عدم وجود يجند. تسبب المذيب PBST مثل هذه الاستجابة في بعض الخلايا ppk23-GAL4 المسمى. وبالإضافة إلى ذلك، دمس، المذيبات المستعملة عادة للجزيئات القطبية وعديم الأقطاب، كما حفز استجابة في بعض الخلايا العصبية Gr68a-GAL4 المسمى. ولذا فمن الضروري تحديد ما إذا كان المذيب نفسه يدفع إشارة الفلورسنت ولتحديد نظام المذيبات مع النشاط خلفية منخفضة. ثانيا، لوحظ وجود استجابة قوية طوري من نوع في خلايا الدعم غير العصبية إلى PBST المذيبات وحدها. يتم التعبير عن سائق Gr68a-GAL4 في كل من الخلايا العصبية وخلايا الدعم التي تظهر أن تحاصر بعض الخلايا العصبية وبشكل عام، هي أكبر، على شكل amorphously، وعدم وجود توقعات واضحة. ولذلك فمن المهم أن نفرق العصبية من الاستجابات غير العصبية لكل خط GAL4 عند اختيار رويس.
_content "> قيود رئيسي واحد هذا الأسلوب هو أن إعداد ذبابة نفسه لا يمكن أن تستخدم في التجارب المتعاقبة لاختبار تركيزات مختلفة أو أنواع بروابط، ما لم يتم أولا إزالة الحوافز المطبقة تماما من سطح ساترة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يمكن أن تستخدم للتصوير عالية الإنتاجية من عدة الذباب في وقت واحد، ويرجع ذلك إلى التكبير العالية اللازمة لتصور الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة، والحاجة إلى اكتساب سريع وقرار الأوان. وأخيرا، هذا الأسلوب يتطلب توافر الأدوات الجينية للتعبير الجينات المعدلة وراثيا ، مما يحد من الطلب في المقام الأول بالنسبة للكائنات نموذج الرئيسية.وإجمالا، وهذه الطريقة بديلا أسهل إلى تسجيلات الخلوية باستخدام أقطاب كهربائية و لا يتطلب الأجهزة المتخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، وخلافا للصحفيين آخرين المشفرة وراثيا مثل CaLexA، يتم الاحتفاظ الحيوان على قيد الحياة طوال التصوير السماح الاستجابات الفسيولوجية للقياس في إعادةآل الوقت مع حساسية عالية في الذباب من جميع الأعمار. هذه الميزة يمكن أن تسمح لفحص الاستجابات التي تعتمد على سن للجين أو المقارنة بين الاستجابات العصبية حدوث تغيرات في الظروف الاجتماعية أو الدولة الإنجابية. وعلاوة على ذلك، تسجيلات مستمرة لا يمكن أن يؤديها لمدة 10 دقيقة على الأقل دون photobleaching من الواضح أو المتهدمة من إشارة GCaMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
