Introduction
Målet med denne metode er at skabe en reproducerbar model for svær, flow-induceret pulmonal arteriel hypertension i rotter og måle dens princip hæmodynamisk og histopatologiske endepunkter.
Pulmonal arteriel hypertension (PAH) er en klinisk syndrom, der omfatter en gradvis stigning i pulmonal vaskulær modstand fører til højre ventrikel svigt og død. Inden for overordnet sygdom spektrum af pulmonale hypertensive sygdomme (PH), PAH er den mest alvorlige form og en, der forbliver uden en kur 1. Den underliggende arteriopathy i PAH er karakteriseret ved en typisk form for vaskulær remodellering, der okkluderer karhulrummet. Muscularization af normale ikke-muscularized skibe og hypertrofi af den mediale fartøj lag betragtes som tidlige sygdom fænomener i PAH, ses også i andre former for PH 2, og menes at være reversible 3. Som PAH advances, det intimale lag begynder at omforme, efterhånden danner karakteristiske neointimal læsioner 2. Neointima-typen pulmonal vaskulær remodellering er eksklusivt til PAH og er i øjeblikket betragtes at være uoprettelige 4.
Som PAH er en sjælden sygdom, fremskridt i sin patobiologiske forståelse og udvikling af nye behandlingsformer har lid dyremodeller. Den monocrotalin (MCT) model i rotter er en simpel enkelt hit model, der har været, og stadig er, bruges ofte. MCT er et toksin, der forårsager skade på de pulmonale arterioler og regionale betændelse 5. 60 mg / kg MCT fører til en stigning i den gennemsnitlige pulmonale arterietryk (mPAP), pulmonal vaskulær modstand (PVR), og højre ventrikel hypertrofi (RVH) efter 3 - 4 uger 6. Den histomorphology er karakteriseret ved isolerede mediale hypertrofi uden neointima læsioner 5. MCTrotte model repræsenterer således en moderat form for PH, og ikke PAH, selv om det er almindeligt præsenteres som sidstnævnte.
I børn med PAH associeret med en medfødt venstre-til-højre shunt (PAH-CHD), øget pulmonal blodgennemstrømning betragtes som den væsentlige udløsende faktor for udviklingen af neointimal læsioner 7, 8, 9. Hos rotter kan øget pulmonal blodgennemstrømning induceres ved oprettelsen af en shunt mellem den abdominale aorta og vena cava, en teknik først beskrevet i 1990 10. Alternativer til at skabe øget pulmonal flow er ved ensidig pneumonectomy eller subclavia til lungepulsåren anastomose 11. Konceptuelle ulemper ved disse modeller består af potentiel kompenserende vækst af den resterende lunge og adaptiv baneaktivering induceret af pneumonectomy, eller for iatrogen læsion af den pulmonale vaskulatur grundtil pulmonal anastomose, både confounding virkningerne af øget pulmonal blodgennemstrømning.
Når en aorto-cava shunt skabes og forøget pulmonær blodstrøm induceres som et andet hit i MCT-behandlede rotter, forekommer karakteristiske neointimal læsioner, og en alvorlig form for PAH og tilknyttede højre ventrikel (RVF) udvikle 3 uger efter den øgede flow 12. Den hæmodynamiske progression af PAH i denne model kan vurderes in vivo ved ekkokardiografi og højre hjerte kateterisering. Det vaskulære histomorphology, godstykkelsen, graden af arteriolær okklusion, og parametre for højre ventrikel svigt danne søjlerne i den ex vivo karakterisering af PAH.
Denne metode beskriver detaljerede protokoller for aorto-cava shunt (AC-shunt) kirurgi, lige hjerte kateterisation og kvalitativ og kvantitativ vurdering af vaskulær histomorphology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af det hollandske centrale udvalg for dyreforsøg og Animal Care udvalget på University Medical Center Groningen (NL). Både Wistar og Lewis rotter med vægte mellem 180 og 300 g blev anvendt.
1. Boliger og akklimatisering
- Efter ankomst til centrale dyr facilitet, hus rotter i grupper på 5 pr bur. Under en 7-dages akklimatisering periode, vænne rotterne for menneskers håndtering, men ikke udføre nogen eksperimentelle procedurer.
2. Forberedelse og Injektion af sterilt Monocrotalin
- For 1 ml 60 mg / ml monocrotalin (MCT) opløsning afvejes 60 mg monocrotalin i en 2-ml rør. Tilføj 700 pi af 0,9% NaCl. Tilsæt 200 pi af 1 M HCI. Varm løsningen i røret under varmt vand kører hanen og vortex det. Brug 6 N NaOH for at bringe pH mod 7,0. Brug steril teknik til forberedelse af MCT til injektion i gnavere. Injicer 1 ml steril 60 mg / ml MCT-opløsning pr kg subkutant i nakken (0,3 ml 60 mg / ml MCT til en 300 g rotte). BEMÆRK: Vi foretrækker ikke at anvende mindre mængder på grund af den større chance for, at den injicerede dosis ikke vil være hensigtsmæssig.
3. Aorta-Caval Shunt Surgery
- Anæstesi.
- Fyld induktion kammer med 5% isofluran / 100% O2 (flow: 1 L / min) og placere rotten i kammeret. Check for tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at udføre en hind tå knivspids. Afvej rotten.
- Barber og rengør maven over et område, der er cirka 8 cm lang og 3 cm bred. Placer rotte på ryggen på en varmemåtte (37 ° C), dækket af et sterilt måtte.
- Placer snuden i en udluftning maske / hætte til 2 - 3% isofluran / 100% O 2 (flow: 1 L / min). Check anæstesidybden ved at udføre en hind toe pinch. Påfør øjensalve at forhindre tørhed mens under anæstesi.
- Shunt SurGery.
- Skrub huden med chlorid-hexidine til desinfektion. Injicer 0,01 mg / kg buprenorphin subkutant til postoperativ analgesi.
- Brug sterile instrumenter til kirurgi. Lav et snit med en # 10 skalpelblad i underlivet på midterlinjen, startende 1 cm under mellemgulvet en strækker sig ned til lige over kønsorganer.
- Løft tarmen med en vatpind, dækker tarmene i en steril, våd gaze (0,9% NaCl), og placere dem til venstre side af dyret.
- Brug vatpinde til at adskille de membraner, der fastgør den abdominale aorta og vena cava inferior til de omgivende væv.
BEMÆRK: Brug ikke dissekere membranerne mellem aorta og vena cava. - Ved hjælp af splinter pincet, fjern perivaskulære aorta fedt lige over forgreningen, kun på den højre side af aorta og kun på det sted, hvor nålen vil blive indsat.
- Brug vatpinde til at adskille aorta og vena cava fra 2 mm superior til det sted, hvor nålen skal indsættes for at skabe plads til en Biemer klemme.
- På dette område, først placere en løs ligatur (5-0 sutur) omkring aorta. Opret spænding på ligatur ved at placere en Kocher klemme på det, og derefter placere Kocher overlegen snittet (figur 1A). Placer Biemer klemme bare overlegen ligatur (Figur e 1A).
- Ved hjælp af en vatpind, komprimere vena cava som distalt som muligt for at spærre for strømmen (figur 1A). Bend en nål (18 G i denne protokol) i en vinkel på 45 grader, med åbningen peger mod ydersiden (figur 1A).
- I en vinkel på 90 grader, indfør kanylen i aorta, lige over forgreningen, med åbningen af nålen peger til venstre (figur 1A). Manipulere spidsen af nålen til venstre og sæt den ind i vena cava.
BEMÆRK: nålespidsen skulle nu være visible i vena cava (figur 1B). - Anvendes en anden vatpind til at skubbe det resterende blod i aorta ud af indsættelsesstedet for at forhindre trombose. Tørre området omkring shunten med en steril gaze, for at limen i tilstrækkelig grad at holde.
- Træk hele kanylen ud af aorta og straks anvende en dråbe vævslim på punkturstedet i aorta. Sørg for ikke at lime vatpind til vævet. Unclamp aorta.
- Verificere shunt manuelt ved at trække og slippe ligaturen på aorta proximalt til shunten. Løsning skal farve vena cava distalt for shunt i lyse rødt og skabe turbulens ved shunt site.
BEMÆRK: Stramning vil omdanne blod i vena cava tilbage til mørkerød. - Placer tarmene tilbage i dyret. Luk muskel lag og hud med resorberbare 4-0 suturer. Udluft dyret med 100% O 2 for at komme sig efter anæstesi.
BEMÆRK: Lad ikke et animal uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Sham Surgery.
- Udføre alle de ovennævnte procedurer, bortset fra indføringen af kanylen i aorta.
- Post-kirurgisk behandling.
- Placer rotte i et enkelt bur og ind i en inkubator ved 37 ° C, indtil næste morgen.
- Omkring 6 timer efter operationen, injicere 0,01 mg / kg buprenorphin subkutant til postoperativ analgesi. Gentag den næste morgen, hvis rotten viser tegn på ubehag.
BEMÆRK: De første 3 dage efter operationen, rotter tendens til at spise og drikke mindre (dette er især vigtigt, når chow eller drikkevand blandes med lægemidler). De fleste rotter viser normal adfærd 3 dage efter operationen. Hvis ikke, nøje overvåge. Vægttab over 15% i en uge anses unormal, og sådanne rotter bør aflives ved udvinding af det cirkulerende blodvolumen, mens under anæstesi.
BEMÆRK: I denne protokol, er dyret aflivet ved udvinding af det cirkulerende blodvolumen, mens under anæstesi.
- Sacrifice 1 dag efter operationen (MF8) for de tidlige cellulære og funktionelle responser på øget pulmonal blodgennemstrømning (f.eks gen opregulering eller tidlige transkriptionsfaktorer).
- Sacrifice 1 uge efter operationen (MF14) til en tidlig-stadie PAH vaskulær fænotype (mediale hypertrofi uden neointima læsioner).
- Sacrifice 2 uger efter operationen (MF21) for et avanceret-trins PAH vaskulær fænotype (markeret mediale hypertrofi og neointimal dannelse) med mild elevation i RVP og mPAP.
- Sacrifice 3 uger efter operationen (MF28) for en slutstadiet PAH vaskulær fænotype (markeret neointimal okklusion) og stærk stigning i RVP og mPAP. Kliniske tegn på højre ventrikel er almindelige i denne fase.
- Sacrifice efter dag 28 (MF-RVF) For PAH-associeret højre ventrikel (RVF), klinisk defineret som dyspnø, svær sløvhed, og vægttab (<10% i 1 uge). Afslut rotter, når en af disse tegn er til stede. Ofte, rotter udvikler disse symptomer mellem dag 28 og 35 og, hvis ubevogtet dør spontant under dette tidsinterval.
5. Højreklik Heart kateterisation
- Anæstesi.
- Fyld induktion kammer med 5% isofluran / 100% O2 (flow: 1 L / min) og placere rotten i kassen. Check for tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at udføre en hind tå knivspids. Afvej rotten.
- Barber og rengør halsen på højre ventrale side af rotten og for ekkokardiografi-protokollen, thorax og øvre del af maven.
- Placer rotte på ryggen på en varme måtte (37 ° C) og placere snuden i en udluftning maske / hætte til 2 - 3% isofluran / 100% O 2 (flow: 1 L / min). Den snude bør blive konfronteret mod forskeren.
- Ekkokardiografi protokol.
- Udfør ekkokardiografi ifølge protokollen beskrevet af Brittain et al. i JOVE 13.
- Kateterisation protokol.
BEMÆRK: Denne protokol anvender en stiv kanyle med en foruddannet spids bøjet 20 grader til at guide 15-cm silicium kateter med en bold 2 mm fra spidsen. En 20-G kanyle med sin åbning let bøjet indad anvendes til at indsætte kanylen i den højre halsvene (se listen af materialer). Rotter i enhver fase af PAH progression og styring kan anvendes i denne protokol.- Desinficer halsen med chlorid-hexidine. Lav en 1,5 cm snit med en # 10 skalpelblad i højre ventrale sideaf halsen, fra højre kraveben til mandibular knogle.
- Spred vævet med en saks. Ved hjælp af en pincet, træk forsigtigt vævet fra hinanden, indtil halsvenen vises. Dissekere membranerne omkring halsvenen bruge splinter pincet.
- Sætte spænding på halsvenen ved at placere en løs ligatur (5-0 sutur) rundt om karret. Øge spændingen og tape ligaturen på ventilation maske (figur 2A).
- Nedstrøms for indsættelsesstedet, placere en løs ligatur rundt om skibet for at stramme efter kanylen er in situ, for at forhindre lækage og tryktab.
- Ved hjælp af håndtagene af en pincet, let bøje spidsen af en 20-G kanyle med åbningen til indersiden til at gennemføre kanylen med kateteret.
- Indføre spidsen af 20-G nål ind i venen og hurtigt placere kanylen indeholder det inde i beholderen kateteret. Træk nålen, og luk derefter ligaturder blev udarbejdet i trin 5.3.4.
- Gennemføre kanylen indeholder kateteret i halsvenen. Spidsen af kanylen er i en 20 graders kurve (se trin 5.3.5). Manøvrere kanylen under nøglebenet og fremme lidt at indtaste det højre atrium (figur 2C).
- At indtaste den højre ventrikel, pege spidsen af kanylen til venstre, mod hjertet (figur 2D). På sengekanten monitor, bør en RV kurve pres synes, der matcher figur 2D.
- Når kurven RV trykket er konstant, nedskrive det systoliske og det diastoliske højre ventrikel tryk 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipulere spidsen af kanylen til venstre og opad. Fremføre kateteret inde i kanylen (fig 2E).
- Advance kateteret i de vigtigste lungepulsåren (PA). Ingen modstand skal mærkes, når passerer pulmonal ventil.
BEMÆRK: Når kateteret kommer ind i vigtigste pulmonal, at diastolic tryk vil stige. På sengekanten monitor, bør en PA-kurve pres synes, der matcher Figur 2E. - Da PA-kurve trykket er konstant, nedskrive det systoliske, diastoliske og betyde PA tryk 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Yderligere at fremme kateteret inde i kanylen indtil bolden ved spidsen af kateteret bliver kilet i en pulmonær arterie. Overhold kurven pres på sengekanten monitor drop og matche kilen trykket kurve i figur 2F.
- Når kurven kilen trykket er konstant, nedskrive det systoliske, diastoliske, og betyder kile pres.
- Træk kateteret langsomt og efterfølgende måle og nedskrive værdierne for sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, og dRVP2, som vises på sengekanten skærm.
- Når i RV, let trække sig tilbage kanylen og katetret for at måle den gennemsnitlige tryk i højre atrium (RAP). Kurven skal matche RAP kurve i figur 2A.
INGENTE: I denne protokol, er rotterne aflivet efter kateterisation protokol ved udvinding af det cirkulerende blodvolumen, mens under anæstesi.
6. Morfologi Vurdering og Morfometri
BEMÆRK: I denne protokol, er dyret aflivet ved udvinding af det cirkulerende blodvolumen, mens under anæstesi. Rotter i enhver fase af PAH progression og styring kan anvendes i denne protokol.
- Efter aflivning tegne lungerne ved at skære luftrøret ca. 5 mm over bronchiale bifurkationen og de fartøjer, der forbinder lungerne til hjertet. Sætte lungerne i koldt saltvand. Dissekerer venstre lunge. Skær venstre hovedbronchus ved forgreningen.
- Fyld en 50-ml sprøjte med 4% paraformaldehyd, vedhæfte et rør med en kanyle til sprøjten, og hænge sprøjten cirka en meter over arbejdsbordet. Monter kanylen i venstre hovedbronchus til passivt at fylde lungerne med paraformaldehyd.Håndtag paraformaldehyd med forsigtighed.
- Inkubér venstre lunge i paraformaldehyd i 48 timer.
- Dehydrere den venstre lunge ved at inkubere det fortløbende i 70% ethanol (1 h), 80% ethanol (1 h), 90% ethanol (1 h), 100% ethanol (3 h), xylol (2 h), og paraffin ( 2 timer).
- Indlejre venstre lunge i paraffin, med hilum af lungen overfor kassetten.
- Farv de paraffinindlejrede, 4-um lunge sektioner ved hjælp af en Verhoeff eller Elastica-van Gieson farvning, som pr producentens anvisninger 29. Sørg for, at elastiske tynde plader er godt differentierede (som i figur 3). Scan de farvede sektioner på 40X forstørrelse.
- Opdel lungen i 4 kvadranter. I hvert kvadrant, finde 10 fartøjer med en udvendig diameter <50 um (intra-acinære) og 10 skibe med en udvendig diameter> 50 um (pre-acinar). Tag et billede (2 x 40 billeder per lunge). Zoom ind tilfældigt op til 20x forstørrelse og fotografere hver fartøji dette synsfelt for at minimere selektionsbias.
- Udeluk fartøjer, der har længst / korteste forhold mellem diameter> 2, en ufuldstændig cirkulær form, eller et kollaps af mere end en fjerdedel af karvæggen.
BEMÆRK: Et eksempel på en udelukket fartøj er vist i figur 3b Gør hvert billede på samme forstørrelse (40X) og omfatter en skala bar. - Åbn ImageJ og det første billede. Tegn en lige linje på skalaen bar i billedet for at indstille skalaen via "Analyse" og "Set skala." For "kendt afstand," bruge værdien på billedet skala bar. Brug mikrometer (um) som enheden for længde. Indstil skalaen til den globale.
- Brug af "frihånd valg," tegner en linje på den indvendige kant af den luminale område (figur 3), og bruge "måle" (Crtl m) til at måle dette område. Derefter trække en linje omkring den ydre elastic lamina (figur 3) til at måle det samlede fartøj området.
- Beregn den luminale og udvendige diameter (
) ved brug af 
. - Beregn vægtykkelse hjælp
. - Beregn væg / lumen forholdet hjælp
. - Beregn okklusion scor med
. - Score skibet på muscularization (ingen, delvis eller total muscularization) (figur 3B).
BEMÆRK: Fartøjer med en dobbelt elastisk lamina i mere end halvdelen af omkredsen er defineret som fuldstændig muscularized. Fartøjer med en dobbelt elastisk lamina mindre end halvdelen af omkredsen er defineret som delvist muscularized. - Score skibet på tilstedeværelsen af en Neointima (ja eller nej) (figur 3C).
BEMÆRK: Fartøjer uden en klart defineret intern elastisk lamina kombineret med (ofte excentrisk) luminale okklusion er defineret som neointima læsioner.
) ved brug af 
. 
. 
. 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater er vist i figur 4. De præsenterede resultater viser karakteristika af MCT + FLOW i Lewis-rotter i følgende grupper: Kontrol (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), og MF-RVF ( n = 10). Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af envejs ANOVA med Bonferroni korrektion.
60 mg / kg MCT og øget pulmonær blodstrøm føre til en gennemsnitlig stigning i systolisk højre ventrikulære tryk (sRVP) (23 ± 6 til 56 ± 11 mmHg), systolisk lungearterietryk (sPAP) (20 ± 4 til 54,0 ± 10 mmHg ), og betyde lungepulsåren pres (mPAP) (16 ± 3-36 ± 4 mmHg) ved 28 dage (MF28). De forbliver lige så højt op til den fase, hvor højre ventrikel svigt udvikler (MF-RVF) (Figur 4). På de tidlige PAH stadier (MF8 og MF14), er ingen stigning i sRVP, sPAP, og mPAP overholdes. Diastolisk PAP og højre entrial trykstigning i sene faser, men ikke signifikant. Wedge pres ændrer ikke væsentligt i sygdomsprogression.
Den højre ventrikel-til-venstre ventrikel og septumdefekter vægt forholdet øges betydeligt fra MF14 til MF-RVF, indikerer højre ventrikel hypertrofi. Leverens våd-til-tør vægtforhold forøges betydeligt ved MF-RVF fase, hvilket indikerer liver ødem og kongestiv højre ventrikel svigt.
Muscularization af intra-acinære fartøjer <50 um stiger progressivt i løbet PAH progression. Fartøjer af denne størrelse normalt ikke har en muskuløs mediale lag i kontrol rotter. Hos MF14, næsten halvdelen af disse skibe (43 ± 17%) har en samlet muskuløs medier (som i figur 3B). På MF28 og MF-RVF er næsten hver arteriole muscularized (98,7 ± 2,5% og 100 ± 0%). Neointimal læsioner først skepå MF21, mens MF28 og MF-RVF, omkring 65% af alle arterioler har en neointimal lag (som i figur 3C). De arteriolære væg-til-lumen forholdet og okklusion scores både stige betydeligt fra MF14 til MF28 (henholdsvis 10,4 ± 3,9 til 71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) og 20,0 ± 2,8 til 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). De hæmodynamiske og histomorfologisk karakteristika PAH progression i MCT + FLOW i Wistar-rotter ligner 14.
Figur 1. Skematisk repræsentation aorto-Caval Shunt Surgery. A) Aorta spændes og fastspændt overlegen indføringsstedet. Vena cava komprimeres ringere end indføringsstedet. Nålen, bøjet ved 45 °, og med åbningen til det fri, er indsat i aorta i en 90 ° vinkel. B) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Right Heart kateterisation Procedure og Repræsentative Pressure Kurver. A) Den højre halsvene spændes med en ligatur og tapede på ventilation maske. Kateteret anbringes i halsvenen. B) En bedside monitor viser en højre ventrikel trykbølge. C) Den i kanylen er placeret i højre atrium efter indføring i den højre halsvene kateter. Herunder: en typisk tryk i højre atrium bølge. D) Den i kanylen placeret i den højre ventrikel kateteret. Herunder: en typisk ret ventricular trykbølge i slutstadiet PAH. E) Kateteret føres frem i kanylen for at indtaste de vigtigste lungepulsåren. Herunder: en typisk pulmonal arteriel trykbølge. F) Kateteret føres frem ind i de pulmonale arterier, indtil en kile trykbølge vises på skærmen. Herunder: en typisk pulmonal kile trykbølge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vaskulær Morfologi og Morfometri i Kontrol og PAH Rats. A) En normal, ikke-muscularized fartøj med en okklusion score på 3,7%. B) En helt muscularized arteriole med en okklusion score på 24,3%. C). En neointimal læsion med en okklusion score på 54,1%. D) E) Målingen af den samlede beholder og luminal område (i en beholder med en skematisk fremstilling af en neointimal læsion), herunder beregninger. Søjlerne repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative resultater af pulmonal Hæmodynamik og Vascular Morfologi / Morfometri. De statistiske analyser blev udført ved anvendelse af envejs ANOVA med Bonferroni-metode. Værdier er repræsenteret som middelværdi ± SEM. con: kontrol; MF (monocrotalin + flow); RVF: højre ventrikel svigt; s: systolisk; d: diastolisk; m: gennemsnit; RVP: højre ventrikel tryk; PAP: pulmonary arterietryk; RAP: tryk i højre atrium. RV: højre ventrikel; LV: venstre ventrikel; IVS: interventrikulær skillevæg; BW: kropsvægt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode beskriver kirurgiske procedure af en aorto-cava shunt hos rotter forbehandlet med MCT at skabe flow-induceret PAH og teknikker til at vurdere princippet hæmodynamiske og histopatologiske endepunkter, der kendetegner PAH og denne model.
Kritiske trin i protokollen og fejlfinding
Kirurgi og post-kirurgi. Under aorto-cava shunt operation, det mest kritiske trin er dissektion af aorta og vena cava. Membranerne, der omgiver aorta og vena cava bør dissekeret nok til at skabe 1) synligheden af aorta område, hvor nålen skal indsættes, og af positionen af nålen i vena cava efter indføring og 2) tilstrækkelig plads til klemme aorta over indføringsstedet. De samme membraner, men anvendes også til at foretage den aortiske blod gennem punkturstedet mellem begge beholdere (figur 1). Dissekere membranerne for meget vilforårsage shunten at lække. Vævslim kan løse lækage, men det kan så også sive ind shunten, at dens størrelse. Når limen er begrænset strømning gennem shunten eller en af fartøjer, kan limen fjernes forsigtigt, men brud på vena cava eller af membranerne, der udfører kan forekomme shunten. Størrelsen eller tilstrækkelige shunten kan estimeres ved sammenligning af farveforskellen og graden af turbulens af blodet i vena cava under kompression og dekompression af den proksimale aorta med en vatpind.
En 18-G kanyle har vist sig at skabe en tilstrækkelig shunt, der resulterer i en ensartet og reproducerbar form af PAH progression i Lewis (denne artikel) og Wistar (se Referencer 14) rotter og højre ventrikel volumen overload 15. En 18-G kanyle skabt det mest velafbalancerede shunt, markant forøgede pulmonal flow på den ene side og en lav postoperativ komplikation sats på den anden side. Den mest almindelige postoperative problem er vægttab. Vægttab op til 10% 1 uges forekommer i alle rotter efter operationen, formentlig som følge af lavere indtag de første par dage efter operationen. Rotter aflives, når vægttabet overstiger 15% i en uge, da det betragtes som en tegn på at være syg. Flydende chow kan forbedre fodring i den første uge efter operationen. Sjældne postoperative komplikationer er bagben paralyse og tarm iskæmi, hvilket også resultere i eutanasi. I alt mindre end 5% af rotterne måtte aflives postoperativt.
Kateterisation. Kritiske trin inden for kateterisation protokol starter med reguleringen af anæstesi. Dybden af anæstesi bør være så lille som muligt (1,5 - med 2% isofluran i denne protokol), som en stigning i anæstetisk dybde synes at falde højre ventrikel og pulmonale arterie tryk, især i rotter med højre ventrikel svigt. Målinger har en tendens til become upålidelige, når protokollen overstiger 20 min i varighed.
Den næste kritiske trin er manipulation af i RV og i vigtigste pulmonal kateteret. Dette kan være en udfordring. Gennemskylning af kateteret kan bidrage til kurve i udstrømningen tarmkanalen kateteret når spidsen sidder fast i RV trabekler. Manipulation selv kan forårsage RV dyskinesi, som viser uregelmæssige tryk kurver på sengen monitor. Indførelsen af kateteret i det højre hjertekammer og lungepulsåren bør køre problemfrit. Når spidsen sætter sig fast på det pulmonale ventil, der føles en modstand. Presning gennem denne modstand kan bevirke, at pulmonal ventil til brud, hvilket begrænser pålideligheden af efterfølgende målinger.
I den foreliggende protokol aflives rotter efter kateterisation procedure. I teorien imidlertid halsvenen og operationssåret kan lukkes, efter at kateteret er trukket ud, da dyr kan leve med kunden resterende venstre halsvene.
Morfometri. I vurderingen af vaskulære vægtykkelse og okklusion scoringer, det mest kritiske trin er at identificere den elastiske lag. Af erfaring, sandsynligheden for succes til dette formål er den største med en veldifferentieret Verhoeff eller Elastica-van Gieson farvning. Mens lumenet normalt kan skelnes let fra intima (at måle interne vaskulær område), skelnen af medierne fra adventitia kan kræve et nærmere kig (at måle den eksterne vaskulære område). Nogle protokoller foranstaltning intimal og medial tykkelse separat, definere intima som lag mellem hulrummet og den interne elastiske lamina, og medierne som lag mellem det indre og det ydre elastiske lamina. Dette er normalt mulig i den tidlige fase MCT + FLOW PAH. arterioler i fremskreden sygdom, især neointimal læsioner, kan dog vise flere elastisk lag og ofte mister integriteten af det elastiske lag ( Fordele og begrænsninger ved Tilføjelse Flow som en Trigger Anvendelsen af forhøjet pulmonalt blodgennemstrømning at skabe PAH i rotter har flere fordele, hvoraf de vigtigste er, at det er et kendt (patogen) fysiologisk trigger for sygdommen, som favoriserer oversættelse til humant PAH-CHD (Eisenmenger fysiologi), men også til andre former for PAH 9. Modellen giver mulighed for regulering af strømmen ved at variere størrelsen af nålen ved oprettelse AC-shunt. I humand PAH-CHD, lukning af shunten vil føre til tilbageførsel af PAH i den tidlige fase af sygdommen, men til progression af PAH i fremskreden sygdom stadier. Lukning af shunten in vivo ville tillade en at undersøge virkningen af fjernelse af aftrækkeren til forskellige tidspunkter af sygdomsprogression og dermed at undersøge mekanismerne i (ikke-) tilbageførsel af PAH. Desværre, på nuværende tidspunkt, shunt lukning ikke er mulig i den aktuelle model. Virkningerne af hæmodynamiske normalisering (fx fjernelse af overskydende flow og normaliseringen af lungepulsåren tryk) i rotter med flow-associeret PAH kan undersøges ved transplantation af de berørte venstre lunge til en recipient rotte med normal cirkulation. Det er tidligere blevet vist, at hæmodynamisk normalisering, i rotter ved lungetransplantation og i human PAH-CHD ved lukning af en hjerte-shunt, fører til regression af mediale hypertrofi i den tidlige fase PAH 21. Virkningerne af hæmodynamisk normalization i fremskredne stadier af eksperimentel flow-PAH er i øjeblikket ukendte. Betydning med Respekt til alternative modeller Den fælles-hit MCT model. En subkutan injektion af 60 mg / kg MCT er en enkel og effektiv måde at skabe en model for pulmonal hypertension hos rotter. MCT inducerer pulmonær arteriel endothelcellebeskadigelse, efterfulgt af hypertrofi af den muskulære lag af de pulmonale arterier 5. Selv om de nøjagtige mekanismer fortsat uklart, har forskellige pathways og vækstfaktorer er identificeret, som deltager i medial hypertrofi efter MCT. Farmaceutisk indgreb på disse veje har ofte held reduceret mediale hypertrofi og mPAP i MCT-rotter. Men da mediale hypertrofi er kendt for at have en naturlig tendens til at vende i mennesker 3 og er også blevet beskrevet at vende spontant i MCT-rotter 16, effekten af disse behandlingerbør vurderes kritisk. Den dobbelt-hit MCT + FLOW model. Tilsætningen af øget pulmonal blodgennemstrømning 7 dage efter MCT injektion kritisk ændrer (vaskulær) fænotype i en karakteristisk tidsafhængig måde. På MF14 (7 dage efter induktion af forøget flow), sædvanligvis ikke-muscularized fartøjer begynde at udvikle en muskulære mediale lag. Ved MF21, de mediale tykkelse stiger og de første neointimal læsioner forekomme. På MF28, har en neointimal lag udviklet i de fleste skibe. Mellem MF28 og MF35, de fleste rotter udvikler højre hjertesvigt og dø af dens følgevirkninger. Tidligere undersøgelser i MCT + Flow rotter har vist, at tilsætning af strømning til MCT fører til aktivering af specifikke klynger af gener. I nogle klynger, flow imod effekterne induceret af MCT; i andre, flow forbedret disse effekter, og en klynge indeholdt gener, der var specifikt opreguleret efter flow 17. En af disse flow-specifikke gener ertidlig vækst respons-1-gen 14 (Egr-1). Tidlig inhibering af Egr-1 resulterede i dæmpningen af PAH og neointimal dannelse i MCT + Flow rotter 18. Egr-1 var også forbundet med neointimal remodeling i human PAH (PAH-CHD og idiopatisk PAH) 19. Disse observationer føje til beviser for, at øget eller forstyrret pulmonal blodgennemstrømning er en vigtig udløsende faktor for neointimal dannelse. Den fælles-hit flow-eneste model. I rotter med en aorto-cava shunt uden MCT-injektion, pulmonal hypertension (mPAP> 25 mmHg) udvikler mellem 10 og 20 uger efter shunt induktion 20. På 20 uger, er det pulmonale vaskulære histologi domineret af mediale hypertrofi af de pre-acinære arterier og neo-muscularization af de intra-acinære arterioler. Selv om nogle neointimal læsioner også er blevet beskrevet i denne model 20, udviklingen af disse læsioner behov t o bekræftes og kvantificeres. Den Sugen-Hypoxi model. Et andet fælles model for PAH med neointimal læsioner er Sugen5416-Hypoxi (SuHx) rotte. Sugen5416 blokerer den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) receptor. Dette inducerer endotelcelle skader og en signaleringskaskade, som, i kombination med hypoxi, fremkalder endotel apoptose og proliferation 22. Efter Sugen5416 injektion rotten anbringes i en hypoxisk kammer i 4 uger, hvorpå PAH udvikler. Rotten derefter igen eksponeret for normoxi i 4 uger. Farmakologiske forbindelser, som er rettet mod endothelial apoptose-resistens eller signaleringsdata kaskader af TGF-B og BMP har vist potentialet til at vende de neointimal læsioner i denne model 23, 24, 25. En ny variant af SuHx model er den Sugen-pneumectomy model, som også resulterer i alvorlige PAH med neointima læsioner > 26. Men denne model er ikke fuldt karakteriseret endnu. En hidtil ukendt genetisk metode til at inducere PH i rotter involverer en mutation i BMP-receptor-2-genet, hvilket resulterer i signifikant muscularization (PH), men ingen neointimal-dannelse (PAH) 27. Sammenlignelige resultater er blevet rapporteret om antallet af neointimal læsioner og graden af luminale okklusion i slutstadiet af ubehandlet SuHx og MCT + Flow rotter 28. De væsentligste forskelle mellem de to modeller er, 1) at mPAP i MCT + Flow gradvist øges, mens der i SuHx har mPAP vist sig at falde gradvist efter re-eksponering for normoxi 28; 2) at MCT + Flow model kender et tidligt sygdomsstadie, kendetegnet ved mediale hypertrofi og endothelial dysfunktion; 3) at den tid det tager begge modeller til at nå en ende-fase, hvor højre ventrikel begynder at udvikle (4 uger i MCT + Flow, 8 uger i SuHx)ef "> 28 er anderledes, og 4) at Sugen5416 blander sig i en molekylær vejen (VEGF), hvis rolle i patogenesen af PAH er stadig uklart Dette kan hindre oversættelsen til humant PAH.. Fremtidige Programmer eller vejvisning De distinkte sygdom faser af MCT + Flow model tillader en 1) at teste mekanismerne i sygdomsprogression (humant væv i almindelighed er kun tilgængelig fra efter slagtning eller eksplantatpartikler procedurer) og 2) at teste interventioner i forskellige strategier. En forebyggende strategi kan blive indledt på opførelsen af shunten (MF7). En tidlig indgriben kan igangsættes på MF14. Dette kan være relevant som en behandlingsstrategi før shunt lukning hos børn med en medfødt hjerte-shunt og tilhørende PAH, der har udviklet sig i gråzonen mellem reversibel og irreversibel sygdom. Tilbageførsel strategier kan indledes på MF21 eller MF28. Senere iscenesætter både viser neointimal læsioner, en manifestation af slutstadiet PAH. </ P> Afslutningsvis tilsætning af øget pulmonal flow til MCT i rotter skaber en model af progressiv og svær PAH, der efterligner human sygdomsudvikling. Lige hjerte kateterisation og den kvalitative og kvantitative vurdering af det vaskulære histopatologi danner hjørnestenene i sygdomskarakterisering i denne og andre modeller for PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
