Introduction
Målet med denna metod är att skapa en reproducerbar modell för svår, flöde-inducerad pulmonell arteriell hypertension i råttor och att mäta dess princip hemodynamiska och histopatologiska ändpunkter.
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en kliniskt syndrom som omfattar en progressiv ökning av pulmonell vaskulär resistens som leder till höger kammare misslyckande och död. Inom ordnade sjukdomsspektrat av lunghypertonisjukdomar (PH), är PAH den allvarligaste formen och en som återstår utan ett botemedel en. Den underliggande arteriopati i PAH kännetecknas av en typisk form av vaskulär remodellering som ockluderar kärllumen. Muscularization av normala icke-muscularized fartyg och hypertrofi av mediala fartyget skiktet betraktas som fenomen tidiga sjukdoms i PAH, ses också i andra former av PH 2, och tros vara reversibel 3. Som PAH advances börjar intimala skiktet att renovera, så småningom bildar karakteristiska neointimala skador 2. Neointimal-typ pulmonell vaskulär ombyggnad är exklusiv för PAH och är för närvarande anses vara oåterkallelig 4.
Som PAH är en ovanlig sjukdom, avancerar i sin pathobiological förståelse och utveckling av nya terapier har förlitat sig tungt på djurmodeller. Den monocrotalin (MCT) modell i råttor är en enkel enda träff modell som har varit, och är fortfarande, används ofta. MCT är ett gift som orsakar skador på lung arteriolerna och regional inflammation 5. 60 mg / kg MCT leder till en ökning av det genomsnittliga pulmonella artärtrycket (mPAP), pulmonell vaskulär resistans (PVR) och höger kammare hypertrofi (RVH) efter 3 - 4 veckor 6. Den histomorphology kännetecknas av isolerade medial hypertrofi utan neointimala skador 5. MCTråttmodell representerar sålunda en moderat form av PH, och inte PAH, även om det är allmänt presenteras som den senare.
Hos barn med PAH associerad med en medfödd vänster till höger shunt (PAH-CHD), ökad pulmonell blodflödet betraktas som väsentliga trigger för utvecklingen av neointimala skador 7, 8, 9. Hos råttor, kan ökad pulmonell blodflöde induceras genom skapandet av en shunt mellan bukaorta och vena cava, en teknik som först beskrevs 1990 10. Alternativ för att skapa ökad lungflöde är genom ett ensidigt Pneumonectomy eller subclavia till lungartären anastomos 11. Konceptuella nackdelar med dessa modeller består av potentiell kompensatorisk tillväxt av den återstående lungan och adaptiv väg aktivering induceras av Pneumonectomy, eller iatrogen skada lungkärlen på grundtill lungartären anastomos, både förbryllande effekterna av ökad pulmonell blodflödet.
När ett aorto-caval shunt skapas och en ökning av pulmonala blodflödet induceras som en andra hit i MCT-behandlade råttor, karakteristiska neointimala lesioner uppträder, och en svår form av PAH och tillhörande höger kammarsvikt (RVF) utveckla 3 veckor efter den ökade flöde 12. Den hemodynamiska utvecklingen av PAH i denna modell kan bedömas in vivo genom ekokardiografi och högersidig kateterisering. Den vaskulära histomorphology, kärlets väggtjocklek, graden av arteriolar ocklusion, och parametrar för höger kammare inte är grundpelarna i ex vivo karakterisering av PAH.
Denna metod beskriver detaljerade protokoll för aorta-cava shunt (AC-shunt) kirurgi, rätt hjärtkateterisering och kvalitativ och kvantitativ bedömning av vaskulär histomorphology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden med djurförsök har godkänts av den nederländska centralkommittén för djurförsök och Animal Care kommittén vid University Medical Center Groningen (NL). Både Wistar och Lewis-råttor med vikter mellan 180 och 300 g användes.
1. Bostäder och Acklimatisering
- Efter ankomsten till den centrala djuranläggningen, hus råttor i grupper om fem per bur. Under en 7-dagars acklimatisering period, vänja råttorna till mänsklig hantering, men inte innehar någon experimentella procedurer.
2. Upprättande och Injektion av sterilt Monocrotalin
- För en ml 60 mg / ml monocrotalin (MCT) lösning, väg upp 60 mg av monocrotalin i en 2-ml rör. Lägg 700 mikroliter av 0,9% NaCl. Tillsätt 200 | il av 1 M HCl. Värm lösningen i rör under varmt rinnande kranvatten och vortexa det. Använd 6 N NaOH för att bringa pH till 7,0. Använd steril teknik för framställning av MCT för injektion i gnagare. Injicera 1 ml steril 60 mg / ml MCT lösning per kg subkutant i nacken (0,3 ml 60 mg / ml MCT för en 300-g råtta). OBS: Vi föredrar att inte använda mindre volymer på grund av det större chans att den injicerade dosen inte kommer att vara lämpligt.
3. Aorta-cava Shunt Kirurgi
- Anestesi.
- Fylla induktionskammare med 5% isofluran / 100% O2 (flöde: 1 liter / min) och placera råttan i kammaren. Kontrollera om tillräckligt djup anestesi genom att utföra en hind tå nypa. Väg råtta.
- Raka och rengör buken över ett område som är ca 8 cm lång och 3 cm bred. Placera råttan på rygg på en värmematta (37 ° C) som omfattas av en steril matta.
- Placera nosen i en ventilations mask / huva med 2-3% isofluran / 100% O2 (flöde: 1 liter / min). Kontrollera djupet av anestesi genom att utföra en hind tå nypa. Applicera ögonsalva att förhindra torrhet under narkos.
- shunt Surgery.
- Skrubba huden med klorid hexidine för desinfektion. Injicera 0,01 mg / kg buprenorfin subkutant för postoperativ smärtlindring.
- Använd sterila instrument för kirurgi. Gör ett snitt med en # 10 skalpellblad i buken på mittlinjen, med start 1 cm under membranet en som sträcker sig ned till strax ovanför genitalier.
- Lyft upp tarmen med en bomullspinne, täcka tarmarna i en steril, våt gasväv (0,9% NaCl), och placera dem på vänster sida av djuret.
- Använda bomullspinnar för att separera membranerna som fäster den abdominala aortan och vena cava inferior till de omgivande vävnaderna.
OBS: inte dissekera membranen mellan aorta och vena cava. - Genom att använda splitter pincett, ta bort perivaskulära aorta fett precis ovanför bifurkationen, bara på den högra sidan av aorta och endast på den plats där nålen kommer att införas.
- Använd tops att separera aorta och vena cava från 2 mm Supelägsen till den plats där nålen kommer att införas för att skapa utrymme för en Biemer klämma.
- På detta område, först placera en lös ligatur (5-0 sutur) runt aorta. Skapa spänning på ligatur genom att placera en Kocher klämma på den, och sedan placera Kocher överlägsen snittet (Figur 1A). Placera Biemer klämma bara överlägsen ligatur (Figur e 1A).
- Med hjälp av en bomullspinne, komprimera hålvenen så distalt som möjligt för att hindra flödet (Figur 1A). Böj en nål (18 G i detta protokoll) till en 45-graders vinkel, med öppningen pekar mot utsidan (Figur 1A).
- Med en vinkel på 90 grader, för in nålen i aortan, strax ovanför bifurkationen, med öppningen av nålen som pekar åt vänster (Figur 1A). Manipulera spetsen på nålen åt vänster och sätt in den i hålvenen.
OBS: nålspetsen bör nu vara visible i vena cava (Figur 1B). - Använda en andra bomullstopp för att skjuta återstående blodet i aortan ut från insättningsstället för att förhindra trombos. Torka området runt shunten med en steril gasbinda för att limmet att på lämpligt sätt hålla fast.
- Dra hela nålen ur aorta och omedelbart applicera en droppe av vävnads lim på punktionsstället i aorta. Se till att inte limma bomullstuss till vävnaden. Frikoppla aorta.
- Kontrollera shunten manuellt genom att dra och släppa ligaturen på aortan proximalt till shunten. Lossning ska färga hålvenen distalt shunten i klarrött och skapa turbulens på shunten platsen.
OBSERVERA: Skärpning kommer att vända blodet i hålvenen tillbaka till mörkröd. - Placera tarmarna tillbaka i djuret. Stäng muskellagret och huden med resorberbara 4-0 suturer. Ventilera djuret med 100% O 2 för att återhämta sig från anestesi.
OBS: Låt inte en animal obevakad tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
- Sham kirurgi.
- Utföra alla de ovan beskrivna procedurerna med undantag för införandet av nålen in i aorta.
- Post-kirurgisk vård.
- Placera råttan i en enda bur och in i en inkubator vid 37 ° C fram till nästa morgon.
- Omkring 6 h efter operationen, injicera 0,01 mg / kg buprenorfin subkutant för postoperativ analgesi. Upprepa nästa morgon om råttan visar tecken på obehag.
OBS: De första 3 dagar efter operationen, råttor tenderar att äta och dricka mindre (detta är särskilt viktigt när chow eller dricksvatten blandas med droger). De flesta råttor visar normalt beteende 3 dagar efter operationen. Om inte, noga övervaka. Viktminskning överstiger 15% i en vecka anses onormal, och sådana råttor bör avlivas genom extraktion av den cirkulerande blodvolymen under anestesi.
OBS: I detta protokoll, djuret avlivas genom extraktion av den cirkulerande blodvolymen under anestesi.
- Offra en dag efter operationen (MF8) för de tidiga cellulära och funktionella svar på ökat flöde lung blod (t.ex. gen uppreglering eller tidiga transkriptionsfaktorer).
- Offra en vecka efter operationen (MF14) för ett tidigt stadium PAH vaskulär fenotyp (medial hypertrofi utan neointimala lesioner).
- Offra 2 veckor efter operationen (MF21) för ett framskridet stadium PAH vaskulär fenotyp (markerad medial hypertrofi och neointimalbildning) med mild förhöjning i RVP och mPAP.
- Offra 3 veckor efter operationen (MF28) för en slutstadiet PAH vaskulär fenotyp (markerad neointimal ocklusion) och stark ökning av RVP och mPAP. Kliniska tecken på höger kammare fel är vanliga i detta skede.
- Offer efter dag 28 (MF-RVF) För PAH-associerade rätt kammarsvikt (RVF), kliniskt definieras som dyspné, svår trötthet och viktminskning (<10% i en vecka). Avsluta råttor när ett av dessa tecken är närvarande. Ofta råttor utvecklar dessa symtom mellan dagar 28 och 35 och, om de lämnas obevakade, dör spontant under detta tidsintervall.
5. Höger hjärtkateterisering
- Anestesi.
- Fylla induktionskammare med 5% isofluran / 100% O2 (flöde: 1 liter / min) och placera råttan i lådan. Kontrollera om tillräckligt djup anestesi genom att utföra en hind tå nypa. Väg råtta.
- Raka och rengör halsen på den högra ventrala sidan av råttan och för ekokardiografi protokollet, bröstkorgen och övre delen av buken.
- Placera råttan på rygg på en värmematta (37 ° C) och placera nosen i en ventilations mask / huva med 2-3% isofluran / 100% O2 (flöde: 1 liter / min). Nosen bör riktas mot det forskaren.
- Ekokardiografi protokoll.
- Utför ekokardiografi enligt protokollet beskrivet av Brittain et al. i JUPITER 13.
- Kateterisering protokoll.
OBS: Detta protokoll använder en styv kanyl med en förformad spets böjd 20 grader för att styra 15-cm kisel kateter med en boll 2 mm från spetsen. En 20-G nål med sin öppning lätt böjda på insidan används för att sätta in kanylen i den högra halsvenen (se listan över material). Råttor i någon fas av PAH progression och kontroll kan användas i detta protokoll.- Desinficera halsen med klorid hexidine. Gör en 1,5-cm snitt med en # 10 skalpellblad i högerventrala sidanav halsen, från höger nyckelbenet till underkäken ben.
- Sprida vävnad med hjälp av en sax. Med hjälp av pincett, försiktigt dra vävnaden isär tills halsvenen visas. Dissekera membranen runt halsvenen att använda splitter pincett.
- Sätt spänningen på halsvenen genom att placera en lös ligatur (5-0 sutur) runt fartyget. Öka spänningen och tejpa ligaturen på andningsmasken (Figur 2A).
- Nedströms om insättningssätet, placera en lös ligatur runt fartyget för att dra åt efter det att kanylen är på plats för att förhindra läckage och tryckförlust.
- Genom att använda handtagen på en tång, något böja spetsen på en 20 G-nål med öppningen till insidan för att genomföra kanylen med katetern.
- Införa spetsen på 20-G nål i en ven och snabbt placera kanylen innehållande katetern inuti kärlet. Dra ut nålen och stäng sedan ligatursom framställdes i steg 5.3.4.
- Genomföra kanylen innehållande katetern i halsvenen. Spetsen på kanylen befinner sig vid en 20-graders kurva (se steg 5.3.5). Manövrera kanylen under nyckelbenet och avancera lite att komma in i höger förmak (figur 2C).
- Att komma in i högra ventrikeln, pekar spetsen av kanylen till vänster, mot hjärtat (figur 2D). På sängplatsmonitorn, bör en RV tryckkurvan visas matchande figur 2D.
- När kurvan RV trycket är konstant, skriva ner det systoliska och diastoliska högra ventrikulära trycket 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipulera spetsen av kanylen till vänster och uppåt. Advance katetern inuti kanylen (Figur 2E).
- Advance katetern i huvudlungartären (PA). Inget motstånd ska kännas när de passerar lungventilen.
OBS: När katetern går huvudlungartären, diastolic tryck kommer att stiga. På sängplatsmonitorn, bör en PA tryckkurva visas matchande figur 2E. - När tryckkurvan PA är konstant, skriva ner det systoliska, diastoliska, och menar PA tryck 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Ytterligare påskynda katetern inuti kanylen tills bollen vid spetsen av katetern kilas fast i en lungartären. Beakta tryckkurvan på sängplatsmonitorn släpp och matcha wedge tryckkurvan i figur 2F den.
- När kurvan kilen trycket är konstant, skriva ner det systoliska, diastoliska, och menar kil tryck.
- Dra tillbaka katetern långsamt och därefter mäta och skriva ned värdena för sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 och dRVP2, som visas på sängplatsmonitorn.
- När i RV, något dra tillbaka kanylen och katetern för att mäta medeltryck i höger förmak (RAP). Kurvan ska matcha den RAP-kurvan i figur 2A.
NEJTE: I detta protokoll råttorna avlivas efter kateterisering protokollet genom extraktion av den cirkulerande blodvolymen under anestesi.
6. Morfologi Bedömning och morfometri
OBS: I detta protokoll, djuret avlivas genom extraktion av den cirkulerande blodvolymen under anestesi. Råttor i någon fas av PAH progression och kontroll kan användas i detta protokoll.
- Efter avlivning, ta ut lungorna genom att skära luftstrupen om 5 mm över bronkial bifurkationen och fartyg som ansluter lungorna till hjärtat. Sätta lungorna i kall saltlösning. Dissekera den vänstra lungan. Skär den vänstra huvud bronker vid förgreningen.
- Fyll en 50-ml spruta med 4% paraformaldehyd, fästa ett rör med en kanyl till sprutan, och hänga sprutan cirka en meter ovanför arbetsbordet. Montera kanylen i vänster huvud luftrör att passivt fylla lungorna med paraformaldehyd.Hantera paraformaldehyd med försiktighet.
- Inkubera den vänstra lungan i paraformaldehyd under 48 h.
- Dehydratisera den vänstra lungan genom att inkubera det i följd i 70% etanol (1 h), 80% etanol (1 h), 90% etanol (1 h), 100% etanol (3 h), xylol (2 h), och paraffin ( 2 h).
- Bädda in den vänstra lungan i paraffin, med hilum av lungan som vetter mot kassetten.
- Färga paraffininbäddade, 4-im lungsektioner med hjälp av en Verhoeff eller Elastica-van Gieson färgning enligt tillverkarens anvisningar 29. Se till den elastiska lamellerna är väl differentierad (som i figur 3). Skanna färgade snitt vid 40X förstoring.
- Dela upp lungan i 4 kvadranter. I varje kvadrant, hitta 10 fartyg med en ytterdiameter <50 pm (intra-acinar) och 10 fartyg med en ytterdiameter> 50 um (pre-körtel). Ta en bild (2 x 40 bilder per lunga). Zooma in slumpmässigt upp till 20x förstoring och fotografera varje fartyginom detta område i syfte att minimera selektionsfel.
- Utesluta fartyg som har en längsta / förhållande minsta diameter av> 2, ett ofullständigt cirkulär form, eller en kollaps av mer än en fjärdedel av kärlväggen.
OBS: Ett exempel på en utesluten kärl visas i figur 3b Gör varje bild på samma förstoring (40X) och inkludera en skala bar. - Öppen ImageJ och den första bilden. Rita en rak linje på skalan bar i bilden för att ställa in skala via "Analyse" och "Set skala." För "känd sträcka," använda värdet på bilden skala bar. Använd mikrometer (pm) som längdenhet. Ställ in skala till den globala.
- Använda "frihand val" rita en linje på den inre gränsen av den luminala området (Figur 3), och använda "mäta" (Ctrl m) för att mäta detta område. Sedan dra en linje runt den yttre elaic lamina (Figur 3) för att mäta den totala fartyget området.
- Beräkna den luminala och ytterdiameter (
) använder sig av 
. - Beräkna väggtjockleken med hjälp av
. - Beräkna väggen / lumen-kvoten med hjälp av
. - Beräkna ocklusion värdera med
. - Betyg fartyget på muscularization (nej, partiell eller total muscularization) (Figur 3B).
OBS: Fartyg med en dubbel elastisk lamina för mer än halva omkretsen definieras som totalt muscularized. Fartyg med en dubbel elastisk lamina mindre än halva omkretsen definieras som delvis muscularized. - Betyg fartyget på närvaron av en Neointima (ja eller nej) (Figur 3C).
OBS: Fartyg utan en tydlig inre elastisk lamina i kombination med (ofta excentrisk) luminala ocklusion definieras som neointimala skador.
) använder sig av 
. 
. 
. 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat presenteras i figur 4. De presenterade resultaten visar egenskaperna hos MCT + FLOW i Lewis-råttor i följande grupper: kontroll (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), och MF-RVF ( n = 10). Statistiska analyser utfördes med hjälp av envägs-ANOVA med Bonferroni korrigering.
60 mg / kg MCT och ökad pulmonell blodflödet leder till en medelökning av systoliskt högra ventrikulära trycket (sRVP) (23 ± 6 till 56 ± 11 mm Hg), systoliskt lungartärtryck (sPAP) (20 ± 4 till 54,0 ± 10 mmHg ), och genomsnittliga pulmonella artärtrycket (mPAP) (16 ± 3-36 ± 4 mm Hg) vid 28 dagar (MF28). De förblir lika högt upp på scenen när rätt kammarsvikt utvecklas (MF-RVF) (Figur 4). Vid de tidiga PAH stadierna (MF8 och MF14), är ingen ökning i sRVP, sPAP och mPAP observeras. Diastoliskt PAP och höger entrial tryckökning i de sena faserna, men inte signifikant. Wedge trycket inte ändras nämnvärt under sjukdomsförloppet.
Rätt kammar till vänster kammare och septala viktförhållande ökar betydligt från MF14 till MF-RVF, indikerar höger kammare hypertrofi. Leverns våt-till-torra viktförhållandet ökar signifikant vid MF-RVF stadiet, vilket indikerar leverödem och kongestiv högerkammar misslyckande.
Muscularization fartyg inom acinar <50 um ökar successivt under PAH progression. Fartyg av denna storlek normalt inte har en muskulös mediala skikt i kontrollråttor. På MF14, nästan hälften av dessa fartyg (43 ± 17%) har en total muskel media (som i figur 3B). På MF28 och MF-RVF, är nästan varje arteriole muscularized (98,7 ± 2,5% och 100 ± 0%). Neointimala lesioner uppträder förstpå MF21, medan MF28 och MF-RVF, ca 65% av alla arterioler har en neointimal skikt (som i figur 3C). De arteriolära vägg till lumen förhållande och ocklusion får både öka avsevärt från MF14 till MF28 (respektive 10,4 ± 3,9 till 71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) och 20,0 ± 2,8 till 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). De hemodynamiska och histomorphological egenskaper PAH progression i MCT + FLÖDE i Wistar-råttor liknar 14.
Figur 1. Schematisk representation av den aorto-caval Shunt Surgery. A) Aortan är spänd och fastspänd överlägsen insättningsstället. Vena cava komprimeras underlägsen insättningsstället. Nålen, böjda vid 45 ° och med öppningen till utsidan, är införd i aortan vid en 90 ° vinkel. B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Höger hjärtkateterisering Representativa Tryckkurvor ordningen och. A) Den högra halsvenen är spänd med en ligatur och tejpade på andningsmasken. Katetern är placerad i jugularvenen. B) En sängplatsmonitorn visar en högerkammar tryckvåg. C) Katetern inuti kanylen placerad i det högra förmaket efter införande in i den högra halsvenen. Nedan: en typisk höger förmak tryckvåg. D) Katetern inuti kanylen placerad i den högra ventrikeln. Nedan: en typisk rätt ventricular tryckvåg i slutstadiet PAH. E) Katetern fram i kanylen för att gå in i lungartären. Nedan: en typisk pulmonell arteriell tryckvåg. F) Katetern förs in lungartärerna tills en kil tryckvåg visas på bildskärmen. Nedan: en typisk lung kil tryckvåg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Vascular Morfologi och morfometri i Control and PAH råttor. A) En normal, icke-muscularized kärl med en ocklusion poäng av 3,7%. B) En helt muscularized arteriole med en ocklusion poäng på 24,3%. C). En neointimal lesion med en ocklusion poäng på 54,1%. D) E) Mätningen av den totala kärlet och luminal område (i ett kärl med en schematisk bild av en neointimal lesion), inklusive beräkningar. Staplarna representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat av lung Hemodynamik och Vascular morfologi / morfometri. De statistiska analyserna utfördes med användning av en-vägs ANOVA med Bonferroni korrigeringar. Värdena representeras som medelvärde ± SEM. con: kontroll; MF (monocrotalin + flöde); RVF: högerkammarsvikt; s: systoliskt; d: diastoliskt; m: medelvärde; RVP: högerkammartryck; PAP: pulmonary artärtryck; RAP: tryck i höger förmak. RV: höger kammare; LV: vänster kammare; IVS: skiljeväggen mellan kamrarna; BW: kroppsvikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod beskriver det kirurgiska ingreppet av en aorta-cava shunt hos råttor som förbehandlats med MCT för att skapa flödes inducerad PAH och tekniker för att bedöma princip hemodynamiska och histopatologiska slutpunkter som kännetecknar PAH och denna modell.
Kritiska steg i protokollet och felsökning
Kirurgi och post-kirurgi. Under aorto-caval shunt kirurgi, är det mest kritiska steget dissektionen av aorta och vena cava. Membranen som omger aortan och hålvenen bör dissekeras tillräckligt för att skapa en) god sikt av aorta område, där nålen ska föras in, och av positionen för nålen i hålvenen efter insättning och 2) tillräckligt med utrymme för att klämma aortan ovanför införingsstället. Samma membran, dock används också för att genomföra aorta blod genom punktionsstället mellan de båda fartygen (Figur 1). Dissekera membran för mycket kommerorsaka shunten att läcka. Vävnadslim kan lösa läckage, men det kan då också tränga in i shunt, att äventyra dess storlek. När limmet har begränsat flöde genom shunten eller någon av kärlen, kan limmet tas bort försiktigt, men brott i hålvenen eller membranen som bedriver shunten kan förekomma. Storleken eller lämplighet av shunten kan uppskattas genom jämförelse av färgskillnaden och graden av turbulens i blodet i hålvenen under komprimering och dekomprimering av den proximala aortan med en bomullspinne.
En 18-G nål har visat sig skapa en tillräcklig shunt som resulterar i en konsekvent och reproducerbar form av PAH progression i Lewis (denna artikel) och Wistar (se Referens 14) råttor och högerkammarvolymöverbelastning 15. En 18-G nål skapat den mest välbalanserade shunt, med kraftigt ökade lung flöde på ena sidan och en låg postoperativ komplikation räntan på andra sidan. Den vanligaste postkirurgisk problem är viktminskning. Viktminskning upp till 10% i en vecka förekommer i alla råttor efter operationen, förmodligen på grund av lägre intag de första dagarna efter operationen. Råttor avlivades när vikten förlusten överstiger 15% i en vecka, eftersom detta anses vara ett tecken på att vara sjuk. Flytande chow kan förbättra utfodring i den första veckan efter operationen. Sällsynta postoperativa komplikationer är bakben förlamning och tarm ischemi, vilket också resulterar i dödshjälp. Totalt, hade mindre än 5% av råttorna som skall avlivas efter operationen.
Kateterisering. Kritiska steg under kateterisering protokollet börjar med regleringen av anestesi. Djupet av anestesi bör vara så liten som möjligt (1,5-2% isofluran i detta protokoll), som en ökning av anestesidjups tycks minska höger kammare och lungartärtryck, särskilt i råttor med höger kammare misslyckande. Mätningar har en tendens att become otillförlitliga när protokollet överstiger 20 minuter i längd.
Nästa kritiska steget är manipulation av katetern i RV och i huvudlungartären. Detta kan vara en utmaning. Spolning av katetern kan hjälpa till att kurvan katetern i utflödesområdet när spetsen har fastnat i RV: s trabeculae. Manipulation själv kan orsaka RV dyskinesi, som visar oregelbundna tryckkurvor på sängplatsmonitorn. Införandet av katetern i den högra ventrikeln och lungartären arbetar jämnt. När spetsen fastnar vid pulmonell ventilen, är ett motstånd kändes. Pressning genom detta motstånd kan orsaka lungventilen till bristning, vilket begränsar tillförlitligheten av efterföljande mätningar.
I det nuvarande protokollet, avlivas råttorna efter kateterisering förfarande. I teorin, men halsvenen och operationssåret kan stängas efter katetern dras ut, eftersom djuren kan leva med endastde återstående vänstra halsvenen.
Morfometri. Vid bedömningen av kärlväggtjocklek och ocklusion poäng, är det mest kritiska steget för att identifiera den elastiska lameller. Av erfarenhet, är sannolikheten för framgång för detta ändamål störst med en väl differentierad Verhoeff eller Elastica-van Gieson färgning. Medan lumen vanligtvis kan urskiljas lätt från intima (för att mäta inre kärlområdet), skillnaden av media från adventitia kan kräva en närmare titt (för att mäta yttre kärlområdet). Några protokoll åtgärd intimal och medial tjocklek separat, definierar intima som skiktet mellan lumen och interna elastiska lamina och media som skiktet mellan den inre och yttre elastiska lamina. Detta är oftast möjligt i ett tidigt skede MCT + FLOW PAH. Dock kan arterioler i avancerad sjukdom, i synnerhet neointimala skador, visar flera elastiska lameller och ofta förlorar integritet elastiska lameller ( Fördelar och begränsningar Lägga till Flow som en utlösare Användningen av ökat flöde pulmonell blod att skapa PAH i råttor har flera fördelar, den mest framträdande är att det är ett känt (patho-) fysiologisk utlösare för sjukdomen, vilket gynnar översättning för människors PAH-CHD (Eisenmenger fysiologi), men också till andra former av PAH 9. Modellen gör det möjligt att reglera flödet genom att variera storleken på nålen när du skapar AC-shunten. i human PAH-CHD, kommer stängning av shunten leda till återföring av PAH i den tidiga fasen av sjukdomen, men till progression av PAH i avancerade stadier sjukdoms. Stängning av shunten in vivo skulle tillåta en att undersöka effekten av avlägsnande av avtryckaren vid olika sjukdomsprogression tid och på så sätt för att undersöka mekanismerna för (icke-) återföring av PAH. Tyvärr, för närvarande, är shunt stängning inte är möjligt i den aktuella modellen. Effekterna av hemodynamiska normalisering (t.ex. avlägsnande av flödes och normaliseringen av lungartärtrycket) hos råttor med flödes associerad PAH kan undersökas genom transplantation av de drabbade vänstra lungan i en mottagande råtta med normal cirkulation. Det har tidigare visats att hemodynamiska normalisering, i råttor efter lungtransplantation och i human PAH-CHD genom stängning av en hjärt shunt leder till regression av mediala hypertrofi i tidig PAH 21. Effekterna av hemodynamiska normalsering i avancerade stadier av experimentella flödes PAH är för närvarande okända. Betydelse med hänsyn till alternativa modeller MCT modell enda träff. En subkutan injektion av 60 mg / kg MCT är ett enkelt och effektivt sätt att skapa en modell för pulmonell hypertension hos råttor. MCT inducerar pulmonell arteriell endotelceller skada, följt av hypertrofi av muskelskikt lungartärerna 5. Även om de exakta mekanismerna är oklara, har olika vägar och tillväxtfaktorer har identifierats som deltar i medial hypertrofi efter MCT. Farmaceutisk intervention på dessa vägar har ofta framgångsrikt minskat medial hypertrofi och mPAP i MCT-råttor. Eftersom medial hypertrofi är känd för att ha en naturlig tendens att vända på människor 3 och har också beskrivits för att vända spontant i MCT-råttor 16, effekten av dessa behandlingarbör bedömas kritiskt. Den dubbla drabbade MCT + FLOW modell. Tillsatsen av ökat pulmonellt blodflöde 7 dagar efter MCT injektion förändrar kritiskt den (vaskulär) fenotyp i en karakteristisk tidsberoende sätt. På MF14 (7 dagar efter induktion av ökat flöde), normalt icke-muscularized fartyg börja utveckla en muskulös medial skikt. Vid MF21, den mediala tjocklek ökar och de första neointimala skador uppstår. Vid MF28, har en neointimal skikt utvecklats i de flesta fartyg. Mellan MF28 och MF35, de flesta råttor utveckla högersidig hjärtsvikt och dör av dess följdtillstånd. Tidigare studier i MCT + Flödes råttor har visat att tillsatsen av flödet till MCT leder till aktivering av specifika kluster av gener. I vissa kluster motsatte flöde effekterna inducerade av MCT; i andra flöde förstärkt dessa effekter, och ett kluster innehöll gener som var specifikt uppregleras efter flöde 17. En av dessa flödesspecifika gener är dentidig tillväxtrespons-1-gen 14 (Egr-1). Tidigt hämning av Egr-1 resulterade i dämpningen av PAH och neointimal bildning i MCT + Flödes råttor 18. Egr-1 var också förenad med neointimal ombyggnad i human PAH (PAH-CHD och idiopatisk PAH) 19. Dessa observationer lägga till bevis för att ökad eller störd lung blodflödet är en viktig utlösande faktor för neointimal bildning. modellen enda drabbade flödes bara. Hos råttor med en aorta-cava shunt utan MCT-injektion, pulmonell hypertension (mPAP> 25 mmHg) utvecklas mellan 10 och 20 veckor efter shunt induktion 20. Vid 20 veckor, är lungkärlens histologi som domineras av medial hypertrofi av pre-körtel artärer och neo-muscularization av intra-körtel arterioler. Även om vissa neointimala skador har också beskrivits i denna modell 20, utvecklingen av dessa skador behöver t o bekräftas och kvantifieras. modellen Sugen-hypoxi. En annan vanlig modell för PAH med neointimala skador är Sugen5416-hypoxi (SuHx) råtta. Sugen5416 blockerar vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor. Detta inducerar endotelial cellskador och en signalkaskad som, i kombination med hypoxi, väcker endotelial apoptos och proliferation 22. Efter Sugen5416 injektion, är råttan placeras i en hypoxisk kammare under 4 veckor, på vilken PAH utvecklar. Råttan sedan åter utsättas för normoxi i 4 veckor. Farmakologiska föreningar som riktar endothelial apoptos-motstånd eller signaleringskaskader av TGF-B och BMP har visat potential att vända neointimala skador i denna modell 23, 24, 25. En ny variant av SuHx modellen är Sugen-pneumectomy modell, vilket också resulterar i svår PAH med neointimala lesioner > 26. Men denna modell har inte karakteriserats fullständigt ännu. En ny genetisk metod för att inducera PH hos råttor involverar en mutation i BMP-receptor-2-genen, vilket resulterar i betydande muscularization (PH) men ingen neointimalbildning (PAH) 27. Jämförbara resultat har rapporterats när det gäller antalet neointimala lesioner och graden av luminala ocklusion i slutstadiet av obehandlad SuHx och MCT + Flow råttor 28. De viktigaste skillnaderna mellan de båda modellerna är 1) att mPAP i MCT + Flow ökar progressivt, medan SuHx har mPAP visats minska gradvis efter återexponering normoxi 28; 2) att MCT + Flow modell vet ett tidigt sjukdomsstadium kännetecknas av medial hypertrofi och endoteldysfunktion; 3) att den tid det tar båda modellerna för att nå en slutstadiet där höger kammare misslyckande börjar utvecklas (4 veckor i MCT + Flow, 8 veckor i SuHx)EF "> 28 är annorlunda, och 4) att Sugen5416 stör i en molekylär väg (VEGF), vars roll i patogenesen av PAH är fortfarande oklart Detta kan hindra översättningen för människors PAH.. Framtida Program eller Vägbeskrivning De olika faser av MCT + Flow sjukdomsmodell tillåter en 1) för att testa mekanismerna för sjukdomsprogression (mänsklig vävnad i allmänhet är endast tillgänglig från obduktion eller Explantation förfaranden) och 2) att testa interventioner i olika strategier. En förebyggande strategi skulle kunna inledas vid byggandet av shunten (MF7). En tidig intervention kan initieras på MF14. Detta kan vara relevant som en behandlingsstrategi före shunt stängning hos barn med en medfödd hjärt shunt och tillhörande PAH som kommit in i gråzonen mellan reversibla och irreversibla sjukdom. Återföring strategier kan inledas på MF21 eller MF28. Senare skeden både visar neointimala skador, en manifestation av slutstadiet PAH. </ P> Sammanfattningsvis, tillsättning av ökad lungflöde till MCT hos råttor skapar en modell av progressiv och svår PAH som efterliknar utveckling av mänskliga sjukdomar. Rätt hjärtkateterisering och kvalitativ och kvantitativ bedömning av den vaskulära histopatologi bildar hörnstenarna i karakterisering sjukdomen i denna och andra modeller för PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
