Introduction
Bu yöntemin amacı, farelerde şiddetli akım kaynaklı pulmoner arteriyel hipertansiyon için tekrarlanabilir bir model oluşturmak için ve prensip hemodinamik ve histopatolojik bitiş noktalarını ölçmektir.
Pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH), sağ ventrikül yetmezliği ve ölüme yol açan pulmoner vasküler dirençte ilerleyici artış kapsayan bir klinik sendromdur. Pulmoner hipertansif hastalıklar (PH) superordinate hastalık spektrumu içinde, PAH tam iyileşme 1 olmadan kalır en ağır formu ve biridir. PAH altta yatan arteriopatidir damar lümeni tıkar vasküler yeniden tipik bir formu ile karakterizedir. Normal olmayan muskularize damarlar ve medial damar tabakasının hipertrofisi Muskularizasyon PAH erken hastalık fenomen olarak kabul edilmektedir, aynı zamanda PH 2 diğer şekillerde görülür ve 3 geri dönüşümlü olduğu düşünülmektedir. PAH a olarakdvances, intimal tabaka sonunda karakteristik neointimal lezyonlar 2 şekillendirme, pişmanlık başlar. Neointimal tipi pulmoner vasküler yeniden şekillenme PAH özeldir ve şu anda 4 geri dönüşümsüz olarak kabul edilir.
PAH nadir bir hastalık olduğu için, onun biyopatolojik anlama gelişmeler ve yeni tedavilerin geliştirilmesi hayvan modellerinde dayanmıştır var. Sıçanlarda monocrotalin (MCT) model olmuştur basit bir tek vuruş modeli ve hala sık kullanılır. MCT pulmoner arteriol ve bölgesel inflamasyon 5 yaralanmasına neden olan bir zehirdir. / Kg MCT 60 mg ortalama pulmoner arter basıncında (mPAP), pulmoner vasküler rezistans (PVR) bir artışa yol açar ve 3 sonrası sağ ventrikül hipertrofisi (SVH) - 4 hafta 6. Histomorphology neointimal lezyonlar 5 olmadan izole medial hipertrofi ile karakterize edilir. MCTyaygın ikinci olarak sunulan rağmen sıçan modeli böylece ılımlı bir PH şeklini değil, PAH temsil eder.
Konjenital sol-sağ şant (PAH-KKH) ile bağlantılı PAH çocuklarda pulmoner kan akımı neointimal lezyonlar 7, 8, 9 gelişmesi için gerekli tetikleyicisi olarak kabul edilir arttı. Sıçanlarda, artan pulmoner kan akışı abdominal aorta ve vena kava, ilk olarak 1990 10'da tarif edilen bir teknik arasında bir şönt oluşturulması ile indüklenebilir. Artmış pulmoner akım oluşturmak için Alternatifler tek taraflı pnömonektomi veya pulmoner arter anastomoz 11 subklavyan tarafından uygulanır. Bu modellerin kavramsal dezavantajları nedeniyle ya da pulmoner vasküler iyatrojenik yaralanma pnömonektomi tarafından uyarılan kalan akciğer ve adaptif yolu aktivasyonu potansiyel telafi büyümesi oluşurpulmoner arter anastomoz, hem artmış pulmoner kan akımının etkilerini karıştırıcı.
Bir aorta-kaval şant oluşturulur ve MCT ile tedavi edilen sıçanlarda ikinci vuruşu olarak uyarılan pulmoner kan akımını artar, karakteristik neointimal lezyonlar ortaya çıkar, ve artan sonra PAH ağır formu ve ilgili sağ ventrikül yetmezliği (RVF) 3 hafta geliştirmek 12 akar. Bu modelde PAH hemodinamik ilerlemesi ekokardiyografi ve sağ kalp kateterizasyonu in vivo değerlendirilebilir. Sağ kalp yetmezliği için damar histomorphology, damar duvar kalınlığı, arterioler tıkanıklığının derecesi ve parametreler PAH ex vivo karakterizasyonu ayağı oluşturur.
Bu yöntem aorta-kaval şant (AC-şant) ameliyatı için ayrıntılı protokoller, sağ kalp kateterizasyonu ve damar histomorphology nitel ve nicel değerlendirmesini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri Prosedürleri Hayvan Deneyleri için Hollanda Merkez Komitesi ve Üniversite Tıp Merkezi Groningen Hayvan Bakım Komitesi (NL) tarafından onaylanmıştır. 180 ve 300 g arasında ağırlıkları iki Wistar ve Lewis sıçanları kullanılmıştır.
1. Konut ve Aklimatizasyon
- kafes başına 5 gruplar halinde merkez hayvan tesis, ev sıçan geldikten sonra. 7 günlük bir iklimlendirme döneminde, insan kullanımdan sıçan alıştırmak, ancak herhangi bir deneysel prosedürler gerçekleştirmeyin.
2. Hazırlık Steril Monocrotalin enjeksiyonu
- 60 mg / ml monocrotalin (MCT) solüsyonu 1 mL için, 2 ml bir tüp içinde monocrotalin 60 mg ağırlığında. % 0.9 NaCl 700 uL ekleyin. 1 M HCI, 200 uL ekleyin. Sıcak çalışan musluk suyu ve vorteks o altında tüp içinde çözüm ısıtın. 7.0 doğru pH'ı getirmek için 6 N NaOH kullanın. kemirgenler içine enjeksiyon için MCT hazırlanması için steril tekniği kullanın. (300 g bir fare için 60 mg / ml MCT 0.3 mL) boyun kg deri altından her steril 60 mg / ml MCT çözeltisi 1 ml enjekte edilir. NOT: Bu yazıda enjekte doz uygun olmayacağını büyük şans daha küçük hacimli kullanmak için değil tercih ederim.
3. Aort-kaval Şant Cerrahisi
- Anestezi.
- (Akış: / dak 1 L)% 5 izofluran /% 100 O 2 ile indüksiyon odasına doldurun ve odasında sıçan yerleştirin. Bir arka ayak tutam yaparak anestezi yeterli derinlikte olup olmadığını kontrol edin. sıçan tartılır.
- Tıraş ve yaklaşık 8 cm uzunluğunda ve 3 cm genişliğinde bir alana karın temizleyin. steril bir mat kaplı bir ısı mat (37 ° C) sırtında sıçan yerleştirin.
- % 3 izofluran /% 100 O 2 (: / dk 1 L akışı) - 2 ile solunum maskesi / kaputu burun yerleştirin. Bir arka ayak tutam yaparak anestezi derinliğini kontrol edin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.
- şant Surgery.
- dezenfeksiyon için klorür-heksidinli cilt fırçalayın. kg buprenorfin subkutan post-operatif analjezi için 0.01 mg / enjekte edilir.
- Ameliyat için steril aletler kullanın. Bir sadece genital üstünde aşağı uzanan diyafram altında 1 cm başlayarak, orta hat karın bir 10. neşter bıçağı ile bir kesi yapmak.
- steril, ıslak gazlı bez (% 0.9 NaCl) içinde bağırsakları kapak, bir pamuklu çubukla bağırsak yukarı kaldırın ve hayvanın sol tarafına koyun.
- abdominal aorta ve çevre dokulara inferior vena kava takmak membranlar ayırmak için pamuklu çubuklarla kullanın.
NOT: aort ve vena kava arasındaki membranlar incelemek etmeyin. - splinter forseps kullanarak, sadece aort sağ tarafında ve tek iğne eklenecek sitede, sadece çatallanma üstünde perivasküler aort yağ çıkarmak.
- 2 mm supe gelen aort ve vena kava ayırmak için pamuklu çubuklarla kullanınİğne bir Biemer kelepçesi için alan yaratmak amacıyla eklenir siteye Rior.
- Bu alanda, ilk aort etrafında gevşek bir bitişik harfleri (5-0 dikiş) yerleştirin. Kesi (Şekil 1A) için Kocher üstün koyun sonra üzerine bir Kocher kelepçe koyarak dikilen gerginlik oluşturun ve. Biemer ligature (Figür e 1A) sadece üstün kelepçe yerleştirin.
- Bir pamuklu çubuk kullanarak, akış (Şekil 1A) engel olarak distale mümkün olduğunca vena kava sıkıştırmak. Bend dışında (Şekil 1A) doğru menfez işaret ile 45 derecelik bir açı içine iğne (Bu protokol 18 G).
- 90 derecelik bir açı ile, sol (Şekil 1A) iğne işaret deliği ile sadece çatallanma üzerinde aorta iğneyi. sola iğne ucu işleyin ve vena kava takın.
NOT: İğne ucu şimdi olmalıdır visivena kava (Şekil 1B) ble. - trombozu önlemek için ekleme siteden aort kalan kan itmek için ikinci bir pamuklu çubuk kullanın. tutkal yeterince sopa için sırayla bir steril gazlı bez ile şant çevresini kurutun.
- Aort dışarı tüm iğne çekin ve hemen aorta ponksiyon üzerine doku yapıştırıcısı bir damla uygulayın. dokuya pamuklu çubukla tutkal değil emin olun. aorta çözülme.
- çekerek ve şantın aort proksimalinde bitişik harfleri serbest elle şant doğrulayın. Gevşeme parlak kırmızı şant vena kava distalinden renk ve şönt yerinde türbülans oluşturmanız gerekir.
NOT: Sıkma geri koyu kırmızı vena kava kan dönecek. - geri hayvanda bağırsak yerleştirin. emilebilir 4-0 sütür ile kas tabakası ve cilt kapatın. Anestezi kurtarmak için% 100 O 2 ile hayvan havalandırınız.
NOT: Bir ani bırakmayınsternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar mal katılımsız.
- Sham Cerrahi.
- Aort içine iğne sokulması haricinde yukarıdaki işlemlerin tümünü gerçekleştirebilir.
- Ameliyat sonrası bakım.
- Tek bir kafes ve ertesi sabaha kadar 37 ° C'deki bir kuluçka makinesi içine sıçan yerleştirin.
- Ameliyat sonrası 6 saat civarında, post-operatif analjezi için kg buprenorfin subkutan / 0.01 mg enjekte edilir. Sıçan rahatsızlık belirtileri gösterir, eğer ertesi sabah tekrarlayın.
Not: Ameliyattan sonraki ilk 3 gün sonra, sıçanlar (yemi ya da içme suyu ilaçlar ile karıştırılmaktadır, bu özellikle önemlidir) ve yemek az içki eğilimindedir. Çoğu sıçanlar 3 gün ameliyattan sonra normal davranışı göstermektedir. Değilse, yakından izleyin. 1 hafta içinde% 15 aşan Zayıflama, anormal olarak kabul edilir ve bu fareler anestezi altında iken kan hacminin ekstre ötenazi edilmelidir.
NOT: Bu protokol, hayvan anestezi altında iken dolaşan kan hacminin çıkarılması ile ötenazi.
- Pulmoner kan akımının artırılması erken hücresel ve fonksiyonel yanıtları (örneğin, gen up-regülasyonu veya erken transkripsiyon faktörleri) için cerrahi (MF8) 1 gün sonra Kurban.
- Bir erken evre PAH vasküler fenotip (neointimal lezyonlar olmadan medial hipertrofi) için cerrahi (MF14) 1 hafta sonra Kurban.
- RVP ve mPAP hafif yükselti ile bir ileri evre PAH vasküler fenotip için cerrahi (MF21) (işaretli medial hipertrofi ve neointimal oluşumu) 2 hafta sonra Kurban.
- RVP ve mPAP bir son dönem PAH vasküler fenotip için cerrahi (MF28) (işaretli neointimal tıkanıklığı) ve güçlü yükseklik 3 hafta sonra Kurban. sağ ventrikül yetmezliği klinik belirtileri, bu aşamada yaygındır.
- gün 28 (MF-SVY'nin sonra Kurban) Klinik nefes darlığı, şiddetli uyuşukluk ve kilo kaybı (<1 hafta içinde% 10) olarak tanımlanan PAH ilişkili sağ ventrikül yetmezliği (RVF), için. Bu işaretlerden biri varken sıçan sonlandırın. Sık sık, fareler gün 28 ve 35 arasında bu belirtiler geliştirmek, korumasız bırakılırsa, bu zaman aralığında kendiliğinden ölür.
5. Sağ Kalp kateterizasyonu
- Anestezi.
- (Akış: / dak 1 L)% 5 izofluran /% 100 O 2 ile indüksiyon odasına doldurun ve kutuya sıçan yerleştirin. Bir arka ayak tutam yaparak anestezi yeterli derinlikte olup olmadığını kontrol edin. sıçan tartılır.
- ekokardiyografi protokolü, toraks ve üst batın, Tıraş ve sıçan sağ ventral tarafında boyun temizlemek ve.
- Bir ısı mat (37 ° C) sırtında sıçan yerleştirin ve 2 ile bir solunum maskesi / kaputu burun yerleştirin -% 3 izofluran /% 100 O 2 (akış: / dak 1 L). burun araştırmacı doğru karşıya edilmelidir.
- Ekokardiyografi protokolü.
- Brittain ve arkadaşları tarafından tarif edilen protokole göre ekokardiyografi gerçekleştirin. Jüpiter 13.
- Kateterizasyon protokolü.
NOT: Bu protokol önceden ucu ile sert bir kanül ucu bir top 2 mm 15 cm silikon kateter rehberlik 20 derece bükülmüş kullanır. Içine hafifçe bükülmüş olan deliği ile 20-G iğne sağ juguler damara kanül eklemek için kullanılır (malzeme listesine bakınız). PAH ilerlemesi ve kontrol herhangi bir aşamasında Sıçanlar Bu protokolde kullanılabilir.- klorür-heksidinli boyun dezenfekte edin. Sağ-ventral tarafta bir 10. neşter bıçağı ile 1.5 cm kesi yapmakBoyun, sağ köprücük kemiği üzerinde mandibular kemik.
- makas kullanılarak doku yayıldı. boyun damarı görünene kadar cımbız kullanarak, yavaşça birbirinden doku çekin. kıymık forseps kullanarak damar şahdamarına etrafındaki zarların parçalara ayır.
- Geminin etrafında gevşek bitişik harfleri (5-0 dikiş) koyarak juguler ven üzerindeki gerilimi koyun. Gerginliği artırmak ve havalandırma maskesi (Şekil 2A) üzerine bitişik harfleri bantlayın.
- Ekleme bölgesinden akım-aşağı kanül sızıntı ve basınç kaybını önlemek için, yerinde sonra sıkıştırmak için teknenin etrafına gevşek bitişik harfleri yerleştirin.
- Bir forseps kolları kullanarak, hafifçe kateter ile kanül yapmak için iç deliği ile 20 G iğne ucu bükün.
- damara 20-G iğne ucu tanıtmak ve hızlı bir şekilde geminin içindeki kateter içeren kanül yerleştirin. iğne çekin ve ardından bitişik harfleri kapatınBu aşama 5.3.4 hazırlandı.
- şah damara kateter içeren kanül yürütün. kanül ucu 20 derecelik eğri olan (adım 5.3.5 bakınız). Köprücük kemiği altında kanül Manevra ve sağ atrium (Şekil 2C) girmek için biraz ilerlemek.
- Sağ ventrikül girmek için, kalp (Şekil 2B) doğru sola kanül ucu, işaret. Başucu monitöründe, bir rv basınç eğrisi Şekil 2D eşleşen görünmelidir.
- RV basınç eğrisi sabit olduğunda, sistolik ve diyastolik sağ ventrikül basıncı 1 yazınız (sRVP1 / dRVP1).
- sol ve yukarı kanül ucu işleyin. Kanül (Şekil 2E) içinde kateteri ilerletin.
- Ana pulmoner arter (PA) içine kateteri ilerletin. Pulmoner vana geçerken hiçbir direnç hissettim edilmelidir.
NOT: Kateter ana pulmoner arter girdiğinde, diastolic basınç artacak. Başucu monitörde, bir PA basınç eğrisi Şekil 2E eşleşen görünmelidir. - PA basınç eğrisi sabit olduğunda, sistolik, diyastolik yazmak ve PA basıncı 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1) anlamına gelir.
- kateterin ucundaki topu pulmoner arter sıkışmış alır kadar daha fazla kanül içinde kateteri ilerlemek. Başucu monitör damla basınç eğrisi gözlemlemek ve Şekil 2F kama basıncı eğrisini maç.
- wedge basıncı eğrisi sabit olduğunda, sistolik, diyastolik yazmak ve kama basıncı anlamına gelir.
- Yavaş yavaş ve daha sonra kateter geri çekin ölçmek ve başucu monitörünüzde görüntülenen, sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 ve dRVP2 değerlerini yazınız.
- RV, biraz ölçmek için kanül ve kateter geri çekin sağ atriyal basıncı (RAP) anlamına gelir. Eğri Şekil 2A RAP eğrisini eşleşmesi gerekir.
YOK HAYIRTE: Bu protokol, sıçanlar anestezi altında iken dolaşan kan hacminin çıkarılması ile kateterizasyon protokolünden sonra ötenazi.
6. Morfoloji Değerlendirme ve Morfometri
NOT: Bu protokol, hayvan anestezi altında iken dolaşan kan hacminin çıkarılması ile ötenazi. PAH ilerlemesi ve kontrol herhangi bir aşamasında Sıçanlar Bu protokolde kullanılabilir.
- Ölümden sonra 5 bronş çatallanma yukarıdaki mm ve kalp akciğerler bağlamak gemiler hakkında trakea keserek akciğerleri çıkar. soğuk tuzlu su içinde akciğerlere koyun. Sol akciğer parçalara ayır. çatallanma sol ana bronş kesin.
- ,% 4 paraformaldehid ile 50 ml şırınga doldurun şırıngaya bir kanül ile bir tüp takın ve çalışma tablosu üzerinde bir metre şırınga asmak. pasif paraformaldehid ile akciğer doldurmak için sol ana bronş içinde kanül takın.dikkatli paraformaldehid anlaştım.
- 48 saat paraformaldehid sol akciğer inkübe edin.
- (% 70 etanol (1 H),% 80 etanol (1 H),% 90 etanol (1 H),% 100 etanol (3H), ksilol (2 saat) ve parafin ardışık olarak inkübe edilerek kalan akciğer kurutmak 2H).
- Kaseti bakan akciğer hilus ile, parafin sol akciğer gömün.
- Üreticinin talimatlarına 29 uyarınca, bir Verhoeff veya Elastica-van Gieson boyama kullanılarak parafine gömülü, 4 mikron akciğer bölümleri Leke. Emin olun elastik lamina iyi (Şekil 3 gibi) ayrılır. 40X büyütmede lekeli bölümleri tarayın.
- 4 parçaya bölünür akciğer bölün. Her bir çeyrek daire olarak, <dış çapı 50 um (içi asinar) ve 10 damarları> bir dış çapa sahip 10 gemi 50 um (ön asinar) bulabilirsiniz. Bir resim (akciğer başına 2 x 40 resim) atın. rastgele her geminin 20x büyütme ve fotoğraf kadar büyütBu görüş sahası; seçim verevi en aza indirmek için.
- > 2 en uzun / kısa çap oranı, tam olmayan dairesel bir şekli, ya da kap duvarının fazla dörtte biri bir çöküş sahip damarları hariç.
NOT: dışlanan geminin bir örneği aynı büyütme (40X) her resim yapın ve bir ölçek çubuğu dahil 3b Şekil gösterilmiştir. - Açık ImageJ ve ilk resim. "Analyse" yoluyla ölçek ayarlamak için resimdeki ölçek çubuğunda düz bir çizgi çizmek ve "ölçek olarak ayarlayın." Için "Bilinen mesafe," resmin ölçek çubuğunda değeri kullanın. uzunluk birimi olarak mikrometre (um) kullanın. Küresel için ölçek olarak ayarlayın.
- "Serbest seçimleri" kullanma lümen alanı (Şekil 3) iç sınırında bir çizgi çizin, ve "ölçmek" kullanın (Ctrl m) bu alanı ölçmek için. Ardından, dış elast etrafında bir çizgi çizinic lamina (Şekil 3) toplam damar alanı ölçmek için.
- (Luminal ve dış çapı hesaplamak
) kullanılarak 
. - kullanarak duvar kalınlığını hesaplamak
. - kullanarak duvar / lümen oranını hesaplamak
. - kullanarak tıkanıklığı puanı hesaplamak
. - Muskularizasyon gemiyi Puan (hayır, kısmi veya toplam muskularizasyon) (Şekil 3B).
NOT: Tamamen muskularize olarak yarısından fazlasının çevresi için bir çift elastik lamina gemiler tanımlanır. Kısmen muskularize gibi bir çift elastik lamina yarısından daha az çevre gemiler tanımlanır. - Bir Neoi varlığına gemi Skoruntima (evet veya hayır) (Şekil 3C).
NOT: (genellikle eksantrik) lümen tıkanıklığı ile birlikte açıkça tanımlanmış internal elastik lamina olmadan gemiler neointimal lezyonlar olarak tanımlanır.
) kullanılarak 
. 
. 
. 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek sonuçlar Şekil 4'te sunulmaktadır. Kontrol grubu (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), ve MF-RVF (: sunulan sonuçlar MCT + aşağıdaki grupları Lewis sıçanlarında akış özellikleri gösterir n = 10). İstatistiksel analizler Bonferroni düzeltmesi ile tek-yönlü ANOVA ile yapılmıştır.
60 / kg MCT mg ve sistolik sağ ventrikül basıncında ortalama artış (SRVP) (23 ± 6 56 ± 11 mmHg), sistolik pulmoner arter basıncı (sPAB) (20 ± 4 54,0 ± 10 mmHg, pulmoner kan akımı skoru ), ve 16 ± 3 28 gün (MF28) at) mmHg ± 4 ila 36 () pulmoner arter basıncı (mPAP anlamına gelir. Onlar sağ ventrikül yetmezliği gelişir evre (MF-RVF) (Şekil 4) kadar eşit derecede yüksek kalır. Erken PAH aşamaları (MF8 ve MF14) at, SRVP, SPAP ve mPAP hiçbir artış gözlenmektedir. Diastolik PAP ve sağGeç fazda deneme basınç artışı, ancak önemli ölçüde. Kama basınçları hastalığın ilerlemesi sırasında önemli bir değişiklik yok.
sağ ventrikül-sol ventrikül ve sağ ventrikül hipertrofisi belirten MF-RVH'sının için MF14 anlamlı septal ağırlık oranı artar. karaciğerin ıslak-kuru ağırlık oranı önemli ölçüde karaciğer ödem ve konjestif sağ ventrikül yetmezliği belirten MF-RVH aşamada artar.
içi asiner damarların Muskularizasyon <PAH ilerlemesi sırasında kademeli olarak 50 mikron artar. Bu boyuttaki gemiler normalde kontrol sıçanlarda kaslı medial katmanı yok. MF14 anda, bu damarların (43 ± 17%) hemen hemen yarısı (Şekil 3B gibi) toplam kas ortam vardır. MF28 ve MF-RVH'sının anda, neredeyse her arteriole (98.7 ± 2.5 ve% 100 ±% 0) muskularize edilir. Neointimal lezyonlar ilk ortayaMF28 ve MF-RVH'sının iken MF21 de, her arteriollerin yaklaşık 65% (Şekil 3C gibi) neointimal tabakası vardır. arterioler duvardan-lümenin oranı ve tıkanma puanları hem sırasıyla MF28 (için MF14 önemli ölçüde artış 10.4 ± 3.9 71.5 ± 30 (con: 7.1 ± 0.2) ve 20.0 ± 2.8 54.7 ± 10.6 (con: 12.2 ± 0.3) ). Wistar sıçanlarda MCT + AKIM PAH ilerleme hemodinamik ve histomorfolojik özellikleri 14 benzerdir.
Şekil 1. Aorto-kaval Şant Cerrahisi şematik gösterimi. A) Aort gerilmiş ve ekleme sitesine üstün kenetlenir. vena kava ekleme sitesine aşağı sıkıştırılır. 45 ° 'de ve dış deliği ile bükülmüş bir iğne, 90 ° açı ile aort içine yerleştirilir. B) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Sağ Kalp kateterizasyonu Prosedürü ve Temsilci Basınç Eğrileri. A) Sağ juguler ven bir ligature ile gerilmiş ve havalandırma maske üzerine bantlanmış. Kateter boyun damarına yerleştirilir. B) sağ ventrikül basınç dalgasını gösteren bir başucu monitör. C) Sağ juguler ven içine sokulduktan sonra sağ atrium yerleştirilen kanül içinde kateter. Aşağıda: Tipik bir sağ atriyal basınç dalgası. D) sağ ventrikül yerleştirilen kanül içinde kateter. Aşağıda: Tipik bir sağ ventrikülson dönem PAH ar basınç dalgası. E) kateter ana pulmoner arter girmek için kanül olarak ilerletilir. Aşağıda: Tipik bir pulmoner arter basıncı dalgası. Bir kama basınç dalgası monitörde görüntülenir kadar F) kateter pulmoner arter içine ilerletilir. Aşağıda: Tipik bir pulmoner wedge basıncı dalgası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kontrol ve PAH Sıçanlarda Şekil 3. Vasküler Morfoloji ve Morfometri. A)% 3.7 bir tıkanma puanı ile normal olmayan muskularize gemi. B)% 24,3 bir tıkanma puanı ile tamamen muskularize arteriole. C). 54.1% bir tıkanma puanı ile bir neointimal lezyon. D) E) hesaplamaları içeren bir neointimal lezyon şematik gösterimi ile, bir kap içinde toplam tekne ve luminal alanının ölçümü (). çubuklar 50 uM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Pulmoner Hemodinami ve Damar Morfoloji / morfometri'nin Şekil 4. Temsilcisi Sonuçlar. İstatistiksel analizler Bonferroni düzeltmeleri tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı. Değerler ortalama ± SEM olarak temsil edilir. con: kontrolü; MF (monocrotalin + akışı); RVF: Sağ ventrikül yetmezliği; s: sistolik; d: diyastolik; m: Ortalama; RVP: Sağ ventrikül basıncı; PAP: pulmonery arter basıncı; RAP: Sağ atriyal basınç. RV: sağ ventrikül; LV: sol ventrikül; IVS: septum; BW: vücut ağırlığı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem sıçanlarda prensip hemodinamik ve PAH ve bu modeli karakterize histopatolojik uç noktalarını değerlendirmek için akış kaynaklı PAH ve teknikleri oluşturmak için MCT ile ön işleme tabi bir aorto-kaval şant cerrahi prosedürü tanımlamaktadır.
Protokolün ve Sorun Giderme içinde kritik adımlar
Cerrahi ve ameliyat sonrası. aorta-kaval şant ameliyatı sırasında en kritik adım aort ve vena kava diseksiyonudur. aort ve vena kava yeterince disseke edilmelidir içine zarlar iğne eklenecektir aort alanının 1) iyi bir görünürlük yaratmak ve yerleştirilmesinden sonra vena kava iğne pozisyonu ve 2) yeterli alana ait ekleme sitenin üstünde aorta kelepçe. Aynı membranlar, ancak, aynı zamanda hem damarların (Şekil 1) arasındaki delikten aort kanı yapmak için kullanılır. Çok fazla membranlar olacaktır Kesmeşant sızıntı neden olur. Doku yapıştırıcısı kaçağı çözebilir, ancak o zaman da büyüklüğü ödün, şant içine sızabilir. tutkal gemilerin şant akışı veya iki kısıtlı zaman, tutkal nazikçe kaldırıldı, ancak vena kava veya şant meydana gelebilir yapmak membran rüptürü olabilir. şant boyutu veya yeterlilik renk farkını ve pamuklu bir çubukla proksimal aort sıkıştırma ve açma sırasında vena kava kan türbülans derecesinin karşılaştırılması ile tahmin edilebilir.
Bir 18-G iğne sıçanları (14 Referans bakınız) ve sağ ventrikül volüm 15 Lewis (bu yazı) ve Wistar PAH ilerlemesi tutarlı ve tekrarlanabilir biçimde sonuçlanır yeterli şant oluşturmak gösterilmiştir. önemli ölçüde bir taraftan akciğer akışı ve diğer taraftan düşük post-operatif komplikasyon oranı artmış bir 18-G iğne, en iyi dengeli şant yarattı. En sık ameliyat sonrası sorun kilo kaybıdır. 1 hafta içinde% 10'a varan kilo kaybı muhtemelen daha düşük alımı nedeniyle ilk birkaç gün ameliyat sonrası, ameliyat sonrası tüm sıçanlarda meydana gelir. kilo kaybı 1 hafta içinde% 15 aştığında bu hasta olma işareti olarak kabul ediliyor Sıçanlar, ötenazi. Sıvı chow Ameliyat sonrası ilk hafta içinde beslenme artırabilir. Nadir postoperatif komplikasyonlar da ötenazi neden arka bacak paralizi ve barsak iskemi, vardır. Toplam olarak, sıçanların% 5'inden az postoperatif ötenazi gerekiyordu.
Kateterizasyon. kateterizasyon protokol sırasında kritik adımlar anestezi düzenlenmesi ile başlar. anestezi derinliğinin artışı özellikle sağ ventrikül yetmezliği olan sıçanlarda, sağ ventrikül ve pulmoner arter basınçlarını azaltmak için göründüğü gibi, - (bu protokolde% 2 izofluran 1.5) anestezi derinliği mümkün olduğunca az olmalıdır. Ölçümler becom eğilimiE protokol süresi 20 dk güvenilmez aştığında.
Bir sonraki kritik bir adım RV ve ana pulmoner arter kateter manipülasyonu olduğunu. Bu zor olabilir. ucu RV en trabeküllerinde sıkışmış zaman kateter Yıkanması eğrisine çıkış yoluna kateter yardımcı olabilir. manipülasyon kendisi başucu monitörde düzensiz basınç eğrilerini gösterir RV diskinezi neden olabilir. sağ ventrikül içine kateter giriş ve pulmoner arter sorunsuz çalışır. ucu pulmoner kapak olarak takılıyor zaman bir direnç hissedilir. Bu direnç üzerinden basılması sonraki ölçümlerin güvenilirliğini sınırlar yırtılmasına pulmoner kapak, neden olabilir.
Mevcut protokolde, fareler kateterizasyon işleminden sonra kurban edilmiştir. Kateter çıkardı sonra Teorik olarak, bununla birlikte, juguler ven ve cerrahi yara yalnızca yaşayabilir hayvan olarak, kapatılabilirjuguler ven sol kalan.
Morfometri. damar duvar kalınlığı ve oklüzyon puanlarının değerlendirilmesinde, en kritik adım elastik lamina tespit etmektir. deneyim, bu amaçla başarı olasılığı bir iyi diferansiye Verhoeff veya Elastica-van Gieson boyama ile en fazladır. lümen genellikle intima kolayca ayırt edilebilir olsa adventisyasında medyanın ayrım (dış vasküler alanı ölçmek için) daha yakından bakmak gerekebilir, (iç vasküler alanı ölçmek için). lumen ve internal elastik lamina, iç ve dış elastik lamina arasındaki tabaka olarak medya arasındaki tabaka olarak intima tanımlayan bazı protokoller ölçü intimal ve ayrı ayrı medial kalınlık,. Bu erken evre MCT + AKIM PAH genellikle mümkündür. Ancak, ilerlemiş hastalıkta Arterioller, özellikle neointimal lezyonlar, birden fazla elastik lamina görüntüleyebilir ve sık sık (elastik lamina bütünlüğünü kaybeder Avantajları ve bir Trigger olarak Akış ekleme kısıtlamaları Sıçanlarda PAH oluşturmak için artan pulmoner kan akışı kullanılması birçok avantaj, insan PAH koroner kalp hastalığı (Eisenmenger fizyolojisi) çevirinin yana hastalığı için bilinen bir (patolojik), fizyolojik tetik olduğunu olmak en önemli değil, aynı zamanda var PAH 9 diğer formları. Model AC-şönt oluştururken iğne boyutu değiştirilerek akış düzenleme sağlar. huAdam PAH-CHD, şant kapatılması hastalığın erken evresinde PAH tersine yol, ancak ilerlemiş hastalık dönemlerinde PAH ilerlemesine olacaktır. In vivo şant Kapatma biri PAH (olmayan) ters mekanizmaları araştırmak için böylece hastalığın ilerlemesi farklı zaman noktalarında tetikleyici çıkarılması etkisini araştırmak için izin istiyorum. Ne yazık ki, şu anda, paralel bağlantı kapama Mevcut modelde mümkün değildir. Hemodinamik normalleşme etkileri (örneğin, aşırı akış çıkarılması ve pulmoner arter basıncının normale) akış ilişkili PAH sıçanlarda normal tirajlı bir alıcı sıçan içine etkilenen sol akciğer nakli incelenebilir. Hemodinamik normalleştirme, akciğer transplantasyonu ile sıçanlarda ve insan bir kalp şant kapatılması PAH-KKH daha önce gösterilen erken evre medial hipertrofi gerilemesi PAH 21 neden olmuştur. Normal hemodinamik etkileriDeneysel akış-PAH ileri evrelerde zasyon henüz bilinmemektedir. Alternatif Modeller Açısından Önemi tek-hit MCT modeli. 60 mg / kg MCT bir deri altı enjeksiyonu, sıçanlarda pulmoner hipertansiyon için bir model oluşturmak için basit ve etkili bir yöntemdir. MCT pulmoner arter 5 kas tabakasının hipertrofisi ardından pulmoner arter endotel hücre hasarına, neden olur. Kesin mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir rağmen, çeşitli yollar ve büyüme faktörleri MCT aşağıdaki medial hipertrofi katılması tespit edilmiştir. Bu yollar üzerine ilaç müdahale genellikle başarılı MCT-sıçanlarda medial hipertrofi ve mPAP azalttı. Medial hipertrofi insanlarda 3 tersine çevirmek için doğal bir eğilim olduğu bilinmektedir ve aynı zamanda tarif edilmiştir Ancak, MCT-sıçanlarda 16 kendiliğinden bu tedavilerin etkisini terseleştirel takdir edilmelidir. Çift hit MCT + AKIM modeli. MCT enjeksiyon eleştirel bir karakteristik zamana bağımlı bir şekilde (vasküler) fenotip değiştirir sonra artmış pulmoner kan eklenmesi 7 gün akar. MF14 'de (7 gün artan akış indüklendikten sonra), normal olarak muskularize kaplar kas orta tabaka geliştirmeye başlar. MF21 'de medial kalınlığı artar ve birinci neointimal lezyon meydana gelmektedir. MF28 at, bir neointimal tabakası damarlarının çoğunluğunda geliştirmiştir. MF28 ve MF35 arasında, çoğu sıçan sağ kalp yetersizliği gelişir ve sekellerini ölmektedir. MCT + Akış sıçanlarda önceki çalışmalar MCT akışın eklenmesi gen spesifik kümelerinin aktivasyonuna neden olduğu gösterilmiştir. Bazı kümeler, akış MCT tarafından uyarılan etkileri karşı; diğerlerinde, bu etkileri gelişmiş, ve bir küme akışı 17 sonra up-regüle özellikle edildi genleri içeren akış. Bu akış spesifik genlerin biriolan erken gelişme tepkisi-1 geni 14 (Egr-1). Egr-1 erken inhibisyonu MCT + Akış sıçanlarda 18 PAH zayıflama ve neointimal oluşumu ile sonuçlandı. Egr-1 insan PAH (PAH-KKH ve idiyopatik PAH) 19 neointimal biçimlenme ile ilişkili bulunmuştur. Bu gözlemler, artmış veya pulmoner kan akımı neointimal oluşumu için önemli bir tetikleyici olduğu rahatsız delil ekleyin. Tek hit akış-tek model. MCT-enjeksiyonu olmadan bir aorto-kaval şant ile sıçanlarda, pulmoner hipertansiyon (mPAP> 25 mmHg) şant indüksiyon 20 sonra 10 ve 20 hafta arasında gelişir. 20 hafta sonunda, pulmoner vasküler histoloji öncesi asiner arterlerde medial hipertrofi ve intra-asiner arteriollerin neo-Muskularizasyon hakimdir. Bazı neointimal lezyon bu modelde 20 olarak anlatılmış olmasına rağmen, bu lezyonların gelişimi, ihtiyaçlarını o doğruladı ve sayısal olarak. Sugen-Hipoksi modeli. neointimal lezyonları ile PAH için başka bir ortak bir model Sugen5416-Hipoksi (SuHx) sıçan olduğunu. Sugen5416 blok vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) reseptörü. Bu endotel hücre hasarı ve hipoksi ile kombinasyon halinde, endotel apoptosis ile proliferasyon 22 çağrıştıran bir sinyalleme kaskadını uyarmaktadır. Sugen5416 enjeksiyonundan sonra, sıçan PAH geliştiği sonra 4 hafta için hipoksik odasına yerleştirilir. Sıçan sonra 4 hafta boyunca normoxia yeniden maruz kalmaktadır. Endotelyal apoptoz direnci ya da TGF-B ve BMP sinyal iletim hedef farmakolojik bileşiklerin bu modelde 23, 24, 25 neointimal lezyon ters potansiyel göstermiştir. SuHx modelinin yeni varyantı da neointimal lezyonları olan şiddetli PAH sonuçlanır Sugen-pneumectomy modeldir > 26. Bununla birlikte, bu model henüz tam olarak karakterize edilmemiştir. Sıçanlarda PH uyarılması için bir yeni genetik yöntemi, önemli Muskularizasyon (Ph) sonuçlanan BMP-reseptör-2 geninin, bir mutasyon ancak neointimal oluşumu (PAH) 27 içerir. Benzer sonuçlar neointimal lezyon sayısı ve tedavi edilmemiş SuHx ve MCT + Akış sıçanlarda 28 son dönem luminal tıkanması derecesi ile ilgili olarak rapor edilmiştir. Her iki modelde arasındaki temel farklar SuHx içinde, mPAP normoxia 28 yeniden maruz kaldıktan sonra yavaş yavaş azalmaya gösterilmiştir oysa MCT içinde mPAP + Akış giderek, arttığını) şunlardır: 1; 2) MCT + Akış modeli medial hipertrofi ve endotel disfonksiyonu ile karakterize bir hastalığın erken evre, bilir; 3) kez sağ ventrikül yetmezliği gelişmeye başlar bir son dönem (MCT + Akış 4 hafta, SuHx 8 hafta) ulaşmak için her iki model alıref "> 28 farklı olması ve 4) Sugen5416 Rolünü PAH patogenezinde hala belirsiz bir moleküler yolağı (VEGF) 'de engellediğini Bu, insan PAH için çeviri engelleyebilir.. Gelecek Uygulamalar veya Tarifi MCT + Akış modelinin farklı hastalık aşamaları tek 1) hastalığın ilerlemesi mekanizmaları test etmek için izin (insan dokusu genel olarak otopsi veya eksplant prosedürler) ve farklı stratejileri 2) test etmek müdahalelerden kullanılabilir. Önleyici bir strateji şant (MF7) inşaatı başlatılan olabilir. Bir erken müdahale MF14 de başlatılabilir. Bu geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz hastalığı arasındaki gri bölgeye ilerledi konjenital kalp şant ve ilişkili PAH çocuklarda kapatılmasını şant önce bir tedavi stratejisi olarak ilgili olabilir. Tersine çevrilmesi stratejileri MF21 veya MF28 başlatılan edilebilir. Daha sonra her ikisi de neointimal lezyonlar, son dönem PAH bir tezahürü gösterisi düzenliyor. </ P> Sonuç olarak, sıçanlarda MCT artan solunum akış ilavesinin insan hastalık gelişimini taklit ilerleyici ve ağır PAH bir model oluşturur. Sağ kalp kateterizasyonu ve damar histopatolojik nitel ve nicel değerlendirme PAH için bu hastalık karakterizasyonu taşlarını ve diğer modeller oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
