Introduction
Målet med denne metoden er å skape en reproduserbar modell for alvorlig, flow-indusert pulmonal arteriell hypertensjon hos rotter og måle dens prinsipp hemodynamisk og histopatologiske endepunkter.
Pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) er et klinisk syndrom som omfatter en progressiv økning i pulmonal vaskulær motstand fører til høyre ventrikkel svikt og død. Innenfor det overordnede sykdommen spekteret av lunge hypertensive sykdommer (PH), er PAH den mest alvorlige formen og en som fortsatt er uten en kur en. Den underliggende arteriopathy i PAH er preget av en typisk form for vaskulær remodellering som tetter årehulrommet. Muscularization av normale ikke-muscularized fartøy og hypertrofi av den mediale fartøyet lag betraktes som begynnelsen av sykdomsfenomener i PAH, ses også i andre former for PH 2, og antas å være reversibel 3. Som PAH etdvances begynner intimal lag til oppussing, til slutt danner karakteristiske neointimale lesjoner 2. Neointimale-type pulmonal vaskulær remodeling er eksklusiv for PAH og er ansett for å være irreversible 4.
Som PAH er en sjelden sykdom, fremskritt i sin pathobiological forståelse og utviklingen av nye behandlingsformer har støttet seg tungt på dyremodeller. Den monocrotalin (MCT) modell i rotter er en enkel enkelt hit modell som har vært, og fortsatt er, brukes ofte. MCT er en gift som fører til skade på lunge arterioler og regional betennelse 5. 60 mg / kg MCT fører til en økning i gjennomsnittelig pulmonalt arterietrykk (mPAP), pulmonar vaskulær motstand (PVR), og høyre ventrikkel hypertrofi (RVH) etter 3 - 4 uker 6. Den histomorphology er preget av isolerte medial hypertrofi uten neointimale lesjoner 5. MCTrottemodell representerer således en moderat form av PH, og ikke PAH, men det er ofte presentert som det sistnevnte.
Hos barn med PAH assosiert med en medfødt venstre til høyre shunt (PAH-CHD), økt lungeblodstrøm regnes som viktig trigger for utviklingen av neointimale lesjoner 7, 8, 9. Hos rotter kan økt pulmonal blodstrøm induseres av etableringen av en shunt mellom abdominal aorta og vena cava, en teknikk først beskrevet i 1990 10. Alternativer for å skape økt lunge flyt er ved ensidig pneumonectomy eller subclavia til lungearterien anastomose 11. Begrepsmessige ulemper ved disse modellene består av potensiell kompenserende vekst av den gjenværende lunge og adaptiv bane aktivering indusert ved pneumonectomy, eller av iatrogen skade av det pulmonale vaskulatur grunntil lungearterien anastomose, både konfunderende effekter av økt pulmonal blodstrøm.
Når en aorto-cava shunt er opprettet og øket lungeblodstrøm blir indusert som et andre hit i MCT-behandlede rotter, karakteristiske neointimale lesjoner forekommer, og en alvorlig form av PAH og tilhørende svikt i høyre hjertekammer (RVF) utvikle 3 uker etter den økede flyt 12. Den hemodynamiske progresjon av PAH i denne modellen kan vurderes in vivo ved ekkokardiografi og høyre hjertekateterisering. Den vaskulære histomorphology, fartøy veggtykkelse, grad av arteriolar okklusjon, og parametere for høyre ventrikkel svikt danner bærebjelkene i ex vivo karakterisering av PAH.
Denne metoden beskriver detaljerte protokoller for aorto-cava shunt (AC-shunt) kirurgi, høyre hjertekateterisering, og kvalitativ og kvantitativ vurdering av vaskulær histomorphology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av det nederlandske sentralkomiteen for dyreforsøk og Animal Care Utvalget ved University Medical Center Groningen (NL). Både Wistar og Lewis-rotter med en vekt på mellom 180 og 300 g ble anvendt.
1. Bolig og Akklimatisering
- Etter ankomst til sentrale Dyreavdelingen, house rotter i grupper på 5 per bur. I løpet av en 7-dagers akklimatisering periode, venne rottene til menneskelig håndtering, men ikke utføre eksperimentelle prosedyrer.
2. Utarbeidelse og Injeksjon av Steril Monocrotalin
- For 1 ml 60 mg / ml monocrotalin (MCT) løsning, veier 60 mg av monocrotalin i en 2-ml tube. Legg 700 ul 0,9% NaCl. Tilsett 200 ul av 1 M HCl. Varm løsningen i rør under varmt rennende vann fra springen og virvle det. Bruk 6 N NaOH for å bringe pH til 7,0. Bruk steril teknikk for utarbeidelse av MCT for injeksjon i gnagere. Injisere 1 ml steril 60 mg / ml MCT oppløsning per kg subkutant i nakken (0,3 ml av 60 mg / ml MCT for en 300 g rotte). MERK: Vi foretrekker å ikke bruke mindre volumer på grunn av større sjanse for at den injiserte dosen ikke vil være hensiktsmessig.
3. Aorta-cava Shunt Surgery
- Anestesi.
- Fyll induksjon kammer med 5% isofluran / 100% O 2 (flow: 1 L / min) og plassere rotte i kammeret. Sjekk for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å utføre en hind tå klype. Vei rotte.
- Barbere og rense magen over et område som er ca 8 cm lang og 3 cm bred. Plasser rotte på ryggen på en varmematte (37 ° C) er dekket av en steril matte.
- Plasser snute i en ventilasjons maske / hette med 2 - 3% isofluran / 100% O 2 (strømning: 1 L / min). Sjekk anestesidybden ved å utføre en hind tå klype. Påfør øye salve for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- shunt Surgery.
- Skrubb huden med klorid-hexidine for desinfeksjon. Injisere 0,01 mg / kg buprenorfin subkutant for postoperativ analgesi.
- Bruk sterile instrumenter for kirurgi. Lag et snitt med en # 10 skalpell blad i magen på midtlinjen, som starter 1 cm under mellomgulvet en som strekker seg ned til like over kjønnsorganer.
- Løft opp tarmen med en bomullspinne, dekker innvollene i et sterilt, våt gasbind (0,9% NaCl), og plassere dem på venstre side av dyret.
- Bruk bomullspinner for å skille membraner som fester abdominal aorta og vena cava inferior til omkringliggende vev.
MERK: Ikke dissekere membranene mellom aorta og vena cava. - Ved hjelp av utbryter tang, fjerne perivaskulær aortic fett like over delinger, bare på høyre side av aorta og bare på stedet der nålen skal settes inn.
- Bruk bomullspinner for å skille aorta og vena cava fra 2 mm supeRior til området der nålen skal settes inn for å skape rom for en Biemer klemme.
- På dette området, må du først plassere en løs ligatur (5-0 sutur) rundt aorta. Skape spenning på ligaturen ved å plassere en Kocher klemme på den, og deretter plassere Kocher bedre enn snittet (figur 1A). Plasser Biemer klemme bare overlegent ligaturen (Figur e 1A).
- Ved hjelp av en bomullspinne, komprimere vena cava som distalt som mulig for å hindre flyten (figur 1A). Bend en nål (18 G i denne protokoll) inn i en 45 graders vinkel, med åpningen peker mot utsiden (figur 1A).
- I en vinkel på 90 grader, stikk nålen i aorta, like over delinger, med åpningen av nålen som peker til venstre (figur 1A). Manipulere tuppen av nålen til venstre og sett den inn i vena cava.
MERK: nålespissen skal nå være visigjengelig i vena cava (figur 1B). - Bruk en andre bomullspinne for å skyve den gjenværende blod i aorta ut av innføringsstedet for å forhindre trombose. Tørk området rundt shunt med en steril kompress for at lim for å feste tilstrekkelig.
- Trekk hele nålen ut av aorta og umiddelbart bruke en dråpe vev lim på stikkstedet i aorta. Sørg for ikke å lime bomullspinne til vevet. Unclamp aorta.
- Verifisere shunt manuelt ved å trekke i og slippe ligaturen på aorta proksimalt for shunten. Løsner skulle farge vena cava distal til shunt i lyse rødt og skape turbulens ved shunt nettstedet.
MERK: Innstramming vil slå blodet i vena cava tilbake til mørk rød. - Plasser tarmen tilbake i dyret. Lukk muskel lag og hud med resorberbare 4-0 sting. Ventiler dyret med 100% O2 komme seg etter anestesien.
MERK: Ikke la en animal uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Sham Surgery.
- Utføre alle de ovennevnte prosedyrer med unntak for innføring av nålen inn i aorta.
- Post-kirurgisk behandling.
- Plasser rotte i et enkelt bur, og inn i en inkubator ved 37 ° C inntil neste morgen.
- Rundt 6 timer etter operasjonen, injisere 0,01 mg / kg buprenorfin subkutant for postoperativ analgesi. Gjenta neste morgen hvis rotta viser tegn til ubehag.
MERK: De første 3 dagene etter operasjonen, rotter har en tendens til å spise og drikke mindre (dette er spesielt viktig når chow eller drikkevann blir blandet med narkotika). De fleste rotter viser normal oppførsel 3 dager etter operasjonen. Hvis ikke, overvåke nøye. Vekttap på over 15% i en uke anses unormal, og slike rotter skal avlives ved utvinning av det sirkulerende blodvolum mens under anestesi.
Merk: I denne protokollen blir dyret avlivet ved ekstraksjon av det sirkulerende blodvolum mens under anestesi.
- Ofre en dag etter operasjonen (MF8) for de første cellulære og funksjonelle responser til økt pulmonal blodstrøm (f.eks gen oppregulering eller tidlig transkripsjonsfaktorer).
- Ofre en uke etter operasjonen (MF14) for et tidlig stadium PAH vaskulær fenotype (medial hypertrofi uten neointimale lesjoner).
- Offer 2 uker etter operasjonen (MF21) for et avansert stadium PAH vaskulær fenotype (merket medial hypertrofi og neointimal dannelse) med en liten økning i RVP og mPAP.
- Offer 3 uker etter operasjonen (MF28) for en sluttstadiet PAH vaskulær fenotype (merket neointimal okklusjon) og sterk heving i RVP og mPAP. Kliniske tegn på svikt i høyre hjertekammer er vanlig i denne fasen.
- Sacrifice etter dag 28 (MF-RVF) For PAH-assosiert høyre ventrikkel svikt (RVF), klinisk definert som åndenød, alvorlig slapphet, og vekttap (<10% i en uke). Avslutte rotter når en av disse tegn er til stede. Ofte rotter utvikle disse symptomene mellom dager 28 og 35, og hvis venstre ubevoktet, dø spontant i løpet av dette tidsintervallet.
5. Høyre hjertekateterisering
- Anestesi.
- Fyll induksjon kammer med 5% isofluran / 100% O 2 (flow: 1 L / min) og plassere rotte i boksen. Sjekk for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å utføre en hind tå klype. Vei rotte.
- Barbere og rense halsen på høyre ventral side av rotte og for ekkokardiografi protokollen, thorax og øvre del av magen.
- Plasser rotte på ryggen på en varmematte (37 ° C) og plassere snuten i et ventilasjonsmaske / hette med 2-3% isofluran / 100% O 2 (flow: 1 L / min). Snuten bør møtt mot forskeren.
- Ekkokardiografi protokollen.
- Utfør ekkokardiografi ifølge protokollen beskrevet av Brittain et al. i Jove 13.
- Kateterisering protokollen.
MERK: Denne protokollen bruker en stiv kanyle med en forhåndsformet spiss bøyd 20 grader for å lede 15 cm silisium kateter med en ball 2 mm fra spissen. En 20-G nål med sin åpning litt bøyd til innsiden blir brukt til å sette inn en kanyle i den høyre halsvene (se listen over materialer). Rotter i en hvilken som helst fase av PAH progresjon og kontroll kan brukes i denne protokollen.- Desinfiser hals med klorid-hexidine. Lag en 1,5 cm snitt med en # 10 skalpell blad i høyre ventral sideav halsen, fra høyre kragebein til kjevebenet.
- Spre vev ved hjelp av saks. Ved hjelp av pinsett, trekk forsiktig vevet hverandre til halsvenen vises. Skjær membraner rundt halsvenen ved hjelp av utbryter tang.
- Sette spenning på halsvenen ved å anbringe en løs ligatur (5-0 sutur) rundt fartøyet. Øke spenningen og tape ligaturen på ventilasjon maske (figur 2A).
- Nedstrøms av innføringsstedet, plasseres en løs ligatur rundt karet for å stramme etter at kanylen er på plass for å forhindre lekkasje og tap av trykk.
- Ved hjelp av håndtakene på en tang, noe bøy tuppen av en 20 G nål med åpningen til innsiden for å drive kanylen med kateteret.
- Innføre spissen av 20-G kanyle i venen og raskt å sette kanylen som inneholder kateteret inne i beholderen. Trekk ut nålen, og lukk deretter ligatursom ble utarbeidet i trinn 5.3.4.
- Gjennomføre kanyle som inneholder kateter i vena jugularis. Spissen av kanylen er ved en 20-graders kurve (se trinn 5.3.5). Manøvrere kanylen under kragebein og avansere litt å gå inn i høyre atrium (figur 2C).
- Å gå inn i høyre hjertekammer, peker tuppen av kanylen mot venstre, mot hjertet (figur 2D). På natt monitor, bør en RV trykk kurve vises, matchende figur 2D.
- Når RV trykket kurven er konstant, skrive ned det systoliske og diastoliske høyre ventrikkel trykk 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipulere tuppen av kanylen mot venstre og oppover. Advance kateteret inne i kanylen (figur 2E).
- Advance kateteret inn i lungearterien (PA). Ingen motstand skal kjennes når du passerer lunge ventilen.
MERK: Når kateteret entrer hovedlungearterien, diastolic trykket vil stige. På natt monitor, bør en PA trykk kurve vises, matchende figur 2E. - Når PA trykket kurven er konstant, skrive ned systolisk, diastolisk og mener PA trykk 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Ytterligere videre kateteret inne i kanylen inntil ballen på spissen av kateteret blir klemt fast i en lungearterien. Observer trykket kurven på natt monitor slipp og matche innkilingstrykk kurven i Figur 2F.
- Når innkilingstrykk kurven er konstant, skrive ned systolisk, diastolisk og mener innkilingstrykk.
- Trekk tilbake kateteret langsomt og deretter måle og skrive ned verdiene for sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, og dRVP2, som vises på natt skjermen.
- Når du er i RV, litt trekke tilbake kanyle og kateter for å måle mener rett atrial trykk (RAP). Kurven skal samsvare med RAP kurven i figur 2A.
NEITE: I denne protokollen blir rottene avlivet etter kateterisering protokollen ved ekstraksjon av det sirkulerende blodvolum mens under anestesi.
6. Morfologi Vurdering og morfometri
Merk: I denne protokollen blir dyret avlivet ved ekstraksjon av det sirkulerende blodvolum mens under anestesi. Rotter i en hvilken som helst fase av PAH progresjon og kontroll kan brukes i denne protokollen.
- Etter offer, ta ut lungene ved å kutte luftrøret ca 5 mm over bronkial delinger og fartøyene som kobler lungene til hjertet. Sett lungene i kaldt saltvann. Dissekere venstre lunge. Skjær venstre hoved bronkie på bifurkasjon.
- Fyll en 50-ml sprøyte med 4% paraformaldehyde, feste et rør med en kanyle til sprøyten, og henge sprøyten om en meter over arbeidsbordet. Monter kanyle i venstre hoved bronkie å passivt fylle lungene med paraformaldehyde.Håndtak paraformaldehyde med forsiktighet.
- Inkuber venstre lunge i paraformaldehyd i 48 timer.
- Dehydratisere den venstre lungen ved å inkubere det fortløpende i 70% etanol (1 time), 80% etanol (1 time), 90% etanol (1 time), 100% etanol (3 h), xylol (2 timer), og parafin ( 2 timer).
- Bygge inn den venstre lungen i parafin, med hilum av lungen som vender mot kassetten.
- Flekk parafininnstøpte, 4-mikrometer lungedelene med en Verhoeff eller Elastica-van Gieson flekker, som per produsentens instruksjoner 29. Sørg for at den elastiske lamellene er godt differensiert (som i figur 3). Skann de fargede delene på 40X forstørrelse.
- Del lunge inn i 4 kvadranter. I hver kvadrant, finne 10 skip med en ytre diameter <50 mikrometer (intra-acinar) og 10 skip med en ytre diameter> 50 mikrometer (pre-acinar). Ta et bilde (2 x 40 bilder per lunge). Zoom inn tilfeldig opp til 20x forstørrelse og fotografere hver fartøyeti dette synsfeltet for å minimere bias i utvalget.
- Utelukke fartøy som har en lengste / korteste diameterforhold på> 2, en ufullstendig sirkulær form, eller et sammenbrudd av mer enn en fjerdedel av beholderveggen.
MERK: Et eksempel på en ekskludert fartøy er vist i figur 3b Gjør hvert bilde på samme forstørrelse (40x) og inkluderer en skala bar. - Åpne ImageJ og det første bildet. Tegn en rett linje på målestokken på bildet for å sette skalaen via "Analyse" og "Set skala." For "kjent avstand," bruke verdien på bildets skala bar. Bruk mikrometer (um) som lengdeenhet. Sett skala til global.
- Ved hjelp av "frihånd valg," trekke en linje på den indre grensen av luminal området (figur 3), og bruk "måle" (Ctrl m) for å måle dette området. Deretter tegne en linje rundt den ytre elastic plate (figur 3) for å måle den totale fartøyet området.
- Beregn luminal og ytre diameter (
) ved hjelp av 
. - Beregn veggtykkelse hjelp
. - Beregn vegg / lumen forhold ved hjelp
. - Beregn okklusjon poengsum hjelp
. - Resultat fartøyet på muscularization (nei, delvis eller total muscularization) (figur 3B).
MERK: Fartøy med en dobbel elastisk lamina for mer enn halvparten av omkretsen er definert som helt muscularized. Fartøy med en dobbel elastisk lamina mindre enn halve omkretsen er definert som delvis muscularized. - Resultat fartøyet på tilstedeværelsen av en Neointima (ja eller nei) (Figur 3C).
MERK: Fartøy uten en klart definert innvendig elastisk lamina kombinert med (ofte eksentriske) luminal okklusjon er definert som neointimale lesjoner.
) ved hjelp av 
. 
. 
. 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater er vist i figur 4. De presenterte resultatene viser karakteristikker av MCT + FLOW i Lewis rotter i følgende grupper: Kontroll (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), og MF-RVF ( n = 10). Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA med Bonferroni korreksjon.
60 mg / kg MCT og øket lungeblodstrøm fører til en midlere økning i systolisk høyre ventrikulære trykk (sRVP) (23 ± 6 56 ± 11 mm Hg), systolisk pulmonalt arterietrykk (SPAP) (20 ± 4 til 54,0 ± 10 mmHg ), og mener lungearterietrykk (mPAP) (16 ± 3-36 ± 4 mmHg) 28 dager (MF28). De forblir like høyt opp på scenen når høyre ventrikkel svikt utvikler (MF-RVF) (figur 4). På begynnelsen av PAH stadier (MF8 og MF14), er ingen økning i sRVP, SPAP, og mPAP observert. Diastolisk PAP og riktig enprøvetrykkøkning i de sene faser, men ikke signifikant. Wedge presset ikke endres vesentlig i løpet sykdomsprogresjon.
Den høyre ventrikkel mot venstre ventrikkel og septal vekt forholdet øker betydelig fra MF14 til MF-RVF, indikerer høyre ventrikkel hypertrofi. Leveren er vått-til-tørrvektforhold blir betydelig økt ved MF-RVF fasen, noe som indikerer lever ødem og svikt i høyre hjertekammer.
Muscularization av intra-acinar fartøy <50 mikrometer øker gradvis i løpet av PAH progresjon. Skip av denne størrelse normalt ikke har en muskulær mediale lag i kontrollrotter. På MF14, nesten halvparten av disse fartøyene (43 ± 17%) har en total muskuløs media (som i figur 3B). På MF28 og MF-RVF, er nesten alle arteriole muscularized (98,7 ± 2,5% og 100 ± 0%). Neointimale lesjoner først skjeved MF21, mens ved MF28 og MF-RVF, rundt 65% av alle arterioler har en neointimal lag (som i figur 3C). De arteriolar vegg-til-lumen forhold og okklusjon score både øke betydelig fra MF14 til henholdsvis MF28 (10,4 ± 3,9 til 71,5 ± 30 (con: 7.1 ± 0,2) og 20,0 ± 2,8 til 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). De hemodynamiske og histomorphological karakteristikker av PAH progresjon i MCT + FLOW i Wistar rotter er lik 14.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av Aorto-cava Shunt Surgery. A) Aorta blir strammet og fastklemt overlegne i forhold til innføringsstedet. Den vena cava er komprimert dårligere enn innstikkstedet. Nålen, bøyd i 45 °, og med åpning til utsiden, er satt inn i aorta ved en 90 ° vinkel. B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Høyre hjertekateterisering prosedyre og Representative Trykk Curves. A) Den høyre halsvene er strammet med en ligatur og tapet på ventilasjons masken. Kateteret er plassert i halsvenen. B) En sengen skjerm som viser et høyre hjertekammer trykkbølge. C) Et kateter inne i kanylen plassert i høyre atrium etter innføring i den høyre halsvene. Under: en typisk rett atrial trykkbølge. D) Et kateter inne i kanylen plassert i den høyre ventrikkel. Under: en typisk rett ventricular trykkbølge i sluttstadiet PAH. E) Kateteret avanserte i kanylen for å gå inn i hovedlungearterien. Under: en typisk lungearterietrykket bølge. F) Kateteret avanserte inn lungene arteriene til en kile trykkbølge vises på skjermen. Under: en typisk lunge kile trykkbølge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vaskulær Morfologi og morfometri i Kontroll- og PAH Rats. A) En normal, ikke-muscularized kar med en okklusjon score på 3,7%. B) En helt muscularized arteriole med en okklusjon score på 24,3%. C). En neointimal lesjon med en okklusjon score på 54,1%. D) E) Måling av det totale fartøy og luminal område (i et kar med en skjematisk fremstilling av en neointimal lesjon), herunder beregninger. Stolpene representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representative Resultater av pulmonal hemodynamikk og Vaskulær morfologi / morfometri. De statistiske analyser ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA med Bonferroni korreksjoner. Verdier er representert som gjennomsnitt ± SEM. con: kontroll; MF (monocrotalin + flow); RVF: høyre ventrikkel svikt; s: systolisk; d: diastolisk; m: gjennomsnitt; RVP: høyre ventrikkel press; PAP: pulmonary blodtrykk; RAP: høyre atrial press. RV: høyre ventrikkel; LV: venstre ventrikkel; IVS: interventricular septum; BW: kroppsvekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne fremgangsmåten beskriver den kirurgiske prosedyren ifølge en aorto-cava shunt hos rotter forbehandlet med MCT for å skape strømningsinduserte PAH og teknikker for å bedømme prinsippet hemodynamiske og histopatologiske sluttpunkt som karakteriserer PAH og denne modellen.
Kritiske trinn i protokollen og feilsøking
Kirurgi og etter operasjonen. Under aorto-cava shunt kirurgi, er den mest kritiske trinnet disseksjon av aorta og vena cava. Membranene som omslutter aorta og vena cava bør dissekert nok til å skape en) god synlighet av aorta område, hvor nålen skal innføres, og av stillingen av nålen i vena cava etter innsetting og 2) tilstrekkelig plass til å klemme aorta over innføringsstedet. De samme membraner, men er også brukt til å gjennomføre aorta blodet gjennom stikkstedet mellom begge fartøyene (figur 1). Dissekere membraner for mye vilføre til at shunt å lekke. Vevslim kan løse lekkasje, men det kan da også trenge inn i shunt, går på bekostning av dens størrelse. Når limet har begrenset strømning gjennom shunten eller den ene av skipene, kan limet fjernes forsiktig, men ruptur av vena cava eller av membraner som utøver en shunt kan forekomme. Størrelsen eller tilstrekkeligheten av shunten kan bli estimert ved å sammenligne fargedifferanse og graden av turbulens i blodet i vena cava under komprimering og dekomprimering av det proksimale aorta med en bomullspinne.
En 18-G nål har vist seg å skape en tilfredsstillende shunt som resulterer i en konsekvent og reproduserbar form av PAH progresjon i Lewis (denne artikkelen) og Wistar (se Reference 14) rotter og fra høyre ventrikkel væskeoverskudd 15. En 18-G nål laget den mest godt balansert shunt, med betydelig økt lunge strømning på den ene side og en lav postoperative komplikasjoner på den annen side. Den vanligste postoperative problem er vekttap. Vekttap opp til 10% i en uke forekommer i alle rotter etter operasjonen, antagelig på grunn av lavere inntak av de første få dager etter operasjonen. Rotter avlives når vekttapet overstiger 15% i en uke, da dette anses som et tegn på å være uvel. Flytende chow kan forbedre fôring i den første uken etter operasjonen. Sjeldne postoperative komplikasjoner er bakben lammelse og tarm iskemi, som også føre til aktiv dødshjelp. I alt mindre enn 5% av rottene måtte avlives etter operasjonen.
Kateterisering. Kritiske trinn under kateterisering protokollen begynne med regulering av anestesi. Dybden av anestesi bør være så minimale som mulig (1,5 - 2% isofluran i denne protokoll), som en økning i bedøvelse dybde ser ut til å redusere høyre ventrikkel og pulmonalarterien trykk, særlig i rotter med svikt i høyre hjertekammer. Målinger har en tendens til å become upålitelig når protokollen overstiger 20 min i varighet.
Det neste viktige trinnet er manipulering av kateteret i RV og i de viktigste lungearterien. Dette kan være utfordrende. Spyling av kateter kan bidra til å kurve kateteret i utløpet kanalen når spissen sitter fast i RV trabeklene. Manipulering i seg selv kan føre til RV dyskinesi, som viser uregelmessige trykk kurver på natt skjermen. Innføringen av kateteret inn i den høyre ventrikkel og pulmonalarterien arbeider jevnt. Når spissen blir sittende fast i lungene ventilen, er en motstand merkes. Ved å trykke gjennom denne motstand kan forårsake lunge ventilen til brudd, noe som begrenser påliteligheten av etterfølgende målinger.
I den foreliggende protokollen, rottene avlivet etter kateterisering prosedyren. I teorien er imidlertid vena jugularis og kirurgisk sår kan lukkes etter at kateteret er trukket ut, som dyr kan leve med barede rester venstre halsvenen.
Morfometri. Ved vurdering av vaskulære veggtykkelse og okklusjon poengsummer, er det mest kritiske trinn for å identifisere den elastiske lamina. Av erfaring, er sannsynligheten for å lykkes med dette for øye størst med et godt differensiert Verhoeff eller Elastica-van Gieson farging. Mens lumen kan vanligvis skjelnes lett fra intima (for å måle intern vaskulær område), æren av media fra adventitia kan kreve en nærmere titt (for å måle den eksterne vaskulær området). Noen protokoller måle intimale og mediale tykkelse separat, definerer intima som sjiktet mellom lumen og den interne elastiske lamina, og mediet som lag mellom det indre og ytre elastiske lamina. Dette er vanligvis mulig i tidlig stadium MCT + FLOW PAH. Imidlertid kan arterioler i avansert sykdom, spesielt neointimale lesjoner, viser flere elastiske lameller og ofte mister integriteten av elastisk lameller ( Fordeler og begrensninger ved å legge den Flow som en Trigger Bruken av økt lungeblodstrømning for å skape PAH i rotter har flere fordeler, den mest fremtredende er at det er en kjent (patho-) fysiologisk utløser for sykdommen, noe som favoriserer oversettelse til humant PAH-CHD (Eisenmengers fysiologi), men også til andre former for PAH 9. Modellen gir mulighet for regulering av strømningen ved å variere størrelsen av nålen ved opprettelse av AC-shunten. i huMannen PAH-CHD, vil nedleggelse av shunt føre til reversering av PAH i tidlig fase av sykdommen, men til progresjon av PAH i avanserte sykdomsstadier. Lukking av shunt in vivo ville tillate en å undersøke effekten av fjerning av avtrekkeren ved forskjellige tidspunkter av sykdomsprogresjon og dermed å undersøke mekanismer for (ikke-) reversering av PAH. Dessverre, i dag, er shunt nedleggelse ikke er gjennomførbart i dagens modell. Virkningene av hemodynamisk normalisering (f.eks fjerning av overflødig flyt og normalisering av lungearterien trykk) i rotter med flow-forbundet PAH kan undersøkes ved transplantasjon av de berørte venstre lunge i en mottaker rotte med normal sirkulasjon. Det er vist tidligere at hemodynamiske normalisering, i rotter ved lungetransplantasjon og i humane PAH-CHD ved lukking av en hjerte shunt, fører til regresjon av medial hypertrofi i tidlig stadium PAH 21. Virkningene av hemodynamisk normalvisualisering i avanserte stadier av eksperimentelle flow-PAH er foreløpig ukjent. Betydning med hensyn til alternative modeller Den single-hit MCT modell. En subkutan injeksjon av 60 mg / kg MCT er en enkel og effektiv måte for å skape en modell for pulmonal hypertensjon hos rotter. MCT induserer pulmonal arteriell skade på endotelceller, etterfulgt av hypertrofi av den muskulære laget av lungearteriene 5. Selv om den eksakte mekanismene fortsatt uklare, ulike veier og vekstfaktorer er identifisert som deltar i medial hypertrofi følgende MCT. Pharmaceutical intervensjon på disse banene har ofte med hell redusert medial hypertrofi og mPAP i MCT-rotter. Men siden medial hypertrofi er kjent for å ha en naturlig tendens til å bli reversert i mennesker 3 og er også blitt beskrevet å reversere spontant i MCT-rotter 16, er effekten av disse behandlingenebør vurderes kritisk. Den doble rammede MCT + FLOW modell. Tillegg av økt lunge blod flyte 7 dager etter MCT injeksjon kritisk endrer (vaskulær) fenotype i en karakteristisk tidsavhengig måte. Ved MF14 (7 dager etter induksjon av øket strømnings), normalt ikke-muscularized fartøy begynner å utvikle en muskel mediale lag. Ved MF21, medial tykkelsen øker, og de første neointimale lesjoner forekomme. På MF28, har en neointimal lag utviklet i de fleste fartøy. Mellom MF28 og MF35, de fleste rottene utvikle riktig hjertesvikt og dø av sin sequellae. Tidligere studier i MCT + Strømnings rotter har vist at tilsetningen av strømningen til MCT fører til aktivering av bestemte klynger av gener. I noen klynger, flow motsetning effekten indusert av MCT; i andre, flyt forsterket disse effektene, og en klynge inneholdt gener som var spesielt oppregulert etter flyt 17. En av disse strømnings-spesifikke gener ertidlig vekstrespons-1-genet 14 (EGR-1). Tidlig inhibering av Egr-1 resulterte i dempningen av PAH og neointimal dannelse i MCT + Flow rotter 18. EGR-en var også assosiert med neointimal ombygging i menneskelig PAH (PAH-CHD og idiopatisk PAH) 19. Disse observasjonene legger til bevis for at økt eller forstyrret pulmonal blodstrøm er en viktig trigger for neointimal formasjon. Den single-hit flow-bare modell. Hos rotter med en aorto-cava shunt uten MCT-injeksjon, pulmonal hypertensjon (mPAP> 25 mmHg) utvikler seg mellom 10 og 20 uker etter shunt induksjon 20. På 20 uker, er pulmonal vaskulær histologi dominert av medial hypertrofi av de pre-acinar arterier og neo-muscularization av intra-acinar arterioler. Selv om noen neointimale lesjoner er også blitt beskrevet i denne modellen 20, utvikling av disse lesjonene må t o bli bekreftet og kvantifisert. Den Sugen-Hypoksi modell. En annen vanlig modell for PAH med neointimale lesjoner er Sugen5416-Hypoksi (SuHx) rotte. Sugen5416 blokkerer vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) reseptoren. Dette induserer endotelial celleskade og en signalkaskade som, i kombinasjon med hypoksi, fremkaller endotelial apoptose og proliferasjon 22. Etter Sugen5416 injeksjon, blir rotten anbringes i et hypoksisk kammer i 4 uker, hvorpå PAH utvikler seg. Rotten blir deretter re-eksponeres for normoxia i 4 uker. Farmakologiske forbindelser som er rettet mot endotel apoptose-resistens eller signalerings kaskader av TGF-B og BMP har vist at potensialet for å reversere neointimale lesjoner i denne modellen 23, 24, 25. En ny variant av SuHx modellen er Sugen-pneumectomy modellen, noe som også resulterer i alvorlige PAH med neointimale lesjoner > 26. Men denne modellen har ikke klarlagt ennå. En ny genetisk metode for å indusere PH i rotter omfatter en mutasjon i BMP-reseptor-2-genet, som resulterer i signifikant muscularization (PH), men ingen neointimal dannelse (PAH) 27. Sammenlignbare resultater er blitt rapportert når det gjelder antall neointimale lesjoner og graden av luminal okklusjon i sluttstadiet av ubehandlet SuHx og MCT + Flow rotter 28. De viktigste forskjellene mellom begge modellene er 1) at mPAP i MCT + Flow gradvis øker, mens i SuHx har mPAP vist seg å avta gradvis etter re-eksponering for normoxia 28; 2) at MCT + Flow modell vet et tidlig stadium av sykdommen, karakterisert ved medial hypertrofi og endotelial dysfunksjon; 3) at tiden det tar begge modellene for å nå en slutt-scenen der svikt i høyre hjertekammer begynner å utvikle (4 uker i MCT + Flow, 8 uker i SuHx)ef "> 28 er forskjellig, og 4) at Sugen5416 griper inn i en molekylær pathway (VEGF) hvis rolle i patogenesen av PAH er fremdeles uklart Dette kan hindre oversettelse til humant PAH.. Fremtidige applikasjoner eller Veibeskrivelse Den distinkte sykdoms fasene av MCT + Flow modell tillate en en) for å teste mekanismer for sykdomsprogresjon (menneskelig vev generelt er bare tilgjengelig fra post-mortem eller eksplantering prosedyrer) og 2) å teste intervensjoner i ulike strategier. En forebyggende strategi kan initieres ved byggingen av shunt (MF7). En tidlig intervensjon kan initieres på MF14. Dette kan være aktuelt som en behandlingsstrategi før shunt nedleggelse hos barn med en medfødt hjerte shunt og tilhørende PAH som har kommet inn i gråsonen mellom reversible og irreversible sykdom. Tilbakeføring strategier kan startes på MF21 eller MF28. Senere stadier både viser neointimale lesjoner, en manifestasjon av end-stage PAH. </ P> I konklusjonen, tillegg av økt lunge strømme til MCT hos rotter skaper en modell av progressiv og alvorlig PAH som etterligner menneskelig utvikling sykdom. Høyre hjertekateterisering og kvalitativ og kvantitativ vurdering av vaskulær histopatologi danner hjørnesteinene sykdommen karakterisering i denne og andre modeller for PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
