Summary
L’hormone sécrétée par le cortex surrénalien est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. Nous présentons ici un protocole à la culture le rat primaire les cellules surrénales. Ça pourrait être une bonne plateforme in vitro pour étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans la stéroïdogénèse surrénalienne et la biosynthèse des lipides.
Abstract
L’hormone qui sécrète de la corticosurrénale est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. La méthode décrite ici est la procédure de cellules surrénaliennes cultivés primaires de rat et des tests fonctionnels (immunofluorescence souillant de protéine de surface de gouttelettes lipidiques, ainsi que l’analyse corticostérone). Contrairement à un modèle in vivo, la variation d’interexperiments dans des cultures monocouches surrénalienne est inférieure et la condition expérimentale est facile à contrôler. En outre, la source des rats est aussi plus stable que les autres animaux, comme les bovins ones. Il y a aussi plusieurs lignes de cellules surrénales humaines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) qui peuvent être utilisées dans les études surrénaliennes. Cependant, la production de stéroïdes de ces lignes sera toujours influencée par de nombreux facteurs, qui comprennent le numéro de lot de sérum, nombre de passage, mutant/perte de gènes distincts, etc.. Sauf faute de 17α-hydroxylase, la culture primaire de cellules corticosurrénaliennes rat est une technique mieux et plus pratique pour l’étude de la physiologie surrénalienne. En résumé, les glandes surrénales cultures primaires de rat pourraient être une bonne plateforme in vitro pour les chercheurs d’étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans le système de la glande surrénale.
Introduction
Le système endocrinien est chargé de réglementer les activités physiologiques et l’homéostasie du1. Les glandes surrénales situées au pôle crânial des reins sont l’un des principaux organes endocrines qui sécrètent les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et androgènes2,3. Il y a deux parties distinctes de la glande surrénale : le cortex et la médulla. Le cortex surrénalien se compose de trois couches : la glomérulée externe, le fasciculata intermédiaire et les reticularis interne3. La zone glomérulée est le site original de sécrétion d’aldostérone, un minéralocorticoïde, qui facilite en résorbant les ions sodium et eau dans les reins à3. Le fasciculata de zona produit principalement un niveau basal des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques normales3. Corticostéroïdes chez les rongeurs et le cortisol chez l’homme agissent pour aider le corps à gérer le stress en régulant le débit sanguin de glucose3. Dans une certaine mesure, ils peuvent inhiber les réponses inflammatoires et réguler le système immunitaire4,5. Contrairement aux autres mammifères, les souris et les rats n’ont pas un reticularis de zona fonctionnelle en raison de l’absence d’une expression 17α-hydroxylase dans la glande surrénale6,7. Ainsi, les glandes surrénales de rats et de souris sont dépourvues de la sécrétion des stéroïdes de C-19 surrénales (cortisol et androgènes surrénaux).
Primaire des cellules corticosurrénales ont est avérés utile pour étudier les mécanismes contrôlant la physiologie surrénalienne8. Comme les autres tissus stéroïdogènes, chaque zone surrénalienne synthétise ses stéroïdes du cholestérol libre9. Lors de la stimulation de l’hormone adrénocorticotrope (ACTH), le cholestérol libre est libéré de gouttelettes lipidiques de ventilation et, par conséquent, améliore la production de stéroïdes chez le fasciculata et reticularis10.
Plusieurs groupes ont tenté d’établir des lignées stables de carcinomes corticosurrénales. Toutefois, plusieurs préoccupations ont limité l’utilisation de lignées de cellules corticosurrénaliennes comme vitro modèles8. Les réponses de stéroïdes de lignées cellulaires peuvent différer entre les passages, le numéro de lot du sérum et la qualité du sérum, etc.. En outre, des lignées de cellules surrénaliennes commerciale (Y1 et SW13) ne pas sécréter corticostérone, rendant plus difficile à étudier la stéroïdogénèse surrénalienne8. L’utilisation des surrénales bovines et équines comme ex vivo modèles peuvent être un bon choix, même si les tissus de ces marchés peuvent occulter certains risques inconnus. Comparé à eux, gestion des glandes surrénales de rat est plus facile et la source est relativement plus stable et exempts de micro-organismes pathogènes. Pris ensemble, la présente méthode décrite ici pourrait être utilisée pour étudier le mécanisme de synthèse de la corticostérone dans les cellules surrénales fasciculata rat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation Comité de Kaohsiung Medical University.
1. marche à suivre
- Sacrifier les rats de SD femelle/mâle adulte (8 à 12 semaines) en CO2 euthanasie.
- Appliquer de l’éthanol à 70 % et laissez-le être absorbée par la peau et puis essuyer la peau avec un papier de soie.
- Mettre le rat sur une plaque de plastique propre en décubitus dorsal.
- Soulever la peau avec une pince courbe « externe » à la ligne médiane et effectuer une dissection émoussée en créant une forme de «Y» (du niveau de la cuisse jusqu'à l’angle sous-costal).
- Rincer les ciseaux à l’éthanol à 70 % et, ensuite, couper le muscle, en créant une forme de «Y».
-
Trouver la glande surrénale gauche derrière l’estomac.
Remarque : la surrénale droite se trouve profondément derrière le foie.- Utilisez une paire de pinces pour soulever l’estomac ou le foie et isoler les glandes surrénales avec une autre pince courbée.
- Après avoir mis les glandes surrénales dans un récipient stérile, retirer délicatement la capsule surrénale avec une pince fine.
- Avec une délicate paire de ciseaux, couper les glandes surrénales en petits morceaux avec un petit peu de Dulbecco sans sérum de l’aigle modifié (DMEM) / F-12 moyen.
-
Préparer trois pipettes Pasteur pore taille différentes et la première pipette Pasteur permet d’aspirer tous les morceaux surrénaliennes dans un tube conique de 50 mL contenant le support avec la collagénase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Doucement, broyer les morceaux de tissus sur x 10. Utiliser le reste de la pipette et répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pièces deviennent plus petites.
Remarque : La taille des pores différentes des pipettes Pasteur peut être créée en les chauffant avec le feu. La première pipette est la taille d’origine (environ 1 mm), la taille des pores de la seconde est d’environ 0,8 mm et la pipette Pasteur troisième est d’environ 0,5 mm. Au cours de la digestion, les morceaux de surrénales deviendra plus petits. Ainsi, via la procédure mécanique, les glandes surrénales peuvent être digérées plus achevé. Incuber le tube dans un bain d’eau (à 37 ° C) et l’agiter toutes les 5 min, 4 x au total.
- Doucement, broyer les morceaux de tissus sur x 10. Utiliser le reste de la pipette et répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pièces deviennent plus petites.
- Après l’incubation de 20 min, ajouter le milieu frais et cool (sextuple volume ; par exemple, 5 mL de tissu + 25 mL de cool milieu DMEM/F-12) contenant 2,5 % bovine sérum fœtal (SVF) et 5 % de sérum de cheval pour arrêter l’effet de l’enzyme.
- Recueillir les granules cellulaires par centrifugation à 800 x g pendant 10 min.
- Ajouter un volume approprié de moyenne à suspendre les cellules.
Remarque : Chaque glande peut faire environ 3 ~ x 105 à ~ 4 x 105 cellules. - Les cellules souhaitées assiettes ou plats sur plaque avec milieu de culture (mélange 1:1 [v/v] du milieu DMEM et du jambon F-12 additionné de 25 mM HEPES et 1 % pénicilline et de streptomycine) nuit (jour 0) à 37 ° C, dans un environnement humidifié de 95 % air et 5 % de CO2.
Remarque : Généralement, nous plaque cellules en plaques 24 puits (quatre glandes/plaque) pour le dosage de la corticostérone et en 35 mm plats (glande un/environ un ou deux plats) pour western blot analyse. - Se laver soigneusement les cellules 2 x avec sans sérum chaud milieu DMEM/F-12 (jour 1). Remplacer le nouveau milieu de culture.
- Maintenir les cellules à 37 ° C dans un environnement humidifié de 95 % air et 5 % de CO2 jusqu’au jour 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utilisant la procédure décrite ici, les cellules surrénales cultivés primaires se distinguaient sous un microscope à contraste de phase (Figure 1 a). Pour confirmer que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques, la coloration à l’immunofluorescence de protéine de liées à la différenciation adipeuse (PACA) pourrait être réalisée sur des cultures de jour-3 (Figure 1 b). Les cellules ont été cultivées sur le couvre-objet en verre. Les cellules ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixés avec paraformaldéhyde à 4 %. Après avoir lavé trois fois avec du PBS, les cellules ont été bloqués et perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 à 5 % de lait. L’anticorps primaire de PACA a été dilué (01:50) à 5 % de lait et est incubé pendant la nuit. Après que trois fois du lavage de PBS, les cellules sont incubées avec l’anticorps secondaires Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre (au 1/100). Après avoir répété les étapes de lavage, les cellules ont été montés avec milieu de montage Antifade or prolonger et ont été examinés au microscope de fluorescence. En outre, la capacité de production d’hormone des cellules surrénaliennes rat peut être déterminée par dosage de la corticostérone. Stimulation de l’ACTH sur cellules surrénales de rat pourrait servir de témoin positif (Figure 1). Les médias collectés ont été dilués et dosés pour le contenu de la corticostérone, selon la procédure décrite par Chen et al.11.
Figure 1 : la caractérisation des cellules surrénaliennes et la réponse de corticostérone au traitement de l’ACTH. (A) image de contraste de Phase de cellules surrénaliennes jour-3 cultivés primaires de rat. (B) PACA coloration apparaît. (C) jour-3 cellules surrénaliennes cultivées de rats ont été traités avec l’ACTH (13:00 et 1 nM) pendant 6 h. Les médias ont été recueillies et conservées au réfrigérateur-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Taux de corticostérone ont été mesurés par dosage immunoenzymatique (ELISA). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les glandes surrénales jouent un rôle clé dans l’adaptation environnementale3. Le par lequel la corticosurrénale sécrète l’hormone permettant de régler et ajuster les fonctions physiologiques et l’homéostasie du3. Le modèle in vivo reflète les effets réels physiologiques dans le corps. Toutefois, il est toujours influencée par de nombreux facteurs complexes, provoquant des effets instables dans les expériences. En revanche, le modèle in vitro de cellules possède des avantages qui le rend incomparable pour le modèle animal. Tout d’abord, l’état environnemental est facile à contrôler dans le système in vitro. Les hormones sont susceptibles d’être affectés par tout stimulus. Expériences in vivo résultent habituellement dans une réaction non spécifique car les animaux est sensibles à la détresse. Deuxièmement, les substances ne sont pas faciles à surveiller dans le corps mais sont passibles dans le système de culture. Troisièmement, le système in vitro réduit les écarts entre chaque expérience indépendante. De nombreux rapports scientifiques indiquent un milieu de culture de cellules corticosurrénaliennes contenant 10 à 20 % FBS12,13,14,15, considérant que le protocole présenté ici utilise 5 % FBS et 2,5 % de sérum de cheval pour maintenir la croissance de cellules surrénaliennes pendant une semaine.
Stéroïdogenèse est démarrée à partir du clivage du cholestérol libre par les enzymes du cytochrome P450 chaîne latérale. Comme le montre la Figure 1 aB, cellules surrénales pièce nombreuses et différentes tailles de gouttelettes lipidiques, ce qui suggère que c’est un bon outil pour l’étude de la biologie stéroïde biosynthèse et/ou lipidique (cellules fasciculata ont lipides importants et plus gouttelettes)1,3. Le PACA, également connu sous le nom de perilipin 2, est une protéine de surface de gouttelettes de lipides qui aide dans le stockage des lipides neutres dans les gouttelettes de lipides16. En raison de cellules corticosurrénaliennes présentant une quantité de lipides, le PACA (ou d’autres protéines de surface de gouttelettes lipidiques, comme perilipin) peut être utilisé pour déterminer si les agents testés affectent l’hormone de synthèse16.
La croissance et la fonction des glandes surrénales sont étroitement contrôlées par hypothalamique corticotropic releasing hormone hypophysaire ACTH, neuropeptides, neurotransmetteurs et facteurs de croissance, etc.17. Figure 1 révèle que la production de corticostérone était significativement induite par traitement d’ACTH de façon dose-dépendante. En outre, ACTH à 13:00 et 1 nM stimule la production de corticostérone environ 30 - et 70-fold, respectivement. Il a été démontré que les cellules cultivées de surrénaliennes primaires jour-3 présentent une meilleure réponse aux ACTH stimulation15. C’est aussi la raison pourquoi la culture de jour-3 a été utilisée dans la présente étude. En outre, la mesure de la corticostérone par kit ELISA est également un outil de recherche simple et facile. Par conséquent, les cellules surrénaliennes cultivés primaires de rat non seulement fournissent la plateforme pour l’étude de la stéroïdogénèse surrénalienne mais peuvent également s’appliquer à l’étude des maladies inflammatoires.
Les étapes critiques du présent protocole sont la digestion des surrénales et la maîtrise de la contamination. Par conséquent, contrôle des temps de digestion, la force d’aspiration physique et d’observation du niveau tissulaire digestion sont très importants pour la survie des cellules. En outre, la méthode de couper la peau et les glandes surrénales d’isolement est également significative. Toujours plonger tous les instruments dans l’éthanol à 70 % pour prévenir toute contamination de la fourrure animale. Afin d’obtenir plus de cellules, la fréquence d’aspiration doit être contrôlée à moins de dix fois pendant chaque aspiration. En outre, si la condition des tissus n’est pas bonne pour progresser, l’incubation en contenant de collagénase moyen ne devrait pas être plu de 30 min.
Parce que les glandes surrénales des rats sont petites, la couche glomérulaire peut être perdue au cours de l’épluchage de la capsule surrénale. Il a été démontré que décapsulation a entraîné le retrait de la capsule de tissu conjonctif et le zona ensemble glomérulée18. Les glandes surrénales de rats mâles sont plus petits que ceux des rats femelles. En outre, les gouttelettes de lipides semblent être plus grande en 11 semaines féminin ou masculin souris6. Concernant les cellules, les rats femelles peuvent être un bon choix pour des expériences.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Taiwan National de conseil scientifique (NSC102-2320-B-037-008-MY3) et une subvention de recherche kit de développement National Cheng-Kung University hôpital (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
