Summary
Гормон коры надпочечников является жизненно важным для животных против стресса и болезней. Здесь мы представляем протокол к культуре первичных крыса клеток надпочечников. Это может быть хорошей в пробирке платформой для изучения механизмов реагента интерес к надпочечниковой стероидогенеза и биосинтеза липидов.
Abstract
Гормон, который выделяет коры надпочечников является жизненно важным для животных против стресса и болезней. Метод, описанный здесь является процедура первичного культивировали крыса клеток надпочечников и смежных функциональных анализов (иммунофлюоресценции окрашивание липидного капель поверхности белка, а также анализ кортикостерона). В отличие от в естественных условиях модели колебания interexperiments в культурах надпочечников монослоя меньше и экспериментальные условия легко контролировать. Кроме того источник крыс также является более стабильным, чем других животных, как говядину из них. Есть также несколько линий клеток человека надпочечников (NCI-H295, NCI-H295R, под ключ SW13 и т.д.), которые могут использоваться в исследованиях, надпочечников. Однако стероидов производства этих линий по-прежнему будут определяться многочисленных факторов, которые включают сыворотки номер партии, номер прохода, мутант/потеря отдельных генов, и т.д. За исключением хватает 17α-гидроксилазы, основная культура клеток коры надпочечников крыс методика лучше и более удобным для изучения физиологии надпочечников. В резюме основной крыса надпочечников культур может быть хорошо в пробирке платформой для исследователей для изучения механизмов реагента интерес к системе надпочечника.
Introduction
Эндокринная система отвечает за регулирование физиологической деятельности и гомеостаза1. Надпочечных желез, расположенных в черепной полюса почки являются одним из крупных эндокринных органов, которые выделяют mineralocorticoids, глюкокортикоидов и андрогенов2,3. Существует два отдельных частей надпочечника: коры и мозгового вещества. Надпочечников состоит из трех слоев: внешняя glomerulosa, промежуточных fasciculata и внутренняя reticularis3. Glomerulosa зона-это оригинальный сайт секреции альдостерона, минералокортикоиды, которая помогает в реабсорбции ионов натрия и воды в почках3. Zona fasciculata главным образом производит базальный уровень глюкокортикоидов в нормальных физиологических условиях3. Кортикостероиды в грызунов и кортизола в организме человека действовать, чтобы помочь телу в преодолении стресса, регулируя глюкозы крови3. В некоторой степени они подавляют воспалительные реакции и регулировать иммунную систему4,5. В отличие от других млекопитающих, мышей и крыс не имеют функциональный zona reticularis из-за отсутствия выражения 17α-гидроксилазы в надпочечника6,7. Таким образом надпочечники от мышей и крыс лишены секрецию надпочечников C-19 стероиды (кортизола и надпочечников андрогены).
Первичной клетки культивировали адренокортикальной было показано, чтобы быть полезным для изучения механизмов, контролирующих надпочечников физиологии8. Как другие стероидогенных тканях каждой зоне коры надпочечников синтезирует стероидов из свободного холестерина9. Адренокортикотропный гормон (АКТГ) стимуляции свободный холестерин освобождается от пробоя липидного капель и, таким образом, повышает стероидов производства в fasciculata и reticularis10.
Многие группы пытаются установить стабильных клеточных линий от адренокортикальной карциномы. Однако некоторые проблемы ограниченное использование адренокортикальной клеточных линий и в пробирке модели8. Стероидных ответы клеточных линий могут отличаться между проходы, номер лота сыворотки и качество сыворотки, и т.д. Кроме того коммерческие надпочечников клеточных линий (Y1 и под ключ SW13) не выделяют кортикостерона, что делает его более трудным для изучения надпочечников стероидогенеза8. С помощью надпочечников крупного рогатого скота и лошадей, как ex vivo модели могут быть хорошим выбором, даже несмотря на то, что ткани из этих рынков может скрывать некоторые неизвестные риски. По сравнению с ними, управление крыса надпочечники легче и источник относительно более стабильной и свободной от возбудителя. Вместе взятые, нынешний метод, описанный здесь могут использоваться для расследования соответствующих механизм синтеза кортикостерона в клетках надпочечников fasciculata крыса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включая животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Гаосюн медицинского университета.
1. Экспериментальная процедура
- Пожертвуйте крыс SD женщины/мужчины взрослого (8-12 недельных) CO2 эвтаназии.
- Применить на 70% спирте и дайте ему впитаться в кожу, а затем протрите кожу с папиросной бумаги.
- Положите крысу на чистые пластиковые пластины в лежачем положении.
- Снять кожу с «внешними» Изогнутый пинцет в средней линии и выполнить тупым рассечение, создав форму «Y» (от уровня бедра на онкогорошину угол).
- Промойте ножницы с 70% этанола и, затем, сокращение мышц, также создавая фигуру «Y».
-
Найти левого надпочечника позади желудка.
Примечание: право надпочечников можно найти глубоко позади печени.- Используйте одну пару щипцы поднять желудка или печени и изолировать надпочечников с другой Изогнутый пинцет.
- После сдачи надпочечников в стерильную посуду, осторожно удалите надпочечников капсула с тонкой щипцами.
- С парой деликатный ножницами, вырезать надпочечников на мелкие кусочки с немного немного сыворотки бесплатно Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) / F-12 среды.
-
Подготовить три различных размера поры пипетки Пастера и использовать первый Pasteur накапайте аспирационная все части коры надпочечников в конической Тюбик 50 мл, содержащие средний с коллагеназы II (~0.5–0.8 мг/мл).
- Аккуратно нарезанных кусков ткани о 10 x. Использовать оставшуюся часть пипетки и повторите описанные выше шаги, пока все части становятся меньше.
Примечание: Размеры разные поры пипетки Пастера могут создаваться путем нагревать их с огнем. Первый накапайте является Оригинальный размер (около 1 мм), размер пор второй составляет около 0,8 мм, и третья Pasteur накапайте составляет около 0,5 мм. Во время пищеварения куски надпочечников станет меньше. Таким образом через механические процедуры, надпочечников может переварить более завершено. Инкубировать трубки на водяной бане (при 37 ° C) и встряхните его каждые 5 мин., 4 x в общей сложности.
- Аккуратно нарезанных кусков ткани о 10 x. Использовать оставшуюся часть пипетки и повторите описанные выше шаги, пока все части становятся меньше.
- После инкубации 20 мин Добавьте Свежий и прохладный среднего (шестикратный тома; например, 5 мл ткани + 25 мл прохладной среде DMEM/F-12) содержащий 2,5% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 5% сыворотки лошадь остановить эффект фермента.
- Собирайте гранулы клетки центрифугированием на 800 x g за 10 мин.
- Добавьте соответствующий объем среднего приостановить клетки.
Примечание: Каждая железы можно сделать около ~ 3 x 105 ~ 4 x 105 клеток. - Пластина клетки в желаемой пластин или блюда с среднего роста (1:1 [v/v] смесь DMEM и Хам F-12 Средний, дополнена 25 мм HEPES и 1% пенициллина и стрептомицина) ночь (день 0) при 37 ° C, в среде увлажненные 95% воздуха и 5% CO2.
Примечание: Обычно мы плиты клетки в 24-ну пластины (четыре желез/пластина) для assay кортикостерона и в 35 мм блюда (одной железы/примерно один-два) для западной помарки анализа. - Тщательно вымыть клетки 2 x с сыворотка бесплатно теплый среде DMEM/F-12 (1 день). Замените новый среднего роста.
- Сохранить клетки при 37 ° C в увлажненной среде 95% воздуха и 5% CO2 до 3 день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя процедуру, описанную здесь, можно различить основной культурный надпочечников клетки под микроскопом фазово контрастной (рис. 1A). Для дальнейшего подтверждения, что пузырьки в цитоплазме, липидного капель, иммунофлюоресценции пятнать жировой связанных с дифференциация белка (ADRP) может быть проведена на 3 день культур (Рисунок 1B). Клетки были выращены на coverslips стекла. Клетки были три раза промывают фосфат амортизированное saline (PBS) и фиксированной с параформальдегида 4%. После мытья три раза с PBS, клетки были заблокированы и permeabilized с 0,1% тритон X-100 в 5% обезжиренное молоко. Основное антитело ADRP был разбавленным (1:50) в 5% обезжиренное молоко и был инкубированы всю ночь. После того, как три раза PBS стирки, клетки инкубировали с Коза анти кролик Alexa Fluor 488 вторичные антитела (1: 100). Повторив шаги Стиральная, клетки были установлены с продлить Золотой Antifade монтажа средних и были рассмотрены под флуоресцентным микроскопом. Кроме того гормон производители способности клеток надпочечников крыс может определяться пробирного кортикостерона. Стимуляции АКТГ на клетки надпочечников крыс может служить позитивным управления (рис. 1 c). Собранные средства массовой информации были разведен и assayed для содержания кортикостерона, согласно процедуре, описанной в Chen et al.11.
Рисунок 1: характеристика клеток надпочечников и кортикостерона ответ на лечение АКТГ. (A) фазово контрастной картину основной культурный крысы день-3 клеток надпочечников. (B) ADRP окрашивание показано. (C) день-3 надпочечников клетки культивировали крысы были обработаны с АКТГ (1 pM и 1 Нм) для 6 ч. Средства массовой информации были собраны и хранятся в холодильнике-80 ° C до использования. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) были измеряется уровень кортикостерона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Адреналиновые железы играют ключевую роль в экологической адаптации3. Гормон, который выделяет коры надпочечников может регулировать и регулировать физиологические функции и гомеостаза3. В естественных условиях модель отражает реальные физиологические эффекты в организме. Однако он по-прежнему зависит от многих сложных факторов, причиной нестабильной эффекты в экспериментах. Напротив в пробирке ячеечная модель имеет преимущества, что делает его несравненная в животной модели. Во-первых условия окружающей среды легко контролировать в системе в пробирке. Гормоны могут быть затронуты любой раздражитель. В экспериментах in vivo обычно приводят неспецифические реакции, потому что животные склонны к беде. Во-вторых вещества не являются легко контролировать в организме, но ответственность в системе искусственного. В-третьих в пробирке система уменьшает разницы между каждым независимый эксперимент. Многие научные доклады показывают культуру СМИ адренокортикальной ячеек, содержащих 10 – 20% ФБС12,13,14,15, тогда как здесь представлены протокол использует 5% FBS и 2,5% сыворотки крови лошади для поддержания рост клеток надпочечников для до одной недели.
Стероидогенеза начинается от расщепления свободного холестерина боковой цепи расщепления ферментами цитохрома P450. Как показано на рисунке 1AB, надпочечников клетки демонстрируют многочисленные и различные размеры капелек липидов, предполагая, что это является хорошим инструментом для исследования стероидов биологии биосинтез и/или липидов (fasciculata клетки имеют известных и крупных липидов 1,капель)3. ADRP, также известный как perilipin 2, является липидного капель поверхности белка, который помогает в хранении нейтральные липиды внутри липидного капель16. Из-за адренокортикальной клетки экспонируется количество липидов, ADRP (или других липидов белков поверхности капли, как perilipin) могут использоваться для изучения ли проверенный агенты влияют на синтез гормона16.
Роста и функции надпочечников жестко контролируется, гипоталамические corticotropic рилизинг гормон гипофиза АКТГ, Нейропептиды, нейромедиаторов и факторы роста, и т.д.17. Рисунок 1 c показывает, что производство кортикостерона значительно индуцированных АКТГ лечения концентрация зависит от моды. Кроме того АКТГ 1 вечера и 1 Нм стимулировал производство кортикостерона около 30 - и 70-fold, соответственно. Было продемонстрировано, что день-3 культивировали первичной коры надпочечников клетки exhibit лучше ответ на стимуляции АКТГ15. Это также причина, почему культура день-3 была использована в настоящем исследовании. Кроме того измерение кортикостерона, ELISA комплект также является простой и удобный инструмент для исследования. Таким образом основной культурный крыса надпочечников клетки не только предоставляют платформу для изучения надпочечников стероидогенеза, но также могут применяться к исследованию воспалительных заболеваний.
Важнейшие шаги в настоящем протоколе пищеварения надпочечников и контроль загрязнения. Таким образом контроль времени пищеварение, физической силы всасывания и наблюдение на уровне ткани пищеварение очень важны для выживания клетки. Кроме того метод резки кожи и изолировать надпочечников также значительна. Всегда опускайте все документы в 70% этанола для предотвращения загрязнения, шерсти животных. Для того чтобы получить больше клеток, всасывания частоты должны контролироваться менее чем десять раз во время каждого всасывания. Кроме того, если состояние тканей не хорошо для дальнейшие шаги, инкубации в коллагеназы содержащих среднего не должно быть длиннее 30 мин.
Потому что надпочечники крыс малы, слой glomerulosa могут быть потеряны во время пилинга капсула надпочечника. Доказано, что деинкапсуляции привели к удалению капсулой соединительной ткани и весь zona glomerulosa18. Надпочечных желез самцов крыс меньше, чем у самок. Кроме того липидного капель, как представляется, больше в 11 week-old мышей женского или мужского пола6. Что касается доступных клетки самок крыс может быть хорошим выбором для экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом от Тайваня Совета национальной науки (NSC102-2320-B-037-008-MY3) и национальной Ченг Кунг университет больницы исследовательский грант (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
