Summary
Das Hormon der Nebennierenrinde sezerniert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultur der primären Ratte Nebenniere Zellen. Es könnte eine gute in-vitro-Plattform für die Untersuchung der Mechanismen des Reagens des Interesses an Nebennieren Steroidgenese und Lipid-Biosynthese.
Abstract
Das Hormon, das die Nebennierenrinde sondert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Die hier beschriebene Methode ist das Verfahren der primären kultivierte Ratte Nebennieren Zellen und damit verbundenen funktionellen Assays (Immunfluoreszenz Färbung des Lipid Droplet Oberfläche Protein sowie Corticosteron Analyse). Im Gegensatz zu einem in-vivo Modell die Variation der Interexperiments in den Nebennieren Monolayer-Kulturen ist weniger und die Versuchsbedingung ist einfach zu steuern. Außerdem ist die Quelle der Ratten auch stabiler als andere Tiere, wie Rinder sind. Es gibt auch mehrere menschliche Nebenniere Zelllinien (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.), die in den Nebennieren Studien verwendet werden können. Steroide Produktion dieser Linien wird jedoch noch von zahlreichen Faktoren ab, darunter Serum Lot-Nummer, Passagenanzahl, Mutant/Verlust von unterschiedlichen Genen, etc. beeinflusst werden. Mit Ausnahme 17α-Hydroxylase fehlt, ist die Primärkultur Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen eine bessere und bequemere Technik zur Untersuchung der Nebennieren Physiologie. Zusammenfassend lässt sich sagen könnte primäre Ratte Nebennieren Kulturen eine gute in-vitro-Plattform für Forscher, die Mechanismen des Reagens des Interesses an der Nebenniere System zu untersuchen.
Introduction
Das endokrine System ist verantwortlich für die Regulierung der physiologischen Aktivitäten und Homöostase1. Nebennieren befindet sich am kranialen Pol der Nieren sind eine der wichtigsten endokrinen Organe die Mineralocorticoids, Glukokortikoide und Androgen2,3absondern. Es gibt zwei Teile der Nebenniere: den Cortex und die Medulla. Die Nebennierenrinde besteht aus drei Schichten: die äußere Glomerulosa, fortgeschrittene Fasciculata und die innere Reticularis3. Zona Glomerulosa ist die ursprüngliche absondert Aldosteron, ein Mineralocorticoid, das hilft bei brachliegender Natrium-Ion und Wasser in den Nieren-3. Die Zona Fasciculata produziert in erster Linie eine basale Ebene von Glukokortikoiden im normalen physiologischen Bedingungen3. Corticosteroide bei Nagetieren und Cortisol in den Menschen handeln, um den Körper im Umgang mit Stress zu unterstützen, durch die Regulierung der Blut-Glukose-3. Zu einem gewissen Grad können sie hemmen Entzündungsreaktionen und regulieren das Immunsystem4,5. Im Gegensatz zu anderen Säugetieren, Mäuse und Ratten haben Sie keine funktionelle Zona Reticularis aufgrund des Fehlens eines 17α-Hydroxylase Ausdrucks in der Nebenniere6,7. Nebennieren von Mäusen und Ratten sind somit frei von der Sekretion der Nebennieren c-19 Steroide (Cortisol und adrenalen Androgene).
Primäre kultivierte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen haben gezeigt, für die Untersuchung von Mechanismen, die Steuerung der Nebennieren Physiologie8nützlich sein. Wie andere steroidogenic Gewebe synthetisiert jeder Nebennieren Zone seine Steroide aus freie Cholesterin9. Nach adrenokortikotropes (ACTH) Hormonstimulation das freie Cholesterin wird aus dem Zusammenbruch Lipid Tröpfchen entlassen und steigert somit, Steroid Produktion in den Fasciculata und Reticularis10.
Viele Gruppen haben versucht, stabilen Zelllinien von NNR-Karzinome herzustellen. Jedoch haben einige Bedenken die Verwendung von Nebennierenrindeninsuffizienz Zelllinien in Vitro Modelle8begrenzt. Die Steroiden Antworten der Zell-Linien können zwischen Passagen, die Lot-Nummer von Serum und die Qualität des Serum usw. abweichen. Darüber hinaus absondern kommerzielle Nebennieren Zelllinien (Y1 und SW13) nicht Corticosteron, erschwert die Nebennieren Steroidgenese8zu studieren. Verwendung von Rindern und Pferden Nebennieren als ex Vivo Modelle eine gute Wahl sein können obwohl Gewebe aus diesen Märkten einige unbekannten Risiken verdecken können. Im Vergleich zu ihnen, Geschäftsführer Ratte Nebennieren ist einfacher und die Quelle ist relativ stabiler und Pathogen-freies. Zusammen genommen, das vorliegende Verfahren hier beschriebenen ließe sich den damit verbundenen Mechanismus der Corticosteron Synthese in Ratte Nebennieren Fasciculata Zellen zu untersuchen.
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Protocol
Alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen wurden von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Kaohsiung Medical University genehmigt.
(1) experimentelle Verfahren
- Die Erwachsenen (8 bis 12 Wochen alten) weiblich/männlich SD Ratten durch CO2 Euthanasie zu opfern.
- 70 % Ethanol und lassen Sie es in die Haut aufgesogen werden, und wischen Sie dann die Haut mit einem Papiertuch.
- Setzen Sie die Ratte auf eine saubere Kunststoffplatte in die Rückenlage.
- Heben Sie die Haut mit "externen" gebogenen Pinzette an der Mittellinie und führen Sie eine stumpfe Dissektion durch die Schaffung einer "Y" Form (von der Höhe der Oberschenkel auf den subcostal Winkel).
- Spülen Sie Schere mit 70 % Ethanol, und dann schneiden Sie die Muskeln, auch die Schaffung einer "Y" Form.
-
Die linke Nebenniere hinter dem Magen zu finden.
Hinweis: der rechten Nebenniere finden Sie tief hinter der Leber.- Verwenden Sie ein paar Zangen, heben Sie die Magen oder Leber und die Nebennieren mit einem anderen gebogenen Pinzette zu isolieren.
- Entfernen Sie nachdem man die Nebennieren in eine sterile Schale vorsichtig die Nebenniere Kapsel mit feinen Pinzette.
- Mit einer feinen Schere, die Nebennieren klein geschnitten mit einem kleinen bisschen serumfreien Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) / F-12 Medium.
-
Bereiten Sie drei verschiedene Pore Größe Pasteur Mehrkanalpipette vor und verwenden Sie die erste Pasteur pipettieren, um die Nebennieren Stücke in ein 50 mL konische Röhrchen mit Medium mit Kollagenase II (~0.5–0.8 mg/mL) abzusaugen.
- Sanft Stück das Gewebe genannte ca. 10 X. Verwenden Sie den Rest der Mehrkanalpipette und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Stücke kleiner geworden.
Hinweis: Die verschiedenen Porengrößen von Pasteur Mehrkanalpipette können erstellt werden, durch das Heizen sie mit dem Feuer. Die ersten Pipettieren ist die ursprüngliche Größe (ca. 1 mm), die Porengröße der zweite ist ca. 0,8 mm und die dritte Pasteur Pipettieren ist ca. 0,5 mm. Während der Verdauung werden die Stücke der Nebennieren kleiner geworden. So können über das mechanische Verfahren, die Nebennieren verdaut werden mehr abgeschlossen. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad (bei 37 ° C) und schütteln Sie sie alle 5 min. 4 X insgesamt.
- Sanft Stück das Gewebe genannte ca. 10 X. Verwenden Sie den Rest der Mehrkanalpipette und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Stücke kleiner geworden.
- Fügen Sie nach 20 min Inkubation frische und kühle Medium (sechsfache Volumen; z. B. 5 mL Gewebe + 25 mL cool DMEM/F-12 Medium) mit 2,5 % fötalen Rinderserum (FBS) und 5 % Pferd Serum, die Enzym Wirkung zu stoppen.
- Sammeln Sie die Zelle Pellets durch Zentrifugation bei 800 X g für 10 Minuten.
- Fügen Sie einem entsprechenden Volumen des Mediums, die Zellen auszusetzen.
Hinweis: Jede Drüse machen ca. ~ 3 x 105 bis ~ 4 x 105 Zellen. - Platte die Zellen im gewünschten Platten oder Gerichte mit Wachstumsmedium (1:1 [V/V] Mischung aus DMEM und Hams f-12 Medium, ergänzt mit 25 mM HEPES und 1 % Penicillin und Streptomycin) Übernachtung (Tag 0) bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung von 95 % Luft und 5 % CO2.
Hinweis: In der Regel Platte wir Zellen in 24-Well-Platten (vier Drüsen/Platte) für die Corticosteron-Assay und in 35 mm Gerichte (eine Drüse/ca. ein bis zwei Gerichte) für Western blot Analyse. - Waschen Sie sorgfältig die Zellen 2 X mit warmen serumfreien DMEM/F-12 Medium (Tag 1). Das neue Wachstumsmedium zu ersetzen.
- Die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung von 95 % Luft und 5 % CO2 bis 3. Tag beibehalten.
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Representative Results
Verwendung des beschriebenen Verfahrens hier, könnte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop (Abbildung 1A) primäre kultivierte Nebenniere Zellen unterschieden werden. Zur weiteren Bestätigung, dass die Vesikel innerhalb Zytoplasma Lipid Tröpfchen sind, konnte die Immunfluoreszenz-Färbung des adipösen Differenzierung-related Protein (ADRP) am Tag 3 Kulturen (Abbildung 1 b) durchgeführt werden. Zellen wurden auf der Glasdeckgläser angebaut. Die Zellen wurden dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach dem waschen dreimal mit PBS, die Zellen wurden blockiert und permeabilized mit 0,1 % Triton x-100 in 5 % Magermilch. Der Primärantikörper ADRP 5 % Magermilch verdünnt (01:50) wurde und wurde über Nacht inkubiert. Nach dreimal von PBS waschen, die Zellen mit Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1: 100) inkubiert wurden. Nach Wiederholung der Waschschritte, die Zellen wurden mit Gold Antifade verlängern Eindeckmedium montiert und wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Darüber hinaus konnte der Hormon-produzierende Fähigkeit der Ratte Nebennieren Zellen von Corticosteron Assay ermittelt werden. Stimulation von ACTH auf Ratte Nebennieren Zellen dienen als Positivkontrolle (Abbildung 1). Die gesammelten Medien wurden verdünnt und untersucht für Corticosteron Inhalt, nach dem Verfahren von Chen Et Al.11beschrieben.
Abbildung 1: Charakterisierung der Nebenniere Zellen und die Corticosteron Reaktion auf ACTH Behandlung. (A) Phasenkontrast-Bild von Tag 3 primäre kultivierte Ratte Nebennieren Zellen. (B) ADRP Färbung wird angezeigt. (C) Tag-3 kultivierte Ratte Nebennieren Zellen wurden behandelt mit ACTH (13:00 und 1 nM) für 6 h. Die Medien wurden gesammelt und bis zur Verwendung im Kühlschrank-80 ° C gelagert. Corticosteron Ebenen wurden durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Nebennieren spielen eine Schlüsselrolle in umweltgerechte Anpassung3. Das Hormon der Nebennierenrinde, sondert kann regulieren und Einstellen von physiologischen Funktionen und Homöostase3. Die in-vivo Modell spiegelt die realen physiologischen Wirkungen im Körper. Allerdings ist es noch von vielen komplexen Faktoren verursachen instabile Auswirkungen in Experimenten geprägt. Im Gegensatz dazu hat die in-vitro-Zellmodell Vorteile, wodurch es unvergleichlich zu Tiermodell. Erstens ist der Umweltbedingungen im in-vitro-System leicht zu kontrollieren. Hormone sind wahrscheinlich jeder Impuls betroffen zu sein. In vivo Experimente führen in der Regel in einer unspezifischen Reaktion, da Tiere anfällig für Stress sind. Zweitens die Stoffe sind nicht leicht zu überwachen, im Körper aber haften im kultivierten System. Drittens reduziert die in-vitro-System die Abweichungen zwischen den einzelnen unabhängigen Experiment. Viele wissenschaftliche Berichte zeigen Nährmedien Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen mit 10 – 20 % FBS12,13,14,15, während das Protokoll hier präsentiert 5 % FBS und 2,5 % Pferd Serum verwendet, um beizubehalten das Wachstum der Nebennieren Zellen bis zu einer Woche.
Steroidgenese wird aus der Spaltung der freien Cholesterin durch Cytochrom P450-Seitenkette Spaltung Enzyme gestartet. Wie in Abbildung 1ABgezeigt, Nebenniere Zellen weisen zahlreiche und unterschiedliche Größen der Lipid-Tröpfchen, was darauf hindeutet, es ist ein gutes Werkzeug für die Untersuchung von Steroid Biosynthese und/oder Lipid Biologie (Fasciculata Zellen haben Prominente und größeren Lipid Tröpfchen)1,3. ADRP, auch bekannt als Perilipin 2, ist ein Lipid Droplet Oberfläche Protein, das hilft, bei der Lagerung von neutralen Lipiden in der Lipid-Tröpfchen-16. Aufgrund NNR Zellen ausstellenden eine Menge an Lipid, das ADRP (oder anderen Lipid Droplet Oberflächenproteine, wie Perilipin) kann verwendet werden, um zu prüfen, ob die getesteten Agenten Hormon Synthese16beeinflussen.
Das Wachstum und die Funktion der Nebennieren werden durch hypothalamische corticotropic-releasing Hormon Hypophyse ACTH, Neuropeptide, Neurotransmitter und Wachstumsfaktoren, etc.17streng kontrolliert. Abbildung 1 zeigt, dass Corticosteron Produktion von ACTH Behandlung in einer Konzentration abhängig Mode deutlich induziert wurde. Darüber hinaus ACTH an 13:00 und 1 nM stimuliert die Corticosteron Produktion ca. 30- und 70-fold, beziehungsweise. Es wurde nachgewiesen, dass Tag-3 kultivierte primäre Nebenniere-Zellen eine bessere Reaktion auf ACTH Stimulation15aufweisen. Dies ist auch der Grund, warum Tag3 Kultur in der vorliegenden Studie verwendet wurde. Darüber hinaus ist die Messung von Corticosteron durch ELISA-Kit auch ein einfaches und einfaches Werkzeug für die Forschung. Also die primäre kultivierte Ratte Nebennieren Zellen nicht nur eine Plattform für das Studium der Nebennieren Steroidgenese; gelten auch für die Untersuchung von entzündlichen Erkrankungen
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind die Verdauung von den Nebennieren und Kontrolle der Verschmutzung. Kontrolle über die Dauer der Verdauung, körperliche Saugkraft und Beobachtung von Gewebe Verdauung Ebene sind daher sehr wichtig für das Überleben der Zelle. Darüber hinaus ist die Methode der Schneiden Sie die Haut und die Nebennieren zu isolieren auch erhebliche. Immer tauchen Sie alle Instrumente in 70 % igem Ethanol um jegliche Kontamination durch Fell der Tiere zu verhindern. Um weitere Zellen zu erhalten, sollte die Absaugung Frequenz weniger als zehn Mal während jeder Absaugung kontrolliert werden. Auch, wenn der Zustand des Gewebes ist nicht gut für weitere Schritte, die Inkubation in Kollagenase-haltigen Medium sollte nicht länger als 30 Minuten.
Da die Nebennieren von Ratten klein sind, die Glomerulosa Schicht während des Peelings der Nebennieren Kapsel möglicherweise verloren. Es wurde nachgewiesen, dass Delamination bei der Entfernung von Bindegewebe Kapsel und die gesamte Zona Glomerulosa18geführt. Die Nebennieren von männlichen Ratten sind kleiner als die weiblichen Ratten. Darüber hinaus scheinen die Lipid-Tröpfchen in 11 Wochen alten weiblichen oder männlichen Mäusen6größer sein. Hinsichtlich der verfügbaren Zellen möglicherweise weibliche Ratten eine gute Wahl für Experimente.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Science Council Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) und eine National Cheng-Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
