Summary
副腎皮質から分泌されるホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここでは、プライマリのラットの文化にプロトコル副腎細胞を提案します。副腎ステロイド生合成機能と脂質生合成に興味の試薬のメカニズムを調査するための良い生体外のプラットフォームかもしれない。
Abstract
副腎皮質が分泌するホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここで説明する方法は、初代培養ラット副腎細胞および関連機能アッセイ (コルチコステロンの分析と同様、脂質液滴表面蛋白質の蛍光抗体染色) の手順です。体内のモデルとは異なり副腎単層培養で interexperiments のバリエーションが少なく、実験条件がコントロールしやすい。その上、ラットのソースは牛のもののような他の動物よりも安定も。副腎研究で使用することができますいくつかのひと副腎細胞株 (NCI H295、NCI H295R、SW13 等) もあります。ただし、これらの行のステロイドの生産は血清のロット番号、通路番号、個別の遺伝子などの変異/損失を含む多数の要因によっては影響も。17 α-ヒドロキシラーゼを欠けているを除いてラット副腎皮質細胞の初代培養は副腎の生理学を研究のためのより良いより便利な技術です。要約すると、初代ラット副腎文化副腎システムに関心の試薬のメカニズム解明のための研究者の良い体外プラットフォームとなる可能性があります。
Introduction
内分泌系は生理学的な活動と恒常性1の調節を担当です。腎臓の頭蓋の極に位置する副腎、ミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、アンドロゲン2,3を分泌する主な内分泌器官の一つです。副腎の 2 つの部品がある: 皮質と髄質。副腎皮質は 3 層で構成されています: 外側の球状、中間皮質および内部の斑3。球状はアルドステロン、ナトリウム イオンと3腎臓の水再吸収を助ける鉱質コルチコイドの分泌元のサイトです。ゾナ副腎皮質は主に通常の生理条件3のグルココルチコイドの基底レベルを生成します。齧歯動物の副腎皮質ステロイドと人間のコルチゾール血ブドウ糖3を調節することによってストレスに対処で体を支援するために行動します。ある程度、炎症反応を抑制する、免疫システム4,5を規制できます。他の哺乳類、マウス、ラットと対照をなして副腎6、7の 17 α-ヒドロキシラーゼ式の不足のための機能的な網状を必要はありません。したがって、マウスおよびラットの副腎、副腎の C-19 ステロイド (コルチゾール、副腎男性ホルモン) の分泌を欠いています。
副腎皮質培養細胞副腎生理8を制御するメカニズムを調査するために有用であることが示されています。他のステロイド ホルモン産生組織のような各副腎ゾーンは遊離型コレステロール9からそのステロイドを合成します。刺激による副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、遊離コレステロールは内訳脂質液滴から解放され、したがって、副腎皮質、皮斑10でステロイドの産生を促進します。
多くのグループは、副腎皮質癌から安定したセルラインを確立しようとしています。ただし、いくつかの懸念には、副腎皮質細胞の生体外モデル8のように使用が限られています。細胞のステロイドの応答は通路、血清のロット番号と血清等の品質が異なる場合があります。さらに、商業の副腎細胞株 (Y1 と SW13) は副腎ステロイド生合成の8を研究することが難しく、コルチコステロンを分泌しません。前のヴィヴォ モデルは良い選択をすることができるこれらの市場からの組織は、いくつかの未知のリスクをぼやける場合がありますにもかかわらず、牛と馬の副腎を使用してください。それらに比べると、ラット副腎の管理が簡単で、ソースが比較的安定していてより病原体フリーします。一緒に取られて、ここで説明した本法は、ラット副腎皮質細胞におけるコルチコステロン合成の関連のメカニズムを調査する使用できます。
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Protocol
動物科目を含むすべてのプロシージャは、制度的動物のケアと使用高雄医科大学委員会によって承認されています。
1. 実験手順
- CO2安楽死によって大人 (12 週齢に 8) 女性/男性 SD ラットを犠牲に。
- 70% エタノールを適用させ、皮膚に吸収されると、その後、ティッシュ ペーパーで拭き取る。
- ラットを仰臥位できれいなプラスチック プレートにつけます。
- 正中線で「外部」カーブタイプ鉗子で皮膚を持ち上げ、鈍的切離を実行 (大腿部弓下角度をレベル) から「Y」の形を作成。
- はさみ 70% エタノールでリンス、切っても「Y」の形を作成する筋肉。
-
胃の後ろに左副腎を見つけます。
注:右副腎は肝臓の後ろに深く見つけることができます。- 胃や肝臓を持ち上げて、別のカーブタイプ鉗子で副腎を分離する鉗子の 1 つのペアを使用します。
- 副腎を滅菌の皿に入れて後、微細鉗子で副腎のカプセルを慎重に取り外します。
- 少し小さな断片に副腎をカットするはさみの繊細なペアは、無血清ダルベッコのビットのイーグル培地 (DMEM)、変更された/F-12 媒体。
-
3 つの異なる細孔サイズ パスツール pipets を準備し、コラゲナーゼ II (~0.5–0.8 mg/mL) と媒体を含んでいる 50 mL の円錐管に副腎のすべての部分を吸引する最初のパスツール ピペットを使用します。
- そっとティッシュをカップ刻んだ個の約 10 倍。Pipets の残りの部分を使用して、すべてのピースが小さくなるまで上記の手順を繰り返します。
注: パスツール pipets の異なる細孔径は、火にそれらを加熱することによって作成できます。最初のピペットはオリジナル サイズ (約 1 mm)、2 つ目の気孔のサイズは、約 0.8 mm、3 番目のパスツール ピペットは約 0.5 mm。消化中、副腎の部分は小さくなっていきます。したがって、機械的手順を介して、副腎は完成品より消化することができます。(37 ° C) で水浴のチューブを孵化させなさい、振って 5 分毎に、合計で 4 倍。
- そっとティッシュをカップ刻んだ個の約 10 倍。Pipets の残りの部分を使用して、すべてのピースが小さくなるまで上記の手順を繰り返します。
- 20 分インキュベーション後、新鮮でクールな媒体 (六倍ボリューム; たとえば、組織の 5 mL + クールな DMEM/F-12 媒体の 25 mL) 含む 2.5% ウシ胎児血清 (FBS) と 5% 馬血清酵素効果を停止するを追加します。
- 800 x gで 10 分間遠心分離によって細胞ペレットを収集します。
- セルを中断する媒体の適切な量を追加します。
注:各腺は約 3 〜 10 x を行うことができます5 〜 105セル × 4。 - 培地で必要な版または皿の細胞をプレート (25 mM HEPES と 1% ペニシリンとストレプトマイシン添加 DMEM とハムの F-12 媒体の 1:1 [v/v] 混合物) で 37 ° C、95% 空気と 5% CO2の加湿環境昨夜 (0 日)。
注: コルチコステロンの試金のため 24 ウェル プレート (4 腺/プレート) で細胞をプレート私たち通常、および 35 mm 料理 (料理 1 つ腺/約 1 ~ 2) 西部のしみ分析。 - 慎重に洗浄セル 2 無血清温かい DMEM/F-12 媒体 (1 日目) と x。新しい成長培地を交換してください。
- 3 日目まで 95% 空気と 5% CO2の加湿環境で 37 ° C で細胞を維持します。
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Representative Results
ここで説明する手順を使用して、(図 1 a) 位相差顕微鏡下で培養副腎細胞を識別できた。脂質を細胞質内小胞に、ことを確認、脂肪分化関連蛋白質 (ADRP) の免疫組織染色法は (図 1 b) 一日 3 文化の実施でした。セルはガラス coverslips に育った。セルは、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗浄され、4% パラホルムアルデヒドで固定します。PBS 洗浄 3 回後、細胞ブロックされたとグリセリン 0.1% と 5% の乳脂肪のトリトン X-100.一次 ADRP 抗体希釈 (1:50) は、5% の乳脂肪と一晩インキュベートしました。後 3 回 PBS 洗浄のセルを添加してヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488 二次抗体 (1: 100)。洗浄のステップを繰り返し後、細胞延長金 Antifade メディアをマウントがマウントされた、蛍光顕微鏡下で検討しました。また、ラット副腎細胞のホルモン産生能は、コルチコステロン アッセイによって決定でした。ラット副腎細胞 ACTH の刺激は、肯定的な制御 (図 1) として勤めるかもしれません。収集したメディアは希釈され、陳ら11で説明されている手順に従って、コルチコステロン コンテンツの試金。
図 1: 副腎細胞および ACTH 治療に対するコルチコステロン反応の特性。(A) 日 3 初代培養ラット副腎細胞の位相差画像。(B) ADRP 染色が表示されます。(C) 日 3 培養ラット副腎細胞が扱われた ACTH と (13 と 1 nM) 6 時間。メディアは、収集され、使用まで-80 ° C の冷蔵庫に保管されます。コルチコステロン レベルは、酵素免疫測定法 (ELISA) により測定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
副腎は、環境適応3で重要な役割を再生します。副腎皮質が分泌するホルモンは、規制し、生理機能と恒常性3を調整できます。生体内でのモデルには、体の本当の生理効果が反映されます。しかし、それはまだ実験で不安定な影響を引き起こしている多くの複雑な要因に影響されます。対照的に、培養細胞モデルでは利点がある動物モデルに比類のないになります。まず、環境条件は、in vitro システムでコントロールしやすいです。ホルモンは、任意の刺激の影響を受ける可能性があります。動物が苦痛になりやすいために、生体内の実験は通常非特異的な反応になります。第二に、物質は体内を監視するため容易ではないが培養システムに責任を負う。第三に、体外のシステムは、それぞれ独立した実験の差異を低減します。多くの科学的なレポート表示プロトコルがここで提示に対し 10-20% FBS12,13,14,15, を含む副腎皮質細胞の培地を維持する 5% 2.5% と FBS 馬血清を使用して、1 週間副腎細胞の成長。
ステロイド生合成機能は、チトクローム P450 側鎖切断酵素によって遊離型コレステロールの胸の谷間から開始されます。図 1 a, Bに示すように、副腎の細胞を多数示すし、脂質小滴、それを示唆してのさまざまなサイズはステロイドの生合成や脂質の生物学の調査のための良いツール (副腎皮質細胞がある顕著で、大きな脂質液滴)1,3。ADRP、別名 perilipin 2、中性脂質脂質液滴16内のストレージに役立ちます脂質液滴表面蛋白質であります。副腎皮質細胞の脂質、ADRP (または他脂質液滴表面蛋白質、perilipin のような) 量を示すためテスト エージェントに影響を与えるホルモン合成16かどうかを確認する使用することができます。
成長と副腎の機能は視床下部のコルチコトロピン放出ホルモンと下垂体の ACTH、神経ペプチド、神経伝達物質、成長因子など17によって厳しく制御されています。図 1では、ACTH 濃度依存的治療による大幅コルチコステロン生産ことを明らかにします。さらに、13 で ACTH と 1 nM 刺激コルチコステロン生産約 30 - と 70-fold、それぞれ。それは、日 3 プライマリ副腎細胞が ACTH 刺激15に良い反応を示すことが実証されています。これはまた、なぜ日 3 文化は本研究で使用された理由です。さらに、ELISA キットによってコルチコステロンの測定はまた研究のためのシンプルで簡単なツールです。したがって、初代培養ラット副腎細胞だけでなく副腎ステロイド生合成機能を研究するためのプラットフォームを提供、炎症関連疾患の調査にも適用します。
現在のプロトコルの重要なステップは、副腎の消化と汚染のコントロールです。したがって、消化時間、物理的な吸引力と組織分解レベルの観察の制御、細胞の生存にとって非常に重要。さらに、皮膚を切ると副腎を分離する方法はまた重要です。常に動物の毛皮によって任意の汚染を防ぐために 70% エタノールですべての楽器を浸します。多くの細胞を得るために吸引の頻度各吸引中に、10 回未満を可能する必要があります。また、組織の条件が適していない場合さらに手順は、コラゲナーゼを含むで潜伏中は 30 分より長くなりません。
ラットの副腎は、小さいため球状層は副腎の被膜の剥離中に失われたことがあります。それは、そのカプセル化解除結果の結合組織の被膜と全体ゾナ球状18除去実証されています。雄ラットの副腎、雌ラットのものよりも小さくなります。さらに、脂質のしぶきは 11 週齢女性または男性マウス6で大きくなるように表示されます。利用可能なセルについて雌ラットの実験のための良い選択があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国家科学審議会台湾 (NSC102-2320-B-037-008-MY3) と国立チェン Kung 大学病院研究助成 (NCKUH-10102045) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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