Summary
O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.
Abstract
O hormônio que segrega o córtex adrenal é vital para os animais contra estresse e doenças. O método descrito aqui é o procedimento de células adrenais primários rato culta e relacionados ensaios funcionais (mancha da imunofluorescência de proteína gotículas lipídicas, bem como análise de corticosterona). Ao contrário de um modelo in vivo, a variação de interexperiments em culturas de monocamada adrenal é menor e a condição experimental é fácil de controlar. Além disso, a fonte de ratos também é mais estável do que outros animais, como bovinos ones. Existem também várias linhas de célula humana adrenal (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc) que podem ser usadas em estudos de adrenais. No entanto, a produção de esteroides dessas linhas será ainda influenciada por inúmeros fatores, que incluem o número de lote de soro, número de passagem, mutante/perda de genes distintos, etc. Exceto por falta de 17α-hidroxilase, a cultura primária de células de rato adrenocortical é uma técnica melhor e mais conveniente para estudar fisiologia renal. Em resumo, culturas adrenal primária rato poderiam ser uma boa plataforma in vitro por pesquisadores investigar os mecanismos do reagente de interesse no sistema de glândula adrenal.
Introduction
O sistema endócrino é responsável pela regulação de atividades fisiológicas e homeostase1. Glândulas supra-renais localizadas no polo cranial dos rins são os principais órgãos do sistema endócrino que segregam mineralocorticoides, glicocorticoides e androgênios2,3. Há duas partes distintas da glândula supra-renal: o córtex e a medula. O córtex adrenal consiste em três camadas: o exterior glomerulosa, fasciculada a intermediário e o reticular interno3. A zona glomerulosa é o site original secretando de aldosterona, um mineralocorticoide, que auxilia na reabsorvendo o íon de sódio e água nos rins3. A zona fasciculada principalmente produz um nível basal de glicocorticoides em condições fisiológicas normais3. Corticosteroides em roedores e cortisol em humanos agir para ajudar o corpo em lidar com o estresse, regulando a glicose de sangue3. Em certa medida, eles podem inibir respostas inflamatórias e regular o sistema imunológico4,5. Em contraste com outros mamíferos, camundongos e ratos não têm um funcional zona reticular devido à falta de uma expressão de 17α-hidroxilase na glândula adrenal6,7. Assim, as glândulas supra-renais de camundongos e ratos são desprovido de secreção de esteroides adrenais de C-19 (cortisol e andrógenos adrenais).
Culturas de células adrenocortical primárias foram mostradas para ser útil para investigar mecanismos controlando a fisiologia renal8. Como outros tecidos esteroidogênica, cada zona adrenal sintetiza seus esteroides de colesterol livre9. Após estimulação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), o colesterol livre é liberado de gotículas lipídicas de repartição e, assim, aumenta a produção de esteroides na10fasciculada e reticular.
Muitos grupos têm tentado estabelecer linhas de célula estável de carcinomas de adrenocortical. No entanto, várias preocupações têm limitado a utilização de linhas de célula adrenocortical, como na vitro modelos8. As respostas de esteroides de linhas celulares podem diferir entre passagens, número de lote do soro e a qualidade do soro, etc. Além disso, linhas de células adrenais comercial (Y1 e SW13) não secretam corticosterona, tornando mais difícil para estudar a esteroidogênese adrenal8. Bovinas e equinos supra-renais usando como ex vivo modelos podem ser uma boa escolha, mesmo que os tecidos de nesses mercados podem obscurecer alguns riscos desconhecidos. Comparado a eles, gerenciar as glândulas supra-renais do rato é mais fácil e a fonte é relativamente mais estável e isentos de agentes patogénicos. Tomados em conjunto, o presente método descrito aqui pode ser usado para investigar o mecanismo relacionado da síntese de corticosterona em células adrenais fasciculata de rato.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Kaohsiung médica da Universidade.
1. procedimento experimental
- Sacrifica os ratos de SD fêmea/macho adulto (8 a 12 semanas de idade) por eutanásia de CO2 .
- Aplicar o etanol a 70% e deixá-lo ser absorvido pela pele e em seguida, limpe a pele com um papel absorvente.
- Coloque o rato em um prato plástico limpo na posição supina.
- Levantar a pele com pinças curvas "externas" na linha e executar uma dissecção romba, criando uma forma de "Y" (do nível da coxa para o ângulo subcostal).
- Enxágue a tesoura com etanol a 70% e, em seguida, cortar o músculo, criando também uma forma de "Y".
-
Encontre a glândula adrenal esquerda atrás do estômago.
Nota: a supra-renal direita encontram-se profundamente atrás do fígado.- Use um par de pinças para levantar o estômago ou fígado e isolar as supra-renais com outra pinça curvada.
- Depois de colocar as glândulas adrenais em um prato estéril, remova cuidadosamente a cápsula supra-renal com pinça fina.
- Com um delicado par de tesouras, cortar as supra-renais em pedaços pequenos com um pouco de soro livre Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) / F-12 médio.
-
Preparar três pipetas Pasteur de poro de tamanho diferentes e use a primeira pipeta Pasteur para aspirar todas as peças de adrenais em um tubo cônico de 50 mL contendo meio com colagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Delicadamente, Triture os pedaços de tecido cerca de 10x. Use o resto das pipetas e repita os passos acima até que todas as peças tornam-se menores.
Nota: Os tamanhos diferentes do pore das pipetas Pasteur podem ser criados por aquecimento com fogo. A primeira pipeta é o tamanho original (cerca de 1 mm), o tamanho dos poros do segundo é de cerca de 0,8 mm, e a terceira pipeta Pasteur é cerca de 0,5 mm. Durante a digestão, as peças da adrenal se tornará menores. Assim, através do procedimento mecânico, as supra-renais podem ser digeridas mais completo. Incubar o tubo em um banho de água (a 37 ° C) e agite-a cada 5 min, 4x no total.
- Delicadamente, Triture os pedaços de tecido cerca de 10x. Use o resto das pipetas e repita os passos acima até que todas as peças tornam-se menores.
- Após a incubação de 20 min, adicione meio fresco e fresco (sêxtupla volume; por exemplo, 5 mL de tecido + 25 mL de meio legal de DMEM/F-12) contendo 2,5% bovina soro fetal (FBS) e 5% de soro de cavalo para parar o efeito da enzima.
- Recolha as pelotas de célula por centrifugação a 800 x g durante 10 minutos.
- Adicione um volume adequado de meio para suspender as células.
Nota: Cada glândula pode fazer cerca de 3 ~ x 105 ~ 4 x 105 células. - As células em chapas desejadas ou pratos da placa com meio de cultura (mistura 1:1 [v/v] do meio de F-12 DMEM e do presunto, suplementado com 25mm HEPES e 1% penicilina e estreptomicina) durante a noite (dia 0) a 37 ° C, em um ambiente umidificado de 95% de ar e 5% CO2.
Nota: Normalmente, nós chapear células em placas de 24 poços (quatro glândulas/placa) para o ensaio de corticosterona e em 35 milímetros pratos (uma glândula/aproximadamente um ou dois pratos) para western blot análise. - Lavar cuidadosamente as células 2 x com isento de soro morno meio DMEM/F-12 (dia 1). Substitua o novo meio de crescimento.
- Manter as células a 37 ° C, em um ambiente umidificado de 95% de ar e 5% CO2 até dia 3.
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Representative Results
Usando o procedimento descrito aqui, o principais culturas células adrenais poderiam ser distinguidas sob um microscópio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar que as vesículas no citoplasma são gotículas lipídicas, a mancha da imunofluorescência de proteínas relacionadas com diferenciação adiposa (ADRP) pode efectuar-se dia-3 culturas (figura 1B). As células foram cultivadas sobre as lamelas de vidro. As células foram lavadas três vezes com tampão fosfato salino (PBS) e corrigidas com paraformaldeído 4%. Depois de lavar três vezes com PBS, as células foram bloqueadas e permeabilizado com 0,1% Triton X-100 no leite desnatado 5%. O anticorpo primário de ADRP foi diluído (01:50) em 5% de leite desnatado e foi incubado durante a noite. Após três vezes de lavagem PBS, as células foram incubadas com cabra anticoelho Alexa Fluor 488 secundário os anticorpos (1: 100). Depois repetindo as etapas de lavagem, as células foram montadas com meio de montagem de prolongar ouro Media e foram examinadas ao microscópio de fluorescência. Além disso, a capacidade de produção de hormônio das células adrenais rato poderia ser determinada por ensaio de corticosterona. Estimulação de ACTH em células adrenais rato poderia servir como um controle positivo (Figura 1). A mídia coletada foram diluída e analisada para conteúdo de corticosterona, de acordo com o procedimento descrito por Chen et al.11.
Figura 1: A caracterização das células adrenais e resposta ao tratamento de ACTH corticosterona. (A) imagens de contraste de fase de células adrenais rato culta primário do dia-3. (B) ADRP coloração é mostrado. (C) dia-3 células adrenais rato cultivadas foram tratadas com ACTH (13:00 e 1 nM) para 6 h. Os meios de comunicação foram coletados e armazenados em um refrigerador-80 ° C até o uso. Os níveis de corticosterona foram medidos por ensaio imunoenzimático (ELISA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Glândulas supra-renais desempenham um papel chave na adaptação ambiental3. O hormônio pelo qual o córtex adrenal secreta pode regular e ajustar as funções fisiológicas e homeostase3. O modelo in vivo reflete os efeitos fisiológicos real no corpo. No entanto, ainda é influenciado por muitos fatores complexos, causando efeitos instáveis em experimentos. Em contraste, o modelo de células in vitro tem vantagens que o torna incomparável para o modelo animal. Primeiro, a condição ambiental é fácil de controlar no sistema in vitro. Hormônios são susceptíveis de serem afectadas por qualquer estímulo. Experimentos in vivo geralmente resultam em uma reação inespecífica porque animais são propensos a angústia. Em segundo lugar, as substâncias não são fáceis de controlar no corpo, mas são responsáveis no sistema de culto. Em terceiro lugar, o sistema in vitro reduz os desvios entre cada experimento independente. Muitos relatórios científicos revelam um meios de cultura de células adrenocortical contendo 10%-20% FBS12,13,14,15, Considerando que o protocolo aqui apresentado usa 5% FBS e 2,5% de soro de cavalo para manter o crescimento de células adrenais por até uma semana.
Esteroidogênese é iniciado a partir da clivagem do colesterol livre por enzimas de clivagem da cadeia lateral do citocromo P450. Como mostrado na figura 1AB, células adrenais apresentam numerosas e diferentes tamanhos de gotículas lipídicas, sugerindo é uma boa ferramenta para a investigação da biologia a biossíntese e/ou lipídios esteroide (fasciculada células têm lipídico proeminente e maior 1,de gotículas)3. O ADRP, também conhecido como perilipin 2, é uma proteína de superfície lipídica da gota que auxilia no armazenamento de lipídios neutros dentro o de gotículas lipídicas16. Devido as células adrenocortical exibindo uma quantidade de lipídios, o ADRP (ou outras proteínas superfície da lipídicos da gota, como perilipin) pode ser usado para examinar se os agentes testados afetam a síntese de hormônio16.
O crescimento e a função das glândulas adrenais são estritamente controladas pelo hormônio hipotalâmico liberador de corticotropic e pituitário ACTH, neuropeptídeos, neurotransmissores e fatores de crescimento, etc.17. A Figura 1 revela que a produção de corticosterona foi significativamente induzida pelo tratamento de ACTH de forma concentração-dependente. Além disso, ACTH, às 13:00 e 1 nM estimulou a produção de corticosterona cerca 30 - e 70-fold, respectivamente. Foi demonstrado que o dia-3 pilhas cultivadas adrenais primárias apresentam uma melhor resposta à estimulação de ACTH15. Esta também é a razão porque a cultura do dia-3 foi usada no presente estudo. Além disso, a medição de corticosterona pelo kit de ELISA também é uma ferramenta simples e fácil para pesquisa. Portanto, as células adrenais primários rato culta não só fornecem a plataforma para estudar a esteroidogênese adrenal mas também podem se aplicar para a investigação de doenças inflamatórias-relacionadas.
Os passos críticos no presente protocolo são a digestão das supra-renais e controle de contaminação. Portanto, o controle do tempo de digestão, sucção de força física e observação do nível de digestão do tecido são muito importantes para a sobrevivência da pilha. Além disso, o método de cortar a pele e isolando as supra-renais também é significativo. Sempre imergir todos os instrumentos em etanol a 70% para evitar qualquer contaminação por peles de animais. Para obter mais células, a frequência de sucção deve ser controlada menos de dez vezes durante cada aspiração. Além disso, se a condição dos tecidos não é bom para outras medidas, a incubação em colagenase contendo médio não deve ser superior a 30 min.
Porque as glândulas adrenais de ratos são pequenas, a camada glomerulosa pode ser perdida durante o peeling da cápsula da adrenal. Foi demonstrado que desencapsulamento resultou na remoção da cápsula do tecido conjuntivo e a toda zona glomerulosa18. As glândulas adrenais de ratos machos são menores que as dos ratos fêmeas. Além disso, as gotículas lipídicas parecem ser maiores em 11 semanas de idade masculino ou feminino ratos6. Em relação as células disponíveis, ratos fêmeas podem ser uma boa escolha para experimentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um subsídio da Taiwan Nacional de Conselho de ciência (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e um Nacional Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
