Summary
부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.
Abstract
부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 기본 교양된 쥐 부 신 세포와 관련 된 기능 분석 실험 (corticosterone 분석 뿐 아니라 지질 작은 물방울 표면 단백질, 면역 형광 얼룩)의. Vivo에서 모델과 달리 단층 부 신 문화에 interexperiments의 변이 덜 이며 실험 조건을 제어 하기 쉽습니다. 게다가, 쥐의 소스 소 것 들과 같은 다른 동물 보다 더 안정적 이기도합니다. 또한 부 신 연구에 사용할 수 있는 여러 인간의 부 신 셀 라인 (NCI H295, NCI-H295R, SW13, 등)이 있다. 그러나,이 선의 스테로이드 생산 여전히 혈 청 로트 번호, 통로 번호, 돌연변이/손실 고유 유전자 등의 수많은 요인에 의해 좌우 됩니다. 17α-hydroxylase 부족, 제외한 쥐 adrenocortical 셀의 기본 문화 부 신 생리학을 공부 하는 더 편리 하 고 더 나은 기술 이다. 요약 하자면, 기본 쥐 부 신 문화 연구자 조사 부 신 시스템에 대 한 관심의 시 약의 메커니즘에 대 한 좋은 생체 외에서 플랫폼 수 있습니다.
Introduction
내 분 비 시스템은 생리 활동 및 항상성1규제에 대 한 책임. 두개골의 장 대는 신장에 있는 부 신 땀 샘 분 비 mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 그리고 안 드로 겐2,3주요 내 분 비 장기 중 하나입니다. 부 신 동맥의 2 개의 명백한 부품이 있다: 피 질 하 고 모 수. 부 신 피 질은 3 개의 층으로 이루어져: 외부 glomerulosa, 중간 fasciculata 및 내부 reticularis3. Zona glomerulosa 호르몬, reabsorbing 나트륨 이온과 신장3물에서 에이즈는 mineralocorticoid의 원래 은닉 사이트입니다. Zona fasciculata 주로 정상적인 생리 적인 조건3스테로이드 제제의 기초 수준을 생성합니다. 설치류에서 코르 티 코 스테로이드 및 인 간에 있는 코 티 솔 통제 혈액 포도 당3스트레스 대처에 시체를 돕기 위해 행동. 어느 정도까지, 그들은 선 동적인 응답을 억제 하 고 면역 시스템4,5조절 수 있습니다. 다른 포유류, 쥐 및 쥐와 달리 필요가 없습니다 기능 zona reticularis 17α-hydroxylase 식의 부족으로 인해 부 신6,7. 따라서, 쥐 및 쥐에서 adrenals 없는 부 신 C-19 스테로이드 (코 티 솔 그리고 부 신 안 드로 겐)의 분 비는.
기본 교양된 adrenocortical 셀 부 신 생리학8제어 메커니즘을 조사 하는 데 유용 해야 표시 되었습니다. Steroidogenic 다른 조직 처럼 각 부 신 존 무료 콜레스테롤9에서 스테로이드 합성. Adrenocorticotropic 호르몬 (ACTH) 자극, 무료 콜레스테롤 고장 지질 작은 물방울에서 출시 고, 따라서, fasciculata 및 reticularis10스테로이드 생산을 향상 시킵니다.
많은 그룹은 adrenocortical carcinomas에서 안정적인 셀 라인을 설정 하려고 했습니다. 그러나, 몇 가지 우려 체 외 모델8에서 adrenocortical 셀 라인의 사용을 제한 했다. 세포의 스테로이드 응답 구절, 혈 청의 많은 수와 혈 청, 등의 품질 간에 달라질 수 있습니다. 또한, 상업 부 신 셀 라인 (y 1과 SW13) corticosterone, 부 신 steroidogenesis8공부 하기 더 어렵게 만드는 분 비 하지 않습니다. 사용 소 및 말 adrenals ex vivo 모델 좋은 선택이 될 수 있습니다 비록 조직이이 시장에서 몇 가지 알 수 없는 위험 모호한 수 있습니다. 그들에 비해, 쥐 아드레날린 관리 쉽게 이며 소스는 상대적으로 더 안정 되 고 병원 체-무료. 함께 찍은, 여기 설명 하는 현재 방법은 corticosterone 합성 쥐 부 신 fasciculata 세포에서의 관련된 메커니즘을 조사 하 사용 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 가오슝 의학 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 실험 절차
- CO2 안락사에 의해 성인 (8 12 주 오래 된) 여성/남성 SD 쥐를 희생.
- 70% 에탄올을 적용 하 고, 피부에 흡수 되 고는 티슈로 피부를 닦아 보자.
- 부정사 위치에 깨끗 한 플라스틱 접시에 쥐를 넣어.
- "외부" 곡선된 겸 자는 중간에와 피부를 들어올리고 (subcostal 각도에 허벅지의 수준)에서 "Y" 모양 만들어 둔 해 부를 수행 합니다.
- 70% 에탄올과가 위를 헹 구 고, 다음, "Y" 모양 만드는 근육을 잘라.
-
위장 뒤에 왼쪽된 부 신 샘을 찾아.
참고: 오른쪽 신장 간 뒤에 깊이 찾을 수 있습니다.- 한 쌍의 집게를 사용 하 여 위 또는 간 고와 다른 곡선된 겸 자는 adrenals 분리.
- 메 마른 그릇에 아드레날린 후, 조심 스럽게 잘 집게와 부 신 캡슐 제거.
- 가 위는 섬세 한 쌍, 작은 작은 조각으로는 adrenals 잘라 혈 청 무료 Dulbecco의 비트의이 글의 중간 (DMEM)을 수정 / F-12 매체.
-
3 다른 기 공 크기의 파스퇴르 pipets를 준비 하 고 첫 번째 파스퇴르 피펫으로 콜라 II (~0.5–0.8 mg/mL)와 매체를 포함 하는 50 mL 원뿔 관으로 모든 부 신 조각 발음을 사용 하 여.
- 부드럽게 triturate 조직 조각 약 10 배. pipets의 나머지를 사용 하 고 모든 조각을 더 작게 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.
참고: 파스퇴르 pipets의 다른 기 공 크기는 그들을 불으로가 열 하 여 만들 수 있습니다. 첫 번째 피펫으로 원래 크기 (약 1 m m), 두 번째의 기 공 크기는 약 0.8 m m 이며 세 번째 파스퇴르 피펫으로 약 0.5 m m 이다. 소화, 하는 동안 부 신 조각 작은 될 것입니다. 따라서, 기계적 절차를 통해는 adrenals 수 수 소화 더 많은 완료. (37 ° C)에서 물 욕조에 튜브를 품 어 및 5 분 마다 흔들어 총에서 4 배.
- 부드럽게 triturate 조직 조각 약 10 배. pipets의 나머지를 사용 하 고 모든 조각을 더 작게 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.
- 20 분 부 화 후 (겹 볼륨; 예를 들어 조직의 5 mL + 멋진 DMEM/F-12 매체의 25 mL) 신선 하 고 차가운 매체 포함 2.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 5% 말 혈 청 효소 효과 중지를 추가 합니다.
- 10 분 동안 800 x g 에서 원심 분리에 의해 셀 알 약을 수집 합니다.
- 셀을 일시 중단 하는 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
참고: 각 선 약 3 ~ 10 배를 만들 수 있습니다5 ~ 105 셀 x 4. - 성장 매체와 함께 원하는 격판덮개 또는 접시에 셀 접시 (DMEM 그리고 햄의 F-12 매체의 1:1 [v/v] 혼합 25 mM HEPES 및 1% 페니실린과 스 보충) 95% 공기와 5% CO2의 습도 환경에서 37 ° C에서 하룻밤 (0 일).
참고: 일반적으로, 우리 접시 24-잘 접시 (4 개의 샘/접시)에 셀 corticosterone 분석 결과 대 한 고 35에서 m m 요리 (요리 한 선/약 1 ~ 2) 서쪽 오 점 분석. - 신중 하 게 씻어 2 셀 세럼 무료 따뜻한 DMEM/F-12 매체 (주 1)와 x. 새로운 성장 매체를 교체 합니다.
- 3 일까지 95% 공기와 5% CO2 의 습도 환경에서 37 ° C에서 세포를 유지 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 기본 교양된 부 신 세포 단계 대조 현미경 (그림 1A) 구별 될 수 있습니다. 더 확인 하려면 소포 세포질 내의 지질 작은 물방울은, 지방 분화 관련 단백질 (ADRP)의 면역 형광 염색 3 일 문화 (그림 1B)에 실시 수 있습니다. 세포는 유리 coverslips에 성장 했다. 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 세 번 세척 하 고 4 %paraformaldehyde 고정 했다. PBS로 3 회 세척, 후 셀 차단 하 고 permeabilized 0.1%와 5% 탈지 우유에 트라이 톤 X-100. 기본 ADRP 항 체 5% 탈지 우유에 희석된 (1:50) 고 밤새 껏 알을 품는. 후 세 번의 PBS 세척, 셀 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 2 차 항 체 (1: 100)와 incubated 했다. 세척 단계를 반복, 후 셀 골드 Antifade 연장 설치 매체와 함께 장착 했다 고 형광 현미경 검사 했다. 또한, 쥐 부 신 세포의 호르몬 생산 능력 corticosterone 분석 결과 의해 결정 될 수 있습니다. 쥐 부 신 셀에 ACTH의 자극 긍정적인 컨트롤 (그림 1C) 될 수 있습니다. 수집 된 미디어 희석 되었고 첸 외.11에 의해 설명 된 절차에 따라 corticosterone 콘텐츠에 대 한 분석.
그림 1: 부 신 세포와 ACTH 치료 corticosterone 응답 특성. (A) 3 일 기본 교양된 쥐 부 신 셀의 위상-대조 그림. (B) ADRP 얼룩이 표시 됩니다. (C)-3 일 교양된 쥐 부 신 세포 치료 했다 ACTH와 함께 (오후 1 1 nM) 6 h에 대 한. 미디어 수집 하 고 사용까지-80 ° C 냉장고에 저장 했다. Corticosterone 레벨 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 측정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
아드레날린은 환경 적응3에서 핵심 역할을 한다. 부 신 피 질에서 분 비는 호르몬 조절 하 고 생리 기능 및 항상성3조정 수 있습니다. Vivo에서 모델 본문에 진짜 생리 적 효과 반영 한다. 그러나, 그것은 여전히 실험에서 불안정 한 효과 일으키는 많은 복잡 한 요인에 의해 좌우 된다. 대조적으로, 생체 외 세포 모델 때문에 동물 모델에 비교할 수 없는 이점이 있다. 첫째, 환경 조건이 생체 외에서 시스템에서 제어 하기 쉬운입니다. 호르몬은 어떤 자극에 의해 영향을 받을 것. 생체 조건 실험 동물 조 난 하는 경향이 있기 때문에 일반적인 반응에 이내 결과입니다. 둘째, 물질은 본문에 모니터링 하기 쉽지 않다 하지만 경작된 시스템에 책임 있다. 셋째, 생체 외에서 시스템 각 독립적인 실험 사이 차이 줄일 수 있습니다. 많은 과학적 보고서 표시 프로토콜 여기에 제시 된 반면 10%-20% FBS12,13,,1415를 포함 하는 adrenocortical 세포의 배양 5 %FBS 2.5% 말 혈 청을 사용 하 여 유지 하는 최대 1 주일까지 부 신 세포의 성장.
Steroidogenesis는 시 토 크롬 P450 측면 사슬 분열 효소에 의해 무료 콜레스테롤의 분열에서 시작 됩니다. 그림 1AB에서와 같이 부 신 셀 수많은 전시 하 고 그것을 제안 하는 지질 작은 물방울의 크기가 다른 스테로이드 생 합성 및 지질 생물학의 수사를 위한 좋은 도구입니다 (fasciculata 세포가 유명 하 고 큰 지질 작은 물방울)1,3. ADRP, 일컬어 perilipin 2, 지질 방울16내 중성 지질 저장에 지질 작은 물방울 표면 단백질 이다. 지질는 ADRP (또는 다른 지질 작은 물방울 표면 단백질, perilipin 같은)의 금액을 전시 하는 adrenocortical 세포 때문 호르몬 합성16테스트 에이전트에 영향을 주는지 여부를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다.
성장과 부 신 땀 샘의 기능 단단히 hypothalamic corticotropic 방출 호르몬과 뇌 하 수 체 ACTH, neuropeptides, 신경 전달 물질, 및 성장 요인, 등17에 의해 제어 됩니다. 그림 1C corticosterone 생산 크게 ACTH 농도 의존 방식에서 처리에 의해 유도 되었다 보여준다. 또한, 1 오후에서 ACTH 및 1 nM 자극 corticosterone 생산 약 30-그리고 70-fold, 각각. 그것은 3 일 교양된 기본 부 신 셀 ACTH 자극15에 더 나은 응답을 전시 입증 되었습니다. 이것은 또한 이유 왜 3 일 문화 현재 연구에 사용 되었다입니다. 또한, ELISA 키트에 의해 corticosterone의 측정 연구에 대 한 간단 하 고 쉬운 도구 이기도합니다. 따라서, 기본 교양된 쥐 부 신 셀 뿐만 아니라 부 신 steroidogenesis 공부에 대 한 플랫폼을 제공 하지만 염증 관련 된 질병의 수사에도 적용할 수 있습니다.
현재 프로토콜에서 중요 한 단계는는 adrenals의 소화 및 오염 제어 합니다. 따라서 소화 시간, 실제 흡입 힘, 및 조직 소화 레벨의 관찰의 제어는 세포 생존에 매우 중요 하다. 또한, 피부를 절단 하 고는 adrenals 분리의 방법 또한 중요 하다. 동물 모피에 의해 어떤 오염을 방지 하기 위해 70% 에탄올에 모든 악기는 항상 젖어. 더 많은 세포를 얻기 위하여 흡입 주파수 해야 제어할 수 10 배 미만 각 흡입 중. 또한, 직물의 조건이 좋은 경우 추가 단계, 콜라 포함에 인큐베이션 매체 30 분 이상 하지 않아야.
쥐의 아드레날린 작기 때문에, glomerulosa 레이어는 부 신 캡슐의 필 링 동안 손실 될 수 있습니다. 그것은 결합 조직 캡슐과 전체 zona glomerulosa18의 제거 귀착되 었 다 그 decapsulation 입증 되었습니다. 남자 쥐의 아드레날린 여성 쥐 보다 작은 수 있습니다. 또한, 지질 방울 11 주 된 여성 또는 남성 쥐6에 더 큰 것으로 나타납니다. 사용 가능한 셀에 관한 여성 쥐 실험에 적합 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 과학 위원회 대만 (NSC102-2320-B-037-008-MY3)와 국립 쳉 쿵 대학 병원 연구 부여 (NCKUH-10102045)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
